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Espectrofotometria 
Espectrofotometria 
• Método de análise baseado em medidas de absorção de radiação 
eletromagnética. 
 
Comprimento de onda corresponde a luz visível ou ultra-violeta 
 
Identificação de compostos orgânicos, inorgânicos e íons 
 
Análise quantitativa de alguns grupos funcionais orgânicos, 
inorgânicos e biológicos. 
 FUNDAMENTAÇÃO 
- Leitura dos valores de absorbância de soluções 
padrões de concentrações conhecidas 
- Curva padrão 
- Determinação da concentração de uma 
determinada substância presente na amostra 
 
 VANTAGENS 
- Método analítico sensível 
- Rápido 
- Resultados precisos 
 
Fontes Luminosas 
• Luz UV Luz Visível : 400 e 800 nm 
• Lâmpada de deutério -hidrogênio Tungstênio 
 
 
 
faixa de 200 a 400 nm 
RADIAÇÃO ELETROMAGNÉTICA 
•Comprimento de onda (λ) 
•Período (p) = tempo 
necessário para completar 
um ciclo 
•Freqüência (f) = ciclos/s ou 
Hertz 
 
 f= c/ λ 
 c = velocidade da luz no vácuo 
3.1010 cm/s 
 
 
Λ unidades 
nm = 10-9 m 
A= 10 -10 m 
Energia (E) 
E = h.f => E = h.c/λ 
h= constante de Planck 
Luz UV e Visível 
• A absorção na região da luz depende da estrutura 
eletrônica da molécula. 
 
• Produz modificações da energia eletrônica da 
molécula em consequência de transições dos 
elétrons de valência. 
 
• Estas transições fazem com que o elétrons excitado 
passe do orbital molecular ocupado para o primeiro 
orbital de energia superior. 
Dois requerimentos devem ser observados para que uma 
determinada radiação possa ser absorvida por uma 
molécula: 
 
1 - A radiação incidente deve ser de frequência 
equivalente aquela rotacional ou vibracional, eletrônica ou 
nuclear da molécula, 
 
2 - A molécula deve ter um dipolo permanente ou um 
dipolo induzido, ou seja, deve haver algum trabalho que a 
energia absorvida possa fazer. 
 
 
Interação da radiação com a amostra 
Aplicações da espectroscopia 
Rotação 
 
Absorção de Radiação 
DNA e RNA = 260nm 
Proteínas = 280nm 
Células bacterianas= 600nm 
Principio do UV-VIS – transição eletronica 
Absorção de Radiação 
• Fenômenos que podem ocorrer com a 
radiação luminosa: reflexão, refração, 
espalhamento ou ser absorvida pelo material. 
 
 
Transmitância 
• Transmitância é a fração da luz incidente em 
um comprimento de onda específico, que 
passa por uma amostra de matéria. 
 
 T = I / I0 
 
Absorbância 
• É a capacidade do material em absorver 
radiações em frequência específica. 
 
 A = - log10 T 
T = I / I0 
 
onde 
• É preciso determinar a quantidade de luz que a amostra irá 
absorver, sendo descrito pela Lei de Lambert-Beer que é a 
relação entre a intensidade da luz incidida na solução (I0) e a 
intensidade da luz saindo da solução (I). 
 
 
-log (I/Io) = A = .b.c 
 
A = absorbância 
 = absorvidade molecular – L.g-1.cm-1 
c = concentração do material absorvedor – mol.L-1 
b = caminho ótico - espessura da amostra através da qual a luz 
passa - 1cm medida da cubeta 
 
Lei de Lambert-Beer 
Lei de Lambert-Beer 
• Intensidades da radiação incidente e 
emergente podem ser relacionadas com as 
concentrações do material presente na 
solução. 
 
– Efeitos de reflexão, refração e espalhamento não 
são considerados nessa lei. 
– A radiação incidente deve ser monocromática 
Lei de Beer-Lambert 
 - Lambert estudou a transmissão da luz por sólidos 
homogêneos. 
 - Beer estendeu o trabalho de Lambert ao estudo de 
soluções. 
 
 Através dessa lei: 
 
 intensidade da radiação incidente e emergente podem 
ser relacionadas com as concentrações do material presente 
na amostra. 
Lei de Beer-Lambert 
 Considerações: 
 
 São consideradas desprezíveis os efeitos de 
reflexão, difusão e fluorescência. 
 
 Radiação incidente deve ser monocromática 
conter somente um comprimento de onda. 
 
 
Leis de absorção 
Io 
I1 
Io = 100 
I1 = 50 
I0 = intensidade da radiação incidente 
I = intensidade transmitida pela amostra 
Representação gráfica da Lei de Beer, para soluções de KMnO4 em l = 545 nm e 
um caminho óptico de 1 cm. 
 
 
Espectro de absorção do permanganato de potássio 
A amostra (1) tem 66mg/L de concentração. 
 
As demais (2),(3),(4) e (5) foram diluídas para (0.8), (0.6), (0.4) e (0.2) da 
concentração da primeira amostra, respectivamente. 
Desvios da Lei de Beer-Lambert 
• Desvios Químicos: 
•  Deslocamento do equilíbrio: quando uma amostra 
se dissocia, associa ou reage com um solvente para 
formar um produto que tem espectro de absorção 
diferente da amostra. 
 
•  Dissociação de complexos: excesso ou 
insuficiência de agente complexante. 
 
Desvios da Lei de Beer-Lambert 
• Desvios Instrumentais: em soluções muito 
concentradas, as moléculas do soluto influenciam 
umas às outras devido às suas proximidades, pois 
quando ficam muito perto umas das outras, a 
absortividade pode mudar um pouco. 
 
 A iluminação não é monocromática, isto é, de um 
único comprimento de onda 
 
 O sinal do detector não é linear nem proporcional a 
concentração da solução 
Análise Qualitativa 
• A identificação do composto é feita através da comparação 
com padrões do valor do comprimento de onda 
 
• O solvente escolhido deve ser transparente na região 
escolhida (máximos de absorção afetadas pela natureza do 
solvente) 
Análise Quantitativa 
• Quantidade do composto medida pelo valor de absorbância 
máxima (topo de um pico de absorção) 
 
Razões: 
a) A variação na absorvância para uma dada mudança de 
concentração será maior, resultando em sensibilidade e 
precisão maiores 
b) O efeito relativo de outras impurezas é minimizado 
c) A mudança da absorvância com o comprimento de onda é 
menor devido ao espectro de absorção médio ser 
relativamente plano no topo do pico. Logo a medida não é 
seriamente afetada por pequenos erros de ajuste do 
comprimento de onda. 
Análise Quantitativa 
• Quantidade do composto medida pelo valor de absorvância 
máxima (topo de um pico de absorção) 
 
Conclusão; 
 
 A escolha do comprimento de onda (λ) máximo deve ser onde 
haja máxima absorvância (A) e, consequentemente, mínima 
transmitância (T) 
Cálculos da Concentração (C), Utilizando a Lei de Beer 
• A) Com valor de absortividade (a) da amostra conhecido: 
 
 Usar a Lei de Beer-Lambert: 
 
 A= abc, e tirar o valor de c 
 
A = absorvância 
a = absortividade molecular ou coeficiente de extinção 
c = concentração do material absorvedor 
b = espessura da amostra através da qual a luz passa (largura da 
cubeta) 
 
• Com o valor de absortividade (a) da amostra desconhecido: 
 
 - Fazer a curva padrão 
 - Leva-se o valor da máxima absorvância da amostra para 
uma curva padrão construída com concentrações diferentes e 
tira-se a concentração do composto analisado. 
 - Importante verificar a linearidade da resposta em relação à 
curva padrão pois, acima de uma certa concentração , a 
relação AxC deixa de ser linear (o gráfico é uma reta) 
 
Cálculos da Concentração (C), Utilizando a Lei de Beer 
Espectrofotômetro 
• É um instrumento que serve para medir a intensidade da luz 
em função de um comprimento de onda específico . 
• Registra dados de absorbância em função do comprimento de 
onda (λ). 
• A característica mais importante do espectrofotômetro é a 
seleção de radiações monocromáticas. 
• O espectro de absorção é característico para cada espécie 
química,sendo possível a identificação de uma espécie 
química através do seu espectro de absorção. 
 
 
 
Esquema dos principais componentes de um 
espectrofotômetro 
• A amostra deve estar em um recipiente (cubeta) de quartzo 
quando a radiação for na região espectral do ultravioleta. 
 
• Quando for na região da luz visível usa-se os de vidro por ter 
uma melhor dispersão. 
 
• Os detectores devem ser altamente sensíveis. 
• Os dados obtidos pelo detector são enviados para um 
dispositivo de processamento de dados. 
Fontes de Radiação 
• As fontes mais comuns baseiam-se na 
incandescência, mas devem atuar em temperaturas 
elevadas para ter uma cobertura apreciável no 
ultravioleta. 
• São constituídas por filamentos de materiais que são 
excitados por descargas elétricas com elevada 
voltagem ou aquecimento elétrico. 
• Tipos: 
 Lâmpada com descarga de hidrogênio: utilizada 
na região UV 
 Lâmpada de tungstênio: utilizada na região 
visível 
 
Fontes de Radiação 
• Condições para uma fonte ser de boa qualidade para 
atuar nessa faixa: 
  gerar radiação contínua; 
  ter intensidade de potência radiante suficiente para 
permitir a sua detecção pelo sistema detector; 
  ser estável. 
 
• Além disso deve ter um tempo de vida longo e preço 
baixo. 
Monocromadores 
• Função: seleção do comprimento de onda em que se tem interesse para a 
análise. 
• Constituição: 
  fenda de entrada de um elemento de dispersão de radiação 
  fenda de saída 
• Tipos: 
  prismático 
  reticuladores 
Monocromador Prismático 
• A radiação policromática vinda da fonte de radiação 
passa pela fenda de entrada e incide sobre a face de 
um prisma, sofrendo um desvio. 
 
• Os vários comprimentos de onda terão diferentes 
direções após a incidência no prisma. Se for realizado 
um ajuste rigorosamente controlado da fenda de 
saída, pode-se selecionar o comprimento de onda 
desejado. 
Monocromador Prismático 
Monocromador Reticular 
• O principal elemento dispersante é a rede de difração. Essa 
rede consiste em uma placa transparente ou refletora com 
muitas ranhuras paralelas e equidistantes. 
 
• Dispersão resultante desta rede é linear. Os vários 
comprimentos de onda dispersos são igualmente espaçados, 
por isso a fenda de saída isolará uma banda de radiação de 
largura constante. 
 
• A resolução é muito mais elevado que os prismas. 
 
 
Monocromador Reticular 
Tipos de Espectrofotômetros para a 
Região Visível e Ultravioleta 
 
• Espectrofotômetro mono-feixe : 
 
 
 
Fonte de 
radiação 
Selecionar 
único  
Fotocélulas que detectam a quantidade de radiação transmitida após a passagem pela amostra, porém o 
resultado pode ser convertido em quantidade de radiação absorvida pela amostra. 
 
Amplificador -Fóton da radiação passa pelo amplificador e é registrado com maior número de elétrons 
 
Registrador transforma o sinal elétrico que chega ao detector e amplificador em energia mecânica 
fazendo o registrador mover-se 
 
• Espectrofotômetros mono-feixe: 
 
1º) Coloca-se o solvente (branco) no caminho ótico e mede-se a 
intensidade da energia radiante,que atinge o detector; 
 
 2º) Substitui-se o recipiente com o solvente (branco) pelo 
recipiente com a amostra e faz- se a determinação 
propriamente dita da absorbância. 
 
- Não são cômodos pois a amostra e o branco tem que ser 
colocados alternadamente no único feixe de radiação; 
 
 - mais simples e baratos 
 
 - não registra espectro 
 
Espectrofotômetro duplo-feixe 
• Dois feixes de radiação são formados no espaço, por um espelho que 
divide o feixe vindo do monocromador em dois. Um feixe passa através da 
solução referencia (branco) até o transdutor e outro, ao mesmo tempo, 
passa através da amostra até o segundo transdutor. 
• As duas correntes serão determinadas e mostradas no indicador de sinal. 
Com o auxílio de um dispositivo apropriado, calcula-se a diferença de 
transmitância entre os dois feixes, essa diferença será mostrada no 
indicador de sinal como absorvância 
 
 REGISTRA APENAS O ESPECTRO DA AMOSTRA 
 
Espectrofotômetro duplo-feixe 
Espectrofotômetro duplo-feixe 
Tipos de Solvente 
 
 Região visível: 
 qualquer líquido que não tenha cor, e o mais 
usado é água estilada. 
 
 Região UV: 
 qualquer solvente que não absorva nesta região, 
que não tenha duplas ligações conjugadas, como, 
por exemplo, a água ou hidrocarbonetos saturados. 
 
 
 
• Etapas: 
 
 1º) Coloca-se o solvente (branco) no caminho ótico e mede-se 
a intensidade da energia radiante,que atinge o detector; 
 
 2º) Substitui-se o recipiente com o solvente (branco) pelo 
recipiente com a amostra e faz- se a determinação 
propriamente dita da absorbância. 
 
 
 
 
 
Procedimento 
Cubetas 
• Espectrofotometria de Luz Visível 
– Cubeta de Vidro ou Plástico 
 
• Espectrofotometria de Luz Ultra- Violeta 
– Cubeta de Quartzo - não pode ser de vidro, porque ele 
absorve radiação nesta região 
 
 
 
(a) lâmpada de deutério/tungstênio; (b) lente da fonte; (c) obturador; (d) amostra; 
(e) lente espectrográfica; (f) fenda; (g) rede de difração; (h) arranjo de detectores 
Diagrama de um espectrofotômetro 
Esquema óptico de um espectrofotômetro com detector de arranjo de diodos 
Há duas fontes de radiação, as lâmpadas de deutério e de tungstênio, cujas emissões são focalizadas através de 
uma lente sobre a amostra. 
 
A radiação incidente será, em parte, absorvida. Esta radiação que atravessou a amostra (transmitida ou 
emergente) irá incidir sobre uma lente que focaliza o feixe sobre uma fenda, e desta sobre uma grade de 
difração. 
 
Esta grade irá difratar a radiação, separando os seus diferentes comprimentos de onda, sendo que cada um 
deles irá incidir sobre um diodo do arranjo. Este diodo, ao ser irradiado, produz uma corrente elétrica cuja 
magnitude depende da intensidade da emissão (novamente aqui se aplica o efeito fotoelétrico). 
 
 Através de um circuito de calibração adequado, esta corrente será transformada em absorbância nos diferentes 
comprimentos de onda, resultando no que se convenciona chamar de espectro de absorção. 
Exemplos de Fontes de Exemplos de 
Fontes de Radiação 
• Lâmpada de filamento de tungstênio; 
• Lâmpada de quartzo-iodo; 
• Lâmpada de descarga de hidrogênio ou de 
deutério; 
• Lâmpada de cátodo oco 
• Laser 
 
* Normalmente usa-se a lâmpada de deutério para 
comprimentos de onda entre 180 a 370nm. 
Procedimentos Analíticos em 
Espectrofotometria Visível em 
Ultravioleta 
• Análise Qualitativa: dependendo de quanto de 
luz que a amostra absorver vai determinar 
qual é a espécie, pois o espectro é 
característico daquela determinada espécie 
química. 
Procedimentos Analíticos em 
Espectrofotometria Visível em Ultravioleta 
• Análise Quantitativa: dependendo da absorbância irá 
determinar a concentração da amostra. 
 
• A condição especial para qualquer determinação 
quantitativa é a observação à Lei de Beer-Lambert, 
mas o controle do pH, as técnicas de extração por 
solventes, o ajuste do estado de oxidação, entre 
outras também são muito importantes.