Espectroscopia UV VIS 2

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ESPECTROMETRIA DE ABSORÇÃO 
MOLECULAR NO UV/VISÍVEL 
Princípios de Química Analítica 
Profa. Valéria Bellotto 
Espectrometria de Absorção no UV/visível 
Parte 2 
Instrumentação 
 Células - cubetas 
 Fontes contínuas 
 Seletores de comprimento de onda 
 Esquemas de espectrofotômetros 
Aplicações qualitativas 
Aplicações quantitativas 
Titulações espectrofotométricas 
Display 
Ajuste de 
 Zero 
Ajuste de 
100 % 
Seleção 
de  
Compartimento 
da cubeta 
Espectrofotômetro 
Fonte de Radiação 
Espelho colimador 
Monocromador de rede 
Detector 
Cela de amostra 
Espectrofotômetro 
Fontes de radiação para região UV-VIS 
• Fontes contínuas: fornecem uma ampla 
distribuição de comprimentos de onda dentro de 
uma faixa espectral em particular. 
• Feixe de radiação suficientemente potente e 
estável por longo período de tempo 
Fontes contínuas para região ultravioleta/visível 
Espectroscopia de absorção UV-vis 
Seletores de comprimento de onda 
• Fornecer banda estreita de comprimento de onda 
▫ Filtros (filtros de interferência e de absorção) – pouco usados 
atualmente 
▫ Monocromadores (prisma e rede) 
 
Largura da banda efetiva: faixa de 
comprimento de onda selecionada por um 
monocromador 
- medida inversa da qualidade do 
monocromador – quanto mais estreita 
melhor o desempenho. 
- Instrumentos caros 20 nm 
 
Bruno Natividade
Highlight
Seletores de comprimento de onda 
• Monocromador de prisma 
- Dispersa radiação UV, VIS e IV 
- Refração da radiação nas duas faces resulta em dispersão angular da radiação 
(não linear com o plano focal) 
-  mais curtos são dispersados em maior do que os mais longos – complexidade na 
instrumentação (mais caro e obsoleto) 
Seletores de comprimento de onda 
• Monocromadores de rede 
• Rede de difração: componente óptico que opera por 
reflexão ou transmissão de radiação 
 Espelhos 
côncavos 
Fenda de 
entrada 
Rede de 
difração de 
reflexão 
Fenda 
de saída 
Plano 
Focal 
Monocromadores de rede 
• Exemplo de difração de radiação – ranhuras em 
CD (1,6 m) 
𝑛𝜆 = 𝑑 𝑠𝑒𝑛𝜃 + 𝑠𝑒𝑛𝜙 
 Monocromador 
Controle manual da 
grade de difração Ajuste da fenda 
Controle 
Manual da 
Grade de 
Difração 
Ajuste 
 da 
Fenda 
E
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p
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E
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a
 
Compartimento de amostras 
• Material não deve absorver radiação 
Cubetas de plástico também podem ser utilizadas na região do visível. 
Bruno Natividade
Highlight
Compartimento de amostras 
A limpeza completa das cubetas antes e depois do uso é fundamental. 
 Impressões digitais, gordura ou outros depósitos nas paredes alteram as 
características de transmissão da cubeta. 
 Não devem ser secas nem em estufa nem em chama para não alterar o caminho 
óptico ou outros danos físicos. 
 Cubetas de plástico e poliacrilatos são solúveis em solventes fortemente apolares! 
Detectores/Transdutores 
Tipos de Instrumentos 
• fotômetros: filtro (ou fonte radiação monocromática) 
 
• espectrofotômetros: monocromador (manual ou 
automático) 
 
▫ feixe simples: amostra e referência são alternadas 
▫ feixe duplo: compensa variações da fonte e detector (mais 
complexo) 
 
• multicanal (com arranjo de diodos): 
 - monocromador fixo 
 - detecção simultânea 
 - eletronicamente mais complexo 
 - radiação policromática é incidida na amostra 
 (mínima fotodecomposição - medida rápida) 
Bruno Natividade
Highlight
Bruno Natividade
Highlight
Esquemas de espectrofotômetros UV/visível 
Feixe único 
Feixe duplo 
Espectroscopia de absorção UV-vis 
• Requer fonte estabilizada de tensão e são mais suscetíveis a 
variações de sinal; 
• Requer calibrações mais frequentes; 
• Variam em complexidade 
▫ Uso de conjunto de filtros de vidro ou monocromador de rede 
▫ Tubos de ensaio ou células de sílica como porta amostras 
▫ Célula fotovoltaica ou TFM 
FEIXE ÚNICO 
Espectrofotômetro: instrumento de feixe único 
Fonte: http://www.chem.agilent.com/Library/brochures/si-0137.pdf 
Espectrofotômetros: Instrumento de feixe duplo 
• Feixes separados no espaço 
Requer fonte estabilizada de tensão; 
 Possui sinal mais estável e menos susceptível a variações; 
 Célula (cubeta) de amostra e referência são lidas “simultaneamente” 
Instrumentos manuais – ajuste do zero com obturador 
Fonte: SKOOG, D. A. et al., Fundamentos de Química Analítica . 8ª Ed. São Paulo, Thomson, 2006. 
Espectrofotômetros: Instrumento de feixe duplo-feixe 
separado no espaço 
Cary 4000, 5000 and 6000i Spectrophotometers. http://www.chem.agilent.com/Library/brochures/1942.pdf 
Espectrofotômetros: instrumento multicanais 
• Sistemas não tem peças móveis – maior reprodutibilidade 
• Uma única varredura de 200 a 820 nm requer somente 0,1s 
• Minimiza fotodecomposição da amostra 
• Fenda do monocromador idêntica à largura dos diodos - a saída de cada 
diodo corresponde à radiação de 1  diferente – espectro de varredura 
 
Lâmpada de 
Tungstênio 
Lâmpada de 
deutério 
Lentes 
Lentes 
Cubet
a 
Obturador 
Fenda 
fixa Grade de 
difração 
Arranjo de 
1024 
fotodiodos 
Fonte: SKOOG, D. A. et al., Fundamentos de Química Analítica . 8ª Ed. São Paulo, Thomson, 2006. 
Aplicações da Espectrofotometria UV-VIS 
• Poucas aplicações em análise qualitativa 
• Análises quantitativas: 
▫ Ampla aplicação a sistemas orgânicos e 
inorgânicos (absorventes e não-absorventes) 
▫ Limite de detecção 10-4 -10-5 mol/L 
▫ Seletividade moderada a alta 
▫ Boa exatidão e precisão (1-3%) 
▫ Instrumentação e aquisição de dados 
relativamente simples 
▫ Técnica mais usada no campo da saúde (análises 
clínicas) 
Aplicações qualitativas 
As medidas espectrométricas com a com a radiação ultravioleta 
são úteis para detectar grupos cromóforos. 
Porém, não permitem uma identificação inequívoca do analito. 
 
Os dados qualitativos no ultravioleta devem ser 
complementados por outras evidências: 
 - químicas como espectros infravermelhos, de ressonância 
magnética nuclear e de massas ou 
- físicas sobre solubilidade, ponto de fusão e ponto de ebulição 
Espectroscopia de absorção UV-vis 
Solventes 
Deve ser transparente na região do espectro no qual o soluto absorve e 
Deve ser capaz de dissolver uma quantidade suficiente de soluto para gerar 
um espectro bem definido 
Espectroscopia de absorção UV-vis 
Efeito da largura da fenda 
Espectros para o citocromo c 
reduzido, obtidos com larguras 
de bandas de: 
(1) 20 nm 
(2) 10 nm 
(3) 5 nm 
(4) 1 nm 
Espectroscopia de absorção UV-vis 
Aplicações quantitativas 
Características importantes dos métodos espectrofotométricos: 
1. Ampla aplicabilidade - espécies absorventes e não absorventes 
2. Alta sensibilidade – LDs na faixa de 10-4 a 10-5 mol/L, podendo ser 
estendida para 10-6 ou até 10-7 mol/L 
3. Boa exatidão – 1% a 5% 
4. Facilidade e conveniência 
Espectroscopia de absorção UV-vis 
Detalhes do Procedimento 
• Seleção de comprimento de onda 
• Verificação de efeitos que influenciam a absorbância 
(solvente, pH, concentração, eletrólitos, partículas, 
interferentes, etc) 
• Limpeza, manuseio e material de cubetas 
• Determinação direta da relação A x c – Lei de Beer 
▫ Calibração externa (absorventes e não absorventes) 
▫ Método de adição de padrão (matriz complexa e 
interferente) 
▫ Análise de misturas 
▫ Espectros derivados 
 
Exemplo de determinação para espécies absorventes. 
 
Determinação de pigmentos clorofilianos (clorofila a , clorofila b e clorofila c ) de 
microalgas. 
Extração com Acetona ,determinação espectrofotométrica (célula de 10 cm) seguida 
de cálculos segundo SCOR/UNESCO 
C (cl-a)= 11,64 A663 – 2,16 A645 + 0,10 A630 
C (cl-b) = 20,97 A645 –3,94 A663 – 3,66 A630 
C (cl-b) = 54,22 A630 – 1814, A645 – 5,53 A663 
As absorbâncias (A) devem ser previamente corrigidas da absorbância da acetona 
amostra 
adição de 
reagente 
branco amostra soluções de referência 
c1 c3 c4 c2 
cx  c2 
desenvolvimento 
da reação (t) 
Análise quantitativa para analito não-absorvente 
Exemplo de aplicação para espécie não absorvente 
Determinação de íons ortofosfato dissolvidos em águas naturais 
Princípio da determinação: os íons fosfatos reagem com o molibdato de 
amônio em meio ácido, formando o complexo fosfomolibdato, que é reduzido 
pelo ácido ascórbico, resultando em um complexo azul, cuja absorbância deve 
ser medida a 885 nm. A redução é catalizada pelo tartaráto de antimônio e 
potássio (Aminot, 1977). 
 
A concentração de ortofosfato na amostra é calculada a partir da equação de uma 
curva de calibração, construída a partir da mesma reação com padrões de 
ortofosfato de concentrações variáveis. 
Espectroscopia de absorção UV-vis 
Procedimento experimental 
• Determinação de Fe em comprimidos com 1,10-
fenantrolina 
 
 
• Soluções de 1 a 10 mg/L Fe3+ 
2Fe3+ + C6H8O6 2Fe2+ + C6H6O6 + 2H+ 
Fe2+ + 3 phen  [Fe(phen)3]
2+ 
N N 
phen = 
Procedimento Experimental 
• Determinação de Fe em comprimidos 
Ax 
cx 2,0 4,0 6,0 8,0 10 
0 
0,2 
0,4 
0,6 
cFe / (mg L-1) 
A 
A = 0,0598 CFe + 0,0003 
Ax = 0,296 
cx = 4,95 mg L-1 
A’ = ’M .b. cM + ’N .b. cN 
 
A’’ = ’’M . b. cM + ’’N .b. cN 
• ’s devem ser conhecidos em 
 todos os comp. onda (’ e ’’) 
• espécies independentes 
 (não existe interação) 
• seleção do  =  grande 
Análise de misturas de espécies absorventes 
No espectro não existe um comprimento de onda no qual a absorbância seja devido 
a apenas um dos componentes 
Em ’ e ”: 
 Utilização da derivada de espectros de 
absorção. 
 Espectros derivados geralmente revelam 
detalhes não observados em espectros de Abs. 
 Em algumas situações minimizam a presença de 
interferências e facilitam determinações nessas 
condições. 
 Degradação na relação sinal-ruído – não 
limitante para muitas medidas 
 Instrumental: método de modulação: 2 feixes 
de comprimentos de onda diferentes em 1 a 2 
nm incidem alternadamente na amostra e no 
transdutor – variável das ordenadas é o  dos 
sinais alternados 
 
 
Espectrofotometria derivativa 
Aplicações da Espectrofotometria UV-VIS 
• Determinação direta – analitos absorventes 
 
• Derivatização química – analitos não 
absorventes 
 
• Acoplamento em técnicas /processos: HPLC, 
sistemas automatizados. 
 
• Titulações espectrofotométricas 
Titulação Espectrofotométrica 
• Analito, titulante ou produto que absorva radiação; 
• Eventualmente pode ser usado um indicador absorvente; 
• Modificação no espectrofotômetro para colocar a cela de 
titulação (cilíndrica); 
• Gráfico de A (corrigida pelas variações de volume) x volume 
do titulante 
• Presença de outras espécies absorventes podem não interferir; 
• O sistema absorvedor deve obedecer a Lei de Beer. 
Titulação Espectrofotométrica 
Fe2+/Cr2O7
2- 
Cu2+/EDTA 
MnO4
-/H2C2O4 
A 
A 
A 
V 
V 
V 
 
 
 
Curva consiste de 2 regiões lineares 
com inclinações diferentes – o ponto 
final é determinado pela interseção das 
porções lineares extrapoladas pela 
curva 
Espectroscopia de absorção UV-vis 
Titulação Espectrofotométrica 
A = analito 
P = produto 
T = titulante 
Titulação Espectrofotométrica 
• Titulação de misturas 
▫ Em 745 nm, não há 
absorção das espécies 
individuais 
▫ Inicia a titulação, todo 
Bi é consumido KfBi > 
KfCu- complexo não 
absorve 
▫ Com a primeira 
formação de complexo 
Cu-EDTA ocorre 
aumento de A até o Cu 
ser consumido 
Bibliografia 
SKOOG, D.A; LEARY, J.J. Principles of Instrumental Analysis. 4 th 
edition. Fort Worth:Saunders College Publishing,1992. 
SKOOG, D.A.; WEST, D.M.; HOLLER, F.J.. Fundamentals of 
Analytical Chemistry. 7 th Edition. Fort Worth:Saunders College 
Publishing., 1996. 
SKOOG, D.A.; WEST, D.M.; HOLLER, F.J.; CROUCH, S.R.. 
Fundamentos de Química Analítica. Tradução da 8ª edição norte-
americana. São Paulo:Thomson Learning., 2006. 
STRICKLAND, J.D.H.; PARSONS, T.R. A Practical Handbook of 
Seawater Analysis. Otawa, Fisheries Research Board of Canada. 1972 
Espectroscopia de absorção UV-vis