PROTEÔMICA bioquimica

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PROTEÔMICA
- Proteômica é o estudo abrangente de todas as proteínas, o estudo do proteoma, quer seja de uma célula, tecido, fluido corporal, ou organismo, incluindo a estrutura, a função, expressão de perfis, e interações proteína-proteína. Há uma série de boas razões para estudar as proteínas. Primeiro, as proteínas compreendem o componente ativo de células, que são as máquinas moleculares que catalisam a síntese de metabolitos e moléculas importantes, monitorar o ambiente interno e externo da célula e mediar respostas a perturbações ambientais. Assim, a compreensão das proteínas que estão presentes em uma célula pode ajudar na nossa compreensão das atividades da célula (como a célula funciona).
- Em eucariotos, o numero de proteínas é muito maior do que o número de genes. Por exemplo, o proteoma humano  chega a aproximadamente a um milhão de proteínas, um número surpreendentemente maior do que a quantidade de genes codificadores de proteínas identificados no genoma humano, de aproximadamente 30.000 genes. Essa diferença de números se deve principalmente ao splicing alternativo e a modificações pós traducionais, onde um único polipeptídeo pode dar origem a mais de uma proteína. 
- É aqui que a proteômica entra, como já dito, ela é o estudo do conjunto de todas as proteínas e por isso é um método importante para identificar, quantificar e estudar as modificações das proteínas, o que nos leva a entender como a célula funciona e como o organismo funciona. 
Poteômica e espectrometria de massa
- Análises proteômicas requerem em primeiro lugar a separação das proteínas ou de seus fragmentos, e em seguida sua identificação. Abordagens tradicionais, como reatividade com anticorpos e propriedades funcionais, não conseguem identificar uma quantidade muito grande de proteínas. A espectrometria de massa, técnica utilizada para detectar e identificar moléculas de interesse por meio da medição da sua massa e da sua carga – separando de acordo com a razão massa/carga, faz com que a análise proteômica seja possível. No livro são citadas duas fontes de ionização da espectrometria de massa para identificação de proteínas, essas fontes são: MALDI-TOF e ESI. 
MALDI-TOF, sigla para Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization – Time of Flight, consiste num sistema no qual o material (proteína) é colocado em uma plca contendo matriz polimérica, essa placa é irradiada com laser que vaporiza a amostra e há ionização de várias moléculas que sao aspiradas num tubo de vácuo e levadas ate o detector. Conforme a molécula, o tempo de chegada ao detector (time off flight) é diferente. 
ESI, sigla para Electrospray Ionization 
- Mas, antes de serem analisadas por espectrometria de massa, as proteínas devem ser separadas. Um método de separação dessas proteínas é utilizando eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida, onde geralmente são separadas por ponto isoelétrico na primeira dimensão e por peso molecular na segunda dimensão. Os spots das proteínas são quantificados, os escolhidos são digeridos com tripsina (enzima proteolítica, quebra ligações peptídicas) e podem então ser analisados por espectrometria de massa. O método de ionização mais utilizado é o MALDI-TOF (sistema no qual o material é colocado em uma placa contendo matriz polimérica, essa placa é irradiada com laser que vaporiza a amostra e há ionização de várias moléculas que são aspiradas num tubo de vácuo e levadas ate o detector. Conforme a molécula, o tempo de chegada ao detector é diferente). Os pesos moleculares dos diferentes fragmentos são comparados com outros de uma base de dados, e isso resulta na identificação da proteína. O único ponto negativo de se utilizar gel bidimensional para separar as proteínas é que as proteínas mal expressadas são omitidas pelas proteínas que melhor se expressam.
- Outro método para separar proteínas é o método gel free, onde a mistura de proteínas é digerida com tripsina em primeiro lugar, e a mistura de peptídeos formada é separada por cromatografia líquida em coluna. A vantagem de se utilizar esse método é que o efluente da coluna pode ser introduzido diretamente na espectrometria de massa por ESI, diferente da MALDI-TOF que necessita da excisão do spot, tripsinização e aplicação na placa contendo matriz. É um método adequado para análise em grande escala. 
- Exemplo de utilização: Samuel Miller e alguns associados quiseram examinar os níveis de proteínas em Pseudomonas aeruginosa, um patógeno que causa infecções pulmonares, eles estudaram sua ação na fibrose cística. Estudaram o efeito da baixa concentração de Mg2+ no meio e também em cepas isoladas de pacientes com fibrose cística. Utilizaram a segunda abordagem (cromatografia liquida seguida de analise por espectrometria de massa ESI), porém o resultado da espectrometria de massa foi pobre quanto a quantificação. Então, eles pegaram os dois grupos de proteínas e marcaram utilizando ICAT (isotope-coded affinity tag), que é a marcação por afinidade codificada por isótopos. Essa marcação pode ser ICAT leve (hidrogênio) ou ICAT pesada (deutério). Ao colocar as proteínas em uma coluna de avidina, apenas as proteínas marcadas passam pois se ligam a avidina por meio da biotina presente no complexo ICAT, o que simplifica a análise. Eles analisaram 1337 proteinas e observaram que a expressão de 145 delas foi afetada pela baixa concentração de Mg2+, tanto do meio quanto das cepas. 
Arranjos de proteínas 
- Arranjos de proteínas consistem em um grande numero de proteínas imobilizadas individualmente em posições conhecidas na superfície revestida de uma lamina de vidro ou de um chip. O propósito desses arranjos é detectar, em larga escala, as moléculas que interagem com as proteínas. Essas moléculas podem ser outras proteínas, sequencias de acido nucleico, ou compostos de baixo peso molecular. 
- Há diferentes métodos de se visualizar essas interações proteicas, mas o mais comum é marcando as amostras com corante fluorescente e detectar as moléculas marcadas com um scanner a laser.