Biotecnologia farmacêutica

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Biotecnologia Farmacêutica 
Empirismo: teoria que 
tem como principal noção 
de que o conhecimento 
vem, principalmente, das 
experiencias sensoriais. A 
biotecnologia é para 
melhoramento de algo da 
sociedade 
Insulina recombinante: Echerichia coli é a 
bactéria mais usada para inserir a insulina pela 
facilidade de multiplicação, combino o material 
genético que ela já tem, e adiciono a insulina 
recombinante que sintetizei no laboratório insere 
um gene em uma célula que não tem esse gene. 
Descobriu gene da insulina: já sabe o tamanho 
do gene, a sequência de nucleotídeo etc. 
Preciso de um fragmento de 
DNA que quero, por exemplo 
o que contêm informação 
genética da insulina, mas 
pode ser qualquer outra, 
qualquer fragmento de DNA, 
por exemplo, posso 
adicionar uma enzima que... 
...faz a bactéria começar a degradar 
plástico após ela produzir essa enzima. 
Enzima de restrição: produzida pelas 
bactérias que corta o DNA dos vírus que 
são injetados por eles mesmos dentro 
da bactéria. 
Região palindrômica: uma palavra que 
leio da esquerda para direita e vice-versa 
A enzima de restrição só interage com 
regiões palindrômicas. 
Uma única bactéria pode produzir várias 
enzimas de restrição, que reconhece uma 
região palindrômica. 
Plasmídeo: molécula DNA de fita dupla 
circular dentro da bactéria, nem todas tem. 
1 bactéria pode ter plasmídeos diferentes 
que ela pegou de outras bactérias. 
Bactéria E. coli, fácil de 
cultivar no laboratório, 
barato, fácil manuseio, 
cresce rápido (12min) 
e não é exigente, vive 
no intestino. Para 
alterá-la 
geneticamente, o 
plasmídeo que é... 
...redondo. coloquei 100 plasmídeos e 100 
enzimas de restrição para cortar os 100, mas 
não é certeza. Coloco os DNA que quero que 
o plasmídeo absorva, o que eu espero é que 
os 100 plasmídeos foram costados e 
modificados, contendo o gene de DNA que 
foi colocado – não tenho certeza. 
Coloco esses plasmídeos na E. coli. Qual a maneira de eu saber 
que a bactéria recebeu o plasmídeo¿ Pelo meio de resistência 
dessa bactéria. 
Quem me garante que todo plasmídeo será alterado 
geneticamente¿ 
Galactosidase: enzima que quebra galactose (açúcar). 
Plasmídeo que tem o gene de resistência e que possui a galactosidase você consegue saber quais receberam o gene 
de insulina e qual não 
Células hospedeiras recebem o gene, nesse caso a bactéria, vetor no caso é o plasmídeo que carrega o gene. 
Cosmídeo: mistura de plasmídeo com pedações de material genético do vírus 
 
Biotecnologia Farmacêutica 
Insulina recombinante é 
combinar DNAs, você faz 
uma bactéria produzir o 
que você quer. A insulina, 
proteína do corpo não é 
idêntica do porco, então 
usando ao longo do tempo 
usando pode trazer 
...reação adversa ou alérgica. 
A insulina é uma proteína produzida nas células a 
partir dos ribossomos. Todas as bactérias têm 
cromossomos mas tem todas tem plasmídeo, 
que é uma molécula de DNA circular pequena. 
pBR322 →plasmídeo brasileiro 322 
as bactérias roduzem enzimas de restrição, ela 
corta o material genético estranho de vírus nas... 
...células. 
A enzima de restrição lê 
apenas a região 
pelindrômica. Saber o que é 
desnaturação, colocar no 
plasmídeo em pH ácido vai 
desnaturar e virar 2 fitas 
circulares simples, que... 
...antes eram fitas duplas. Como saber que o gene de resistência deu certo na bacteéria que eu coloquei, depois de 
semear no meio de cultura precisa ser resistência. 
DNA e RNA 
São ácidos nucleicos, formados por nucleotídeos que tem 1 fosfato, 1 pentose 
(açúcar) e 1 base nitrogenada. DNA → açúcar desoxirribose; RNA → açúcar 
ribose. 
Ligação fosfodiéster: os nucleotídeos vão se unir quando a hidroxila na posição 5 
de um nucleotídeo se liga ao grupo fosfato na posição 3 do nucleotídeo. Formando 
cadeia com bases livres para interagir com outras bases. 
BASES: A – adenina; T – timina; C – citosina; G – guanina. 
DNA: apresenta duas cadeias de nucleotídeos, ligadas por bases nitrogenadas. 
Podendo ser púricas (A e G) ou pirimídicas (T e C). Adenina de uma cadeia se liga a 
Timina de outra cadeia por meio de duas ligações. Citosina de uma cadeia se liga 
a Guanina de outra cadeia por meio de três ligações. Essas ligações são pontes de 
hidrogênio. 
Essa fita dupla formada pela ligação de bases nitrogenadas apresenta-se em 
espiral → formato em hélice. 
 
RNA: apresenta fita simples, formada pela união de nucleotídeos. Aqui não tem 
timina, possui uma base especifica → Uracila. Importante para produção de 
proteínas no nosso organismo. 
 
Expressão Gênica: As etapas do processo de síntese das proteínas são reguladas 
pelos genes. Expressão gênica é o nome do processo pelo qual a informação 
contida nos genes (a sequência do DNA) gera produtos gênicos, que são as 
moléculas de RNA (na etapa de transcrição gênica) e as proteínas (na etapa de 
tradução gênica). 
 
Tradução e transcrição: síntese de proteínas. 
Transcrição: produção de uma molécula de RNA a partir do DNA da célula → será 
formado o RNAm que levará a informação genética para a síntese de proteínas. 
Assim que encontra os ribossomos, o RNA sofre a tradução. Nessa primeira fase a 
molécula de DNA se abre, e os códigos presentes no gene são transcritos para a 
molécula de RNA. A enzima polimerase do RNA se liga a uma das extremidades do 
gene, separando as fitas de DNA e os ribonucleotídeos livres se emparelham com 
a fita de DNA que serve de molde. 
 
A sequência das bases nitrogenadas do RNA segue exatamente a sequência de 
bases do DNA, segundo a seguinte regra: 
• U com A (Uracila-RNA e Adenina-DNA), 
• A com T (Adenina-RNA e Timina-DNA), 
• C com G (Citosina-RNA e Guanina-DNA) e 
• G com C (Guanina-RNA e Citosina-DNA). 
O que determina o início e o fim do gene que será transcrito são sequências 
específicas de nucleotídeos, o início é a região promotora do gene e o fim é 
a região terminal. A polimerase do RNA se encaixa na região promotora do gene e 
vai até a região terminal. 
 
Tradução: A cadeia polipeptídica é formada pela união de aminoácidos segundo 
a sequência de nucleotídeos do RNAm. Essa sequência do RNAm, 
denominada códon, é determinada pela sequência de bases da fita do DNA que 
serviu de molde. Desse modo, a síntese de proteínas é a tradução da informação 
contida no gene, por isso se chama tradução gênica. 
 
 
 
 
CLONAGEM DE DNA 
O que é? Cópia idêntica de pedações do DNA que codifica algo de interesse, 
formará uma proteína útil. A maneira de retirar uma parte que contenha genes a 
clonar desejados de uma fita dupla de DNA estirada é com a utilização de enzimas 
de restrição (existem muitas). Elas reconhecem sequências especificas então 
podemos escolher as enzimas certas para cortas os pedaços de DNA que 
desejamos. Assim podemos cortar o gene desejado e retirá-lo da fita dupla de 
DNA. Depois de separado, precisamos colá-lo em um plasmídeo. Plasmídeos 
também possui duplas fitas de DNA. Tudo isso é feito em soluções, adiciona-se a 
dupla fita de DNA que contêm o gene juntamente com as enzimas de restrição 
específicas, que liberam o gene desejado que se emparelha com o plasmídeo. 
Para “fechar” a reação, unir a fita com gene com o plasmídeo, usamos enzimas 
de DNA ligase, que vai unir as cadeias “colando”. 
 
Utilizamos a bactéria Escherichia coli. Imagine um tubo de ensaio com essa 
bactéria, inserindo os plasmídeos na bactéria, ela absorve esses plasmídeos com 
o gene de nosso interesse em solução. Após um choque térmico, sendo de 
temperatura ou de pH (temperatura é de menor custo) elas absorvem o 
plasmídeo. Uma vez que ela já tem o gene, precisamos que se multiplique 
utilizando meio de cultura com nutrientes onde todas irão se proliferar dando 
origens a várias colônias. 
Porém, há bactérias que incorporam o plasmídeos e outras que não, desse 
modo precisamos selecionar as que incorporaram e eliminar as que não 
incorporaram.A solução deste problema é inserir também um gene para 
resistência a um determinado antibiótico. 
 
 
Assim, todas as bactérias que incorporarem o plasmídeo irão carregar também, 
além do gene desejado, um gene de resistência a um antibiótico. Finalmente, 
junto ao meio de cultura adicionamos antibiótico (correspondente). Logo, apenas 
as bactérias que incorporaram o plasmídeo serão capazes de sobreviver. E as que 
não incorporaram irão morrer na presença do antibiótico. 
Dentre todas as proteínas que produzimos, podemos citar a insulina para 
diabéticos. 
 
Região palindrômica: é uma sequência de DNA que pode ser lida da mesma forma 
nos dois sentidos. Ex.: 5’ – GAATTC – 3’ 
 3’ – CTTAAG – 5’ 
 
As enzimas de restrição reconhecem regiões palindrômicas específicas no DNA e 
fazem o corte exatamente ali. 
 
Plasmídeo: molécula DNA de fita dupla circular dentro da bactéria, nem toda tem. 
1 bactéria pode ter plasmídeos diferentes que ela pegou de outras bactéria. 
Bactéria E. coli, fácil de cultivar no laboratório, barato, fácil manuseio, cresce 
rápido (12min) e não é exigente, vive no intestino. Para alterá-la geneticamente. 
 
TERAPIA GÊNICA 
 
A terapia gênica é um procedimento que introduz genes funcionais no interior das 
células com o objetivo de tratar doenças. 
A terapia gênica utiliza técnicas de DNA recombinante para substituir ou 
manipular genes com problemas. A introdução de um gene sadio irá corrigir uma 
informação que está errada ou ausente do DNA de um indivíduo, o que pode levar 
a cura da doença ou alívio dos seus sintomas. 
 
 
 
 
De modo resumido, podemos dizer que a terapia gênica é a troca de genes 
defeituosos por genes sadios. 
 
Como funciona a terapia gênica? 
A técnica da terapia gênica consiste na introdução de um gene sadio no 
organismo, considerado o gene de interesse (gene terapêutico). Este gene 
encontra-se em uma molécula de DNA ou RNA que deverá ser introduzida em um 
organismo. 
Porém, o DNA dificilmente é introduzido diretamente em um organismo. É 
necessário um carregador que transporte o DNA até o seu destino, onde ocorrerá 
a troca de genes. Esse carregador é chamado de vetor. Os vetores podem ser 
plasmídeos ou vírus. 
 
 
Geralmente, o vírus é escolhido para ser o vetor de um determinado gene. Isso 
porque os vírus são, naturalmente, especializados em invadir células e nelas 
introduzir material genético. Entretanto, para ser um vetor, o vírus sofre 
modificações, nas quais são retiradas informações genéticas que possam 
desencadear resposta imune, apenas os seus genes essenciais são mantidos. 
 
 
 
 
 
2. O que é PCR 
PCR significa Reação em Cadeia da Polimerase. 
É uma técnica que faz milhões ou bilhões de cópias de um pedaço específico 
de DNA no laboratório. 
Imagine assim: 
Se você tem uma quantidade minúscula de DNA, a PCR funciona como uma 
fotocopiadora genética. 
Ela amplifica o DNA para conseguirmos estudar. 
 
4. Por que usamos a Taq polimerase 
Na PCR o DNA precisa ser aquecido até 95–98°C.4 
 
 
Problema: 
enzimas normais morrem nessa temperatura. 
Solução: 
cientistas descobriram a bactéria Thermus aquaticus, que vive em fontes termais 
muito quentes. 
A enzima dela é a Taq polimerase, que resiste ao calor. Torna PCR possível. 
 
5. Ciclo da PCR 
A PCR acontece em ciclos de temperatura dentro de um aparelho chamado 
termociclador. 
 Desnaturação (95–98°C) 
O DNA abre. 
As duas fitas se separam. 
 
 Anelamento (55–65°C) 
Os primers se ligam ao DNA. 
Eles marcam o local que será copiado. 
 
 Extensão (72°C) 
A Taq polimerase cria a nova fita de DNA. 
 
Esse ciclo se repete 30 a 32 vezes. 
Resultado: 
1 cópia vira bilhões de cópias de DNA. 
 
6. Problema após a PCR 
Mesmo com bilhões de cópias de DNA, não conseguimos ver o DNA a olho nu. 
Então usamos outra técnica: 
 Eletroforese em gel 
 
7. O que é Eletroforese 
É uma técnica para separar DNA pelo tamanho. 
Funciona assim: 
• O DNA tem carga negativa 
• Quando passa corrente elétrica ele vai para o polo positivo 
O DNA passa por um gel de agarose, que funciona como uma esponja cheia de 
buracos. 
 
8. Separação dos fragmentos 
Durante a corrida no gel: 
• fragmentos pequenos → correm mais rápido 
• fragmentos grandes → correm mais devagar 
Assim o DNA fica separado por tamanho. 
 
9. Como enxergamos o DNA 
O gel recebe um corante (ex: brometo de etídio). 
Quando colocamos o gel em luz ultravioleta, aparecem bandas fluorescentes. 
Cada banda = um fragmento de DNA. 
 
10. O que é o Marker 
O marker (marcador molecular) é uma mistura de fragmentos de DNA com 
tamanhos conhecidos. 
Ele funciona como uma régua. 
Comparando as bandas da amostra com o marcador, descobrimos o tamanho do 
DNA (em pares de base – pb). 
 
11. Para que usamos PCR + eletroforese 
Essas técnicas são usadas para: 
Diagnóstico de doenças 
Detectar DNA de vírus ou bactérias 
Exemplos: 
• COVID 
• HIV 
• tuberculose 
 
Investigação forense 
Comparar DNA entre pessoas 
Exemplos: 
• teste de paternidade 
• identificação criminal 
 
 
1. Objetivo do experimento 
O objetivo da prática é extrair o DNA das células vegetais para conseguir 
visualizá-lo. 
Normalmente o DNA não pode ser visto a olho nu, mas quando ele é extraído e 
precipitado, aparece como filamentos esbranquiçados parecidos com algodão. 
 
2. Por que usar morango e cebola? 
 Morango 
• possui muito DNA 
• tem 8 cópias de cada cromossomo 
• por isso o DNA fica mais fácil de visualizar 
 Cebola 
• células grandes 
• fácil ruptura celular 
 
3. Etapas da extração de DNA 
Normalmente o procedimento segue essas etapas: 
 Maceração 
O morango ou a cebola são amassados. 
Objetivo: 
• quebrar o tecido 
• romper parte das células 
• liberar o conteúdo celular. 
 
 Adição de detergente 
O detergente serve para quebrar as membranas. 
Ele dissolve: 
• membrana plasmática 
• membrana nuclear 
Essas membranas são feitas de lipídios, que o detergente destrói. 
Resultado: o DNA é liberado. 
 
 Adição de sal 
O sal (NaCl) ajuda a: 
• separar o DNA das proteínas 
• estabilizar a molécula de DNA 
Assim o DNA fica mais fácil de precipitar. 
 
 Filtração 
A mistura é filtrada para: 
• remover pedaços de tecido 
• deixar apenas o líquido com DNA. 
 
 Adição de álcool (etanol ou álcool gelado) 
Essa é a etapa mais importante. 
O álcool faz o DNA precipitar. 
Isso acontece porque o DNA não é solúvel em álcool. 
Então ele aparece como: 
• fios 
• nuvem branca 
• filamentos viscosos 
 
4. O que é aquele “fio branco” 
Aquele material branco que aparece é: 
 DNA precipitado 
Ele pode ser puxado com um palito ou bastão de vidro. 
 
5. O que geralmente a prova pergunta 
 Qual o papel do detergente? 
Quebrar membranas celulares e nucleares. 
 
 Qual a função do sal? 
Separar DNA das proteínas e ajudar na precipitação. 
 
 Qual a função do álcool gelado? 
Precipitar o DNA para torná-lo visível. 
 
 Por que macerar o material? 
Romper células e liberar o conteúdo celular. 
 
 Por que o morango é muito usado? 
Porque possui muitas cópias de DNA (octaplóide). 
 
6. Relação com biotecnologia farmacêutica 
Essa técnica é importante porque a extração de DNA é o primeiro passo para 
muitas análises, como: 
• PCR 
• diagnóstico molecular 
• engenharia genética 
• produção de medicamentos biotecnológicos.