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VETWEB AVA Aula 2 - Hematologia / Eritrograma Prof.ª Dr.ª Waleska de Melo Ferreira Dantas Sumário 1 - Eritrograma: conceitos e contagem manual 2 - Contagem manual de eritrócitos 3 - Técnica do microhematócrito 4 - Contagem automática da série vermelha 5 - Alterações quantitativas e qualitativas 6 - Técnica do esfregaço sanguíneo 1. Eritrograma: conceitos e contagem manual O segundo tópico abordado na disciplina de Patologia Clínica tem como ênfase o eritrograma. Esse exame faz parte do hemograma e corresponde ao estudo dos eritrócitos ou, as popularmente denominadas - hemácias. Essas células são fundamentais, pois levam oxigênio para todo o organismo. Objetivos da aula Principais objetivos para o aluno Composição do hemograma O hemograma tem como objetivo avaliar a saúde geral do animal. O exame é composto por três partes principais, a saber: eritrograma, leucograma e trombograma. Figura 1 - Composição do hemograma. O eritrograma demonstra a contagem de hemácias ou eritrócitos do paciente. O leucograma demonstra a contagem de leucócitos. O trombograma demonstra a contagem de plaquetas. Importância do eritrograma O eritrograma é parte fundamental do hemograma, pois permite: Princípios da eritropoiese A eritropoiese é a produção de eritrócitos. Essa produção varia e depende das condições e do quadro clínico do paciente. O “start” para a produção de eritrócitos pode ocorrer em casos de baixa oxigenação tecidual, por exemplo. Nesse caso, a síntese de eritropoietina começa em minutos, com pico em 24 horas após a baixa de oxigenação. A eritropoietina é o hormônio que estimula a medula a produzir novos eritrócitos. Entretanto, apesar de o estímulo para a produção de eritrócitos ser rápido, as novas hemácias só surgem no sangue periférico em cinco dias. Esse é o período em que a célula de eritrócito leva para se diferenciar, proliferar e maturar na medula até ser lançado na corrente sanguínea. O eritrograma é o estudo dos eritrócitos, células cuja função é levar o oxigênio para o organismo. Os indicadores apresentados no eritrograma podem mostrar alterações quantitativas e qualitativas, quais sejam: Tabela 1 - Indicadores do eritrograma. Indicadores de alterações quantitativas Número global de eritrócitos por microlitro de sangue (μl) Quantidade de hemoglobina presente nos eritrócitos (g/dl) Técnica e contagem de hematócrito (%) Indicadores de alterações qualitativas Cálculo de índices hematimétricos - VCM; CHCM Morfologia dos eritrócitos: tamanho, cor e formato As alterações qualitativas são realizadas ao se avaliar a forma, cor e tamanho da célula do eritrócito. Desse modo, o cálculo dos índices hematimétricos auxilia a identificar as anemias, pois revela o volume ou tamanho da célula e sua coloração. A coloração avermelhada dos eritrócitos é resultante do número de hemoglobinas presentes na célula. Eritrócitos Veja, a seguir, as principais características dos eritrócitos: 2. Contagem manual de eritrócitos Agora veremos, na prática, as etapas para se realizar a contagem manual dos eritrócitos. Observaremos a técnica de contagem, bem como o material utilizado para essa finalidade. Técnica de contagem manual de eritrócitos Para realizar esse procedimento são necessários: A Câmera de Neubauer é o local onde se faz a contagem manual de eritrócitos. Prática: contagem manual de eritrócitos O primeiro passo é aprender a fazer a solução para a contagem dos eritrócitos, pois é necessário diluir o sangue do paciente em uma solução chamada de “Solução de Hayem”. Figura 2 - Solução de Hayem. A Solução de Hayem é responsável por fazer a dissolução do sangue do paciente deixando apenas as hemácias íntegras, possibilitando, dessa forma, a contagem das mesmas. Para que isso ocorra, coloca-se primeiramente 4 ml da Solução de Hayem em um tubo de ensaio com auxílio de uma pipeta graduada. Figura 3 - Extração de 4 ml da Solução de Hayem. É necessário ser rigoroso na extração de apenas 4 ml da solução, pois a variação, tanto para mais quanto para menos, pode alterar o resultado final na contagem de hemácias. Em seguida, pegue uma amostra de sangue em repouso. Essa deve estar sedimentada. Faça a homogeneização da amostra, virando o tubo para cima e para baixo. Figura 4 - Homogeinize a amostra de sangue sedimentada antes de acrescentar a solução. Utilize uma pipeta automática para extrair 20 μl de sangue para adicionar à Solução de Hayem. A pipeta automática possui duas travas: a 1ª trava - aspira e a 2ª trava - despreza o líquido. Figura 5 - Pipeta automática para extração de sangue da amostra. Acople uma ponteira à pipeta automática. Abra o tubo com a amostra de sangue - após homogeneizá-la - e insira a ponteira para aspirar o sangue, utilizando a pipeta. Tudo que está fora da ponteira é excesso e deve ser retirado com um papel higiênico. Faça o movimento de cima para baixo. Em seguida, adicione a amostra de sangue na Solução de Hayem. Utilize a pipeta para misturar o sangue na solução. Tampe o tubo e faça a homogeneização da solução com a amostra de sangue, virando o tubo para cima e para baixo. Esse procedimento é importante para que se tenha uma amostra fidedigna do animal. Figura 10 - Homogeneização da amostra de sangue na Solução de Hayem. Após a homogeneização, a amostra deve ficar em repouso por 5 minutos, para que as demais células que compõem o sangue dissolvam-se e fiquem apenas os eritrócitos ou hemácias para exame. Após 5 minutos, o médico veterinário deve montar a Câmara de Neubauer para fazer a contagem de eritrócitos. Câmara de Neubauer A Câmara de Neubauer possui uma parte espelhada no centro, onde é feita a contagem manual de hemácias ou eritrócitos. Tem-se também uma lamínula que é acrescentada em cima da parte espelhada a fim de facilitar a entrada da solução. Pegue a amostra de sangue diluída na Solução de Hayem e faça novamente a homogeneização após os 5 minutos de descanso. Em seguida, aspire com a pipeta automática, preenchendo a ponteira da mesma com a amostra do sangue dissolvido. Encoste a ponta da ponteira no início da Câmara de Neubauer preenchendo a mesma com o líquido que contém as hemácias íntegras para contagem. Figura 13 - Inserção de hemácias íntegras para contagem na Câmara de Neubauer. A mistura da amostra de sangue em Solução de Hayem deve preencher apenas a parte espelhada de um dos lados da Câmara de Neubauer, ou seja, a metade. O passo seguinte é levar a câmara montada até o microscópio para a contagem manual dos eritrócitos. Figura 14 - Leve a Câmara de Neubauer montada até o microscópio. Lembre-se: toda vez que colocamos qualquer material no microscópio, é necessário: Ao focalizar a imagem do microscópio, faz-se a contagem das hemácias a partir de 5 quadrantes apresentados na lâmina e delimitados por três linhas. Dentro dos quadrantes, observamos 16 quadrados menores. Ou seja, a proporção é de 16 quadrados menores para cada 1 quadrante. Deve-se proceder à contagem dos eritrócitos nos 5 quadrantes e, a cada 16 quadros, sabemos que fizemos a contagem completa em 1 quadrante. Um problema ao se fazer a contagem de hemácias é observar que algumas delas não estão distribuídas dentro do quadrado uniformemente. Há casos em que algumas são encontradas em cima das linhas do quadrado. Por isso é importante fazer a contagem em L e na transversal, pois fica mais fácil de percorrermos a lâmina pelo microscópio. Figura 15 - Imagem de microscópio dos cinco quadrados grandes da Câmara de Neubauer em que se faz a contagem manual de hemácias na transversal em formato de L. Ao levarmos em conta esse formato, não corremos o risco de contar novamente a mesma hemácia. Para fazer a contagem, o veterinário pode utilizar um contador único de células. Figura 16 - Utilize um contador único de células para a contagem de hemácias. Após somar o número de eritrócitos ou hemácias presentes em cada um dos quadrantes, é necessário multiplicar o valor ou o resultado total por uma constante que é de 10.000 (dez mil) a fim de que se obtenha a quantidade de hemácias por milímetro cúbico de sangue
(mm3) do paciente. Geralmente o valor total de hemácias alcança a casa de milhões. 3. Técnica do microhematócrito A técnica do microhematócrito recebeu esse nome por ser um método realizado em um tubo microcapilar utilizando-se uma microcentrífuga. Hematócrito O hematócrito, também chamado de volume globular, é a concentração de eritrócitos presente no sangue em relação à quantidade de plasma. O valor do exame de hematócrito é dado em porcentagem (%). Atenção: a diminuição na porcentagem de hematócrito pode sugerir quadros anêmicos. Já o seu aumento sugere hemoconcentração. Técnica de mensuração do hematócrito A técnica de mensuração do hematócrito envolve os seguintes equipamentos: O Bico de Bunsen ou massa são utilizados para fechar um dos lados do tubo capilar. Já o cartão ou placa de leitura são utilizados para ler os resultados após serem processados na centrífuga. Prática: técnica do microhematócrito Na prática, iniciamos a técnica do microhematócrito utilizando um tubo capilar. Trata-se de um pequeno tubo de vidro aberto nas duas extremidades. Figura 17 - Tubo capilar. Insere-se uma amostra de sangue no tubo capilar e fecha-se um dos lados com a massa para que seja levado à centrífuga. Atenção: atualmente, a recomendação dos laboratórios é que não se use mais o Bico de Bunsen para vedar o tubo capilar, pois há o risco de explosão causado pelo gás ao se fechar o bico com fogo. Esse risco ocorre mesmo em laboratórios cujo gás é canalizado. Todas as vezes que se for utilizar uma amostra de sangue total, deve-se sempre homogeneizá-la, virando-se o tubo para cima e para baixo, a fim de obter uma uniformidade celular na amostra. Figura 18 - Faça a homogeneização da amostra total de sangue do paciente. Em seguida, abre-se o tubo de amostra sanguínea. Por capilaridade, inclina-se o tubo de sangue em direção ao tubo capilar. O tubo capilar deve ser inserido dentro do tubo da amostra para que o sangue passe para o capilar. Figura 19 - Insira o tubo capilar no tubo da amostra sanguínea. Por capilaridade, ou seja, devido à tendência que os líquidos apresentam de subir em tubos capilares, o sangue preenche o tubo capilar. Deixe um espaço de mais ou menos 1 cm para que seja possível fechar o tubo e levá-lo à centrífuga. Remova o excesso de sangue do lado de fora do tubo capilar utilizando um pedaço de papel higiênico. Esse procedimento evita que sujemos a centrífuga. Figura 20 - Remova o excesso de sangue do tubo capilar. Vede a ponta oposta do tubo capilar, ou seja, aquela que está com o espaço vazio. Figura 21 - Lado do tubo que deve ser vedado com massa. Vire o tubo sobre a massa fazendo movimentos de rotação para que a massa entre no tubo, vedando-o completamente. Tampe a parte de cima do tubo capilar com o dedo indicador e retire o tubo da massa. Repita novamente a operação de vedação, mantendo o dedo indicador sobre a extremidade superior do tubo. Leve o tubo até a centrífuga com o lado vedado apontado para a parte externa da máquina. Figura 25 - Inserindo o tubo capilar na centrífuga. Todas as vezes que inserimos um tubo na centrífuga é preciso balanceá-la, colocando um tubo na frente do outro para que a máquina fique uniforme e, quando em funcionamento, permaneça estável em suas rotações. Atenção: lembre-se de tampar a centrífuga com o prato, rosqueando. Isso deve ser feito antes de ligar a centrífuga para que os tubos permaneçam fixos no mesmo local em que foram colocados. Figura 26 - Tampe a centrífuga com o prato antes de iniciar o funcionamento da máquina. Programe a rotação da centrífuga para o tempo de 5 minutos. Após esse período, já é possível fazer a leitura do microhematócrito. Leitura do hematócrito A leitura do hematócrito é feita abrindo-se a centrífuga, retirando o prato e a amostra centrifugada. Figura 27 - Retire a amostra de sangue centrifugada. Observe que na amostra centrifugada há a separação do plasma e da parte sólida do sangue. Figura 28 - Separação do plasma da parte sólida do sangue. Há uma linha branca tênue, localizada acima da parte sólida, denominada capa leucocitária, muito utilizada para pesquisa de hemoparasitoses. Após separar a parte líquida da parte celular, realizaremos a leitura do hematócrito. Para isso, utiliza-se um cartão de leitura que apresenta uma escala em porcentagem, pois essa é a unidade de medida do hematócrito. Posicione o tubo capilar em uma das cavidades. Figura 29 - Posicione o tubo capilar no cartão de leitura. Atenção: alinhe o tubo capilar ao início da linha horizontal. Deslize a amostra até que consiga alinhar a quantidade de plasma à linha diagonal. Figura 30 - Alinhamento da parte sólida à linha horizontal e alinhamento do plasma à linha diagonal. Passe a régua, fixando a linha sobre a parte celular vermelha, ou seja, na linha de separação entre a o plasma e a parte sólida. Figura 31 - Posicione a linha da régua sobre a linha que separa o plasma da parte sólida do sangue. Faça a leitura do hematócrito, considerando as porcentagens da linha numerada. Figura 32 - Verifique o resultado na régua de porcentagens. No exemplo que desenvolvemos, o resultado da porcentagem de hematócritos ou a concentração de eritrócitos presente no sangue do paciente em relação à quantidade de plasma foi de 58%. Figura 33 - Observe a posição correta das réguas e da amostra centrifugada de sangue para a leitura do hematócrito no exemplo citado na aula. No cartão de leitura, a linha horizontal na qual se alinha a parte sólida do sangue fica localizada em cima, enquanto a linha perpendicular fica embaixo. O princípio de avaliação dos resultados é o mesmo ao se observar a porcentagem de plasma diante da escala apresentada no cartão. Figura 34 - Leitura de resultado de hematócrito no cartão. A técnica do microhematócrito segue os mesmos procedimentos para mensurar o volume globular de hematócritos em todos os animais domésticos, independente da espécie. O exame nos auxilia a avaliar o quadro clínico de pacientes com anemia e com policitemia. 4. Contagem automática da série vermelha Agora, iremos abordar a técnica de contagem automática para a contagem de eritrócitos. Essa contagem fornece os seguintes valores: Contagem automática A contagem automática é realizada através de aparelhos denominados hematológicos, ou aparelhos de hematologia. A contagem ocorre por meio da técnica de impedância, que pode ser associada ou não à técnica de citometria de fluxo. A impedância envolve uma corrente elétrica que passa por dentro do aparelho e que permite mensurar o peso molecular de cada célula do sangue. A citometria de fluxo é uma técnica que também faz uso de corrente elétrica, mas a leitura das células do sangue é feita de acordo com o tamanho de cada uma delas. A contagem automática é amplamente aplicada em hospitais e clínicas veterinárias, devido ao volume de demanda do exame, à facilidade de interpretação dos dados e agilidade no processo de execução. Tudo isso tornam os resultados do hemograma mais rápidos, uma vez que são liberados pela máquina no intervalo de apenas 3 minutos, aproximadamente, dependendo de cada aparelho. Entre as vantagens da contagem automática está o fato de minimizar a ocorrência de erros pré-analíticos, entre eles: a pipetagem inadequada de cada solução, a coleta de inadequada da quantidade de sangue, bem como a homogeneização do material coletado. Entre as desvantagens, podemos citar: Energia: necessidade de estabilidade da corrente elétrica para o bom funcionamento dos aparelhos. Pequenos ruminantes: esses animais possuem eritrócitos muito pequenos que, durante a contagem automática, podem ser confundidos com as plaquetas. Isso gera erro ou variação nos resultados apresentados. Eritrócitos jovens: esses eritrócitos são nucleados e, por isso, apresentam peso e tamanhos diferentes. Esse fator faz com que não sejam contados como eritrócitos. Obstrução de sondas: todos os líquidos aspirados para se fazer soluções, diluições e contagens são aspirados via sondas conectadas ao aparelho. Em pequenos ruminantes, existe a formação de microcoágulos provocados
por dificuldades de coleta na amostra sanguínea. Esses microcoágulos podem ser invisíveis a olho nu e são causadores de obstrução nas sondas ao interferir em todo o processo de realização do hemograma. Prática: demonstração de contagem automática Para fazer a contagem automática, é necessário que o médico veterinário saiba como funciona um aparelho hematológico automático. Figura 35 - Aparelho hematológico. Esses aparelhos possuem diversas soluções, entre elas: Solução diluente: separa as células do sangue para permitir a contagem. Solução lisante: permite a contagem da quantidade de hemoglobina nas hemácias. Solução de lavagem: para higienizar o aparelho e as sondas a cada uso, evitando, assim, a contaminação entre as amostras de sangue. Os aparelhos hematológicos possuem um menu que permite a calibragem de acordo com cada tipo de animal ou paciente. Por exemplo, ao obtermos uma amostra de sangue de um cão, é necessário que calibremos o aparelho para a espécie do paciente. Figura 36 - Faça a calibragem do aparelho hematológico de acordo com o tipo de paciente. A calibragem é necessária, pois cada espécie apresenta tamanho diferente de célula sanguínea, cujo peso molecular também sofre variações. Uma vez calibrado o aparelho, homogeneíze a amostra sanguínea. A seguir, abra o tubo e insira a agulha de aspiração do aparelho e aperte o botão azul atrás da agulha para dar início à avaliação automática do sangue. Figura 37 - Insira o tubo no dispositivo do aparelho. A máquina irá aspirar o volume necessário de sangue para processar a amostra. Em seguida, a agulha de aspiração irá se retrair e, dentro de aproximadamente 3 minutos, tem-se o resultado do hemograma. Após finalizado o processo, o médico tem a opção de imprimir os resultados ou acompanhar os valores na tela do aparelho. Os resultados apresentam indicadores de toda a série vermelha, desde a contagem global de hemácias, hemoglobina e hematócritos até o volume muscular médio, valor médio de concentração de hemoglobina muscular e o RDW. 5. Alterações quantitativas e qualitativas Nesse tópico, aprenderemos a identificar e interpretar os resultados do hemograma em relação à quantidade e qualidade das células sanguíneas apresentadas no exame. Em relação à qualidade, os resultados são obtidos a partir da observação da morfologia dos eritrócitos. Alterações quantitativas Observe os termos técnicos empregados para classificar as alterações quantitativas: Tabela 2 - Termos técnicos para alterações quantitativas. Nome Características Policitemias Aumento da quantidade de eritrócitos e de seus componentes no eritrograma Anemias Diminuição da quantidade de eritrócitos e de seus componentes no eritrograma As policitemias podem se apresentar de maneira relativa ou absoluta. Veja, a seguir as características de cada uma delas. Policitemia relativa Como o próprio nome indica, esse tipo de policitemia não necessariamente reflete o aumento da produção de eritrócitos pela medula óssea. Outras causas podem dissimular ou indicar esse aumento. Nesse sentido, o que ocorre é um falso aumento de eritrócitos. Por isso, a policitemia relativa também é chamada de pseudopolicitemia ou falsa policitemia. A policitemia relativa pode ocorrer quando há diminuição do plasma em relação às hemácias. Esse fato caracteriza a hemoconcentração. O quadro clínico pode ter diversas causas, entre elas: Nos casos de contração esplênica, o que ocorre é o aumento do volume global de sangue no organismo do paciente - aumentando também a quantidade de eritrócitos e de plasma e não propriamente, causando o desequilíbrio deles. A contração esplênica ocorre também em situações de stress, principalmente em felinos, devido à produção de adrenalina e aumento do volume total de sangue no organismo do animal. Em ambos os casos de contração esplênica, trata-se de uma situação transitória. Quando o animal cessa o exercício ou se é removido da situação de stress, os valores do hemograma retornam ao normal. Lembre-se: na policitemia relativa, não ocorre o aumento da produção medular dos eritrócitos. Policitemia absoluta A policitemia absoluta é também denominada por eritrocitose absoluta. Nesse caso, há o aumento na produção medular de eritrócitos. Classifica-se em: Primária ou Vera: policitemia que dá origem a neoplasias de linhagens medulares, disfunção da medula e aumento na produção de eritrócitos. Secundária: em que ocorre o aumento medular de produção de eritrócitos, porém, estimulado pela eritropoietina (EPO) quando há deficiência de oxigênio. Ocorre em casos de doenças respiratórias. Atenção: nem sempre o estímulo à ação da eritropoietina é resultante de um quadro anêmico do paciente. Quando o animal passa por qualquer processo que impede a troca gasosa adequada entre as células, ou seja, quando o oxigênio não é absorvido, o paciente entra em quadro clínico de hipóxia tecidual. Nesse estado, o organismo reconhece apenas a ocorrência de hipóxia, independente da quantidade de eritrócitos que circula na corrente sanguínea. Essa condição ativa a produção de eritropoietina que estimula a medula a produzir hemácias. Anemias As anemias são caracterizadas pela diminuição da quantidade de hemácias, hemoglobinas e hematócritos no sangue do paciente. Podem ser classificadas de acordo com: A resposta medular e morfológica das células: regenerativa ou arregenerativa. Quanto ao processo patológico, por exemplo: hemorragia aguda, infestação de ectoparasitas. a) Anemia regenerativa Ocorre o aumento da eritropoiese. A resposta medular na produção de eritropoietina varia de acordo com o grau da anemia. É necessário visualizar e avaliar eritrócitos jovens no esfregaço sanguíneo. b) Anemia arregenerativa Para proceder à avaliação de ambas as anemias - regenerativas e arregenerativas - é necessário observar os eritrócitos jovens no esfregaço sanguíneo. É por meio dessa avaliação que observamos a morfologia eritrocitária. Alterações qualitativas As alterações qualitativas visam avaliar a qualidade das hemácias. Essa avaliação é feita da seguinte forma: Cálculo e avaliação dos índices hematimétricos (volume e cor). Alterações no tamanho das células eritroides (jovens, adultas ou velhas). Alterações na coloração das células eritroides (indica a presença e quantidade adequada de hemoglobina). Avaliação da morfologia dos eritrócitos. A avaliação das alterações qualitativas inicia-se com o cálculo dos índices hematimétricos. Atenção: a avaliação qualitativa por meio de cálculo dos índices hematimétricos só é realizada quando os animais estão anêmicos. Iniciamos a avaliação qualitativa com o cálculo do tamanho das hemácias também chamado de volume globular médio ou volume das hemácias (VCM). Para calcular manualmente o tamanho das hemácias, utiliza-se a seguinte fórmula: Figura 38 - Fórmula para cálculo do tamanho de hemácias. Da mesma forma, podemos observar e avaliar a cor das hemácias , também chamada de Concentração de Hemoglobina Corpuscular Média (CHCM) ou Concentração de Hemoglobina Globular Média. Avaliamos a coloração da hemácia por meio da quantidade de hemoglobina que a célula apresenta: Normocrômica: quantidade de hemoglobina normal ou dentro do intervalo de referência. Hipocrômica: quantidade de hemoglobina inferior ao intervalo de referência. No caso de indicadores de cor, não existe um valor acima do intervalo de referência, visto que as hemácias possuem uma capacidade máxima de conter hemoglobina, sendo impossível a ocorrência de uma “hipercromia”. Observe, a seguir, a fórmula para cálculo da concentração da hemoglobina nas hemácias que possibilita a avaliação da cor: Figura 39 - Fórmula para cálculo do número de hemoglobina nas hemácias. A hemoglobina também pode ser mensurada utilizando-se aparelhos bioquímicos semiautomáticos ou automáticos. 6. Técnica do esfregaço sanguíneo A técnica do esfregaço sanguíneo é utilizada para: O esfregaço deve ser bem feito. A seguir, acompanhe a prática em que é descrita a técnica de realização do esfregaço e como deve ser corado adequadamente. Prática: técnica do esfregaço
sanguíneo Para fazer o esfregaço sanguíneo é necessária uma única gota de sangue. O esfregaço pode ser feito tanto com sangue colhido na hora quanto com amostra misturada ao anticoagulante. Material necessário: lâminas de microscópio, luvas descartáveis, tubo capilar. Há duas técnicas empregadas para se fazer o esfregaço, acompanhe: a) 1ª técnica de esfregaço sanguíneo - procedimentos 1. Pegue uma lâmina, coloque sobre a mesa. 2. Pegue a amostra sanguínea e faça a homogeneização. 3. Insira o tubo capilar na amostra para extrair a quantidade de sangue necessária. Recomenda-se que o tubo capilar seja preenchido até a metade para facilitar o gotejamento. 4. Coloque uma gota de sangue no canto da lâmina. Figura 40 - Procedimentos na 1ª técnica de esfregaço sanguíneo. 5. Pegue uma lâmina extensora. 6. Pressione a ponta da lâmina extensora sobre a gota para que o conteúdo seja distribuído. Figura 41 - Use a lâmina extensora pressionando-a para que o conteúdo da gota se distribua. 7. Empurre a lâmina extensora para frente, para fazer o esfregaço do sangue. Figura 42 - Empurre a lâmina extensora para fazer o esfregaço. Um bom esfregaço apresenta como resultado bordas irregulares, ou seja, é mais consistente em relação ao conteúdo sanguíneo no início e, à medida que o sangue se distribui pela lâmina, torna-se mais fluido até formar uma monocamada fina também chamada de cauda, franja ou cauda radiada. Figura 43 - Lâmina com esfregaço. Na cauda radiada é possível observar, após o procedimento de coragem, as células individualizadas posicionadas lado a lado. Isso facilita a avaliação morfológica dos eritrócitos e a pesquisa de hemoparasitas nas hemácias. b) 2ª técnica de esfregaço sanguíneo - procedimentos 1. Pegue uma lâmina de microscópio. 2. Faça a homogeneização da amostra sanguínea. 3. Pegue o tubo capilar e retire a quantidade necessária de sangue da amostra, aproximadamente, metade do tubo capilar. 4. Posicione a lâmina em sua mão, ao invés de colocá-la sobre a mesa. 5. Coloque uma gota de sangue sobre a lâmina. Figura 44 - Procedimentos na 2ª técnica de esfregaço sanguíneo. 6. Utilize uma lâmina extensora. 7. Posicione a lâmina extensora formando uma cruz sobre a lâmina inicial e pressione um dos lados da metade da lâmina sobre a gota para que o líquido se dilua. Figura 45 - Pressione a lâmina extensora sobre a gota. 8. Faça um movimento único com a lâmina extensora para baixo para fazer o esfregaço. Figura 46 - Faça o movimento para baixo com a lâmina extensora para concluir o esfregaço. Desse modo também teremos um esfregaço irregular, em que há uma parte mais consistente de sangue no início e outra mais diluída, ao final, formando a cauda radiada. Prática: técnica de coloração do esfregaço Neste tópico, vamos aprender como fazer a coloração do esfregaço para visualização das células sanguíneas. Há diversas colorações disponíveis no mercado, entre elas: o Panótico - rápido, prático, permitindo fazer a coloração dentro do laboratório e obter a visualização tanto de eritrócitos quanto das inclusões que podemos encontrar dentro dos mesmos. Figura 47 - Panótico e seus componentes. O panótico é formado por três componentes, a saber: 1. Fixador: feito à base de etanol e responsável por evitar que as células sofram alguma distorção durante o processo de coloração. Nessa primeira etapa, mergulha-se toda a lâmina dentro do fixador por 10 segundos. 2. Corante vermelho: responsável pela coloração das hemácias e algumas inclusões que podem ser encontradas. O tempo de imersão da lâmina no corante vermelho deve ser de 15 segundos. 3. Corante roxo: responsável pela coloração do núcleo dos leucócitos, identificando também a presença de eritrócitos nucleados (jovens hemácias), e inclusões que, por acaso, possam ocorrer. O tempo de imersão da lâmina no corante deve ser de 30 segundos. A imersão da lâmina com esfregaço nos componentes do panótico deve ser feita imediatamente, de um componente para outro, respeitando-se o tempo correto de imersão para cada um deles. É importante manter os três componentes sempre novos, trocando o conteúdo dos frascos por, pelo menos, uma vez por semana. Isso ajuda a manter a qualidade na coloração das células, evitando o aparecimento de manchas que podem levar a falsos resultados no exame, por exemplo, a confusão de restos de corantes com falsos parasitas. Utilize uma pinça para fazer a imersão total da lâmina nos componentes do panótico. Figura 48 - A lâmina deve ser totalmente submersa nos componentes. Prática: lavagem da lâmina pós-coloração Ao terminar o processo de imersão nos componentes, deve-se fazer a lavagem da lâmina em água corrente para retirar o excesso de corante. Figura 49 - Lave a lâmina para retirar o excesso de corante. Ao lavar a lâmina, cuide para que permaneça segura pela pinça na posição vertical sob a água, evitando que a força da água caia diretamente sobre o esfregaço. A lâmina deve ficar em repouso na bancada, também na posição vertical, até que seque para que possamos fazer a leitura da morfologia dos eritrócitos. Dependendo do dia, esse processo de secagem pode demorar de 15 a 20 minutos. Morfologia eritrocitária Vamos observar, nesse último tópico, algumas morfologias eritrocitárias possíveis de se encontrar em diferentes amostras sanguíneas: Observe, na figura a seguir, a imagem microscópica do comportamento das células de eritrócitos normais e eritrócitos jovens - metarrubrícitos - representados por células nucleadas. Figura 50 - Eritrócitos normais e eritrócitos jovens. A seguir, observe a imagem dos esferócitos, células menores, mais arredondadas e demonstradas pelas setas. Figura 51 - Esferócitos. A presença de esferócitos pode indicar um quadro clínico de anemia hemolítica imunomediada, por isso a importância de se observar a presença ou não dessas inclusões no exame microscópico da morfologia eritrocitária. Veja agora um quadro clínico de hipocromia em que observamos o halo central da hemácia esbranquiçado e sem cor. Essa alteração indica baixos níveis de hemoglobina nas hemácias que passam a ser chamadas de eritrócitos hipocrômicos. Figura 52 - Eritrócitos hipocrômicos.