Produção de embriões bovinos in vivo e in vitro

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UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIÇOSA 
PRÓ-REITORIA DE EXTENSÃO E CULTURA 
DEPARTAMENTO DE ZOOTECNIA 
 
 
85ª SEMANA DO FAZENDEIRO 
 
 
 
 PRODUÇÃO DE EMBRIÕES BOVINOS IN 
VIVO E IN VITRO. 
 
 
 
 
 
Jurandy Mauro Penitente Filho 
Fabrício Albani Oliveira 
Erly Carrascal 
Adriana Moreira Zolini 
Ítalo Soares 
Ciro Alexandre Alves Torres 
 
 
 
 
Viçosa – MG 
2014 
 
 
 
Sumário 
Introdução .......................................................................................................................................... 1 
Dinâmica folicular .......................................................................................................................... 2 
Produção in vivo de Embriões Bovinos .............................................................................................. 3 
Seleção e sincronização de receptoras ........................................................................................... 3 
Sincronização de receptoras com PGF2α ................................................................................... 4 
Uso do GnRH e suas associações .............................................................................................. 4 
Associação de progestágenos e estradiol ................................................................................... 5 
Seleção e superovulação (SOV) das doadoras ............................................................................... 6 
Colheita, rastreamento e classificação de embriões: ...................................................................... 8 
Transferência dos embriões: ........................................................................................................... 9 
Produção in vitro de Embriões Bovinos ........................................................................................... 10 
Coleta dos Complexos cumulus oócitos (COC’s): ....................................................................... 10 
Classificação de oócitos: .............................................................................................................. 10 
Maturação in vitro: ....................................................................................................................... 11 
Fertilização in vitro: ..................................................................................................................... 12 
Cultivo in vitro de embriões: ........................................................................................................ 12 
Micromanipulação de Embriões ....................................................................................................... 12 
Bipartição de embriões ................................................................................................................. 12 
Separação de Blastômeros:........................................................................................................... 13 
Considerações finais ......................................................................................................................... 13 
Referências ....................................................................................................................................... 14 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
1 
 
 
Introdução 
 
A utilização e o desenvolvimento de biotécnicas da reprodução animal são condições 
indispensáveis para o aumento da eficiência produtiva. Nesse sentido, especialmente no 
que se refere aos ruminantes domésticos, biotécnicas como a inseminação artificial, 
fertilização in vitro e a transferência de embriões vêm sendo utilizadas com sucesso 
(FIGUEIREDO et al., 2007). 
Os avanços obtidos nas biotécnicas reprodutivas ao longo dos anos permitiram maior 
participação da fêmea bovina no processo de melhoramento genético do rebanho, visto que 
o número de descendentes deixados por uma única fêmea ao longo de sua vida reprodutiva 
aumentou significativamente com o aperfeiçoamento das técnicas de transferência e 
produção in vitro de embriões (GONÇALVES et al., 2007). 
O Brasil é o maior produtor de embriões bovinos do mundo, respondendo por quase 
um terço da produção mundial (Figura 1). A mudança ocorrida no mercado nacional após 
2004 (Figura 2), com a progressiva substituição da chamada transferência de embriões 
convencional (ou simplesmente TE) pela produção de embriões em laboratório (conhecida 
como FIV ou PIV), fez com que a participação do Brasil no total de embriões produzidos 
por superovulação fosse reduzida pela metade no período 2004-2007. Com isso, o país 
ficou atrás, no cenário mundial, do eixo EUA-Canadá e Japão. No mercado de embriões 
PIV, no entanto, o país consolidou sua liderança, respondendo por mais de 85% do total 
mundial (SBTE, 2009). 
 
 
Figura 1 – Participação do Brasil no total de embriões bovinos produzidos no mundo no período de 2003-2007 (SBTE, 
2009). 
 
 
Figura 2 – Produção de embriões no Brasil, por técnica, no período 2000-2008. 
 
Após um período intenso de crescimento, de 2002 a 2006, a PIV apresentou uma 
tendência de estabilização. A redução na velocidade de crescimento da PIV era esperada, 
2 
 
em função da redução natural na demanda reprimida que havia no mercado de 
reprodutores, e também em função das próprias limitações da técnica, como a dificuldade 
na criopreservação dos embriões. A congelação de embriões PIV ainda é limitada (Figura 
3), assim, a TE vem suprindo a demanda por embriões criopreservados, seja para fins de 
otimização do uso de receptoras, seja para fins de comércio (SBTE, 2009). 
 
 
Figura 3 – Transferências a fresco e congelação de embriões bovinos no Brasil no período 2007-2008 (SBTE, 2009). 
 
As raças zebuínas ainda respondem pela maioria absoluta dos embriões produzidos 
no Brasil, principalmente zebus de corte. Contudo, observa-se um aumento considerável na 
participação de raças leiteiras no mercado de embriões (Figura 4), especialmente da Gir 
(68% do total das raças leiteiras) e Girolando (22,4%). 
 
 
Figura 4 – Participação de raças leiteiras no total de embriões produzidos no Brasil de 2004 a 2008 (SBTE, 2009). 
 
Dinâmica folicular 
O desenvolvimento folicular de bovinos ocorre em um padrão de ondas. Cada onda 
de crescimento folicular é caracterizada por um grupo de pequenos folículos que são 
recrutados e iniciam uma fase de crescimento comum por cerca de três dias. Destes 
folículos, apenas um continua seu desenvolvimento, enquanto os outros sofrem decréscimo 
de tamanho, estabelecendo-se então, o fenômeno da divergência folicular (BARUSELLI et 
al., 2007). 
Vacas e novilhas podem ter duas ou três ondas por ciclo, com um folículo tornando-
se dominante em cada uma delas. Por isso, uma população de pequenos, médios e grandes 
folículos é encontrada em cada ovário, durante todos os dias do ciclo estral (BORGES et 
al., 2001). 
0
5
10
15
20
25
2004 2005 2006 2007 2008
ANO
%
 T
O
T
A
L
 
FIV
TE
TOTAL
3 
 
Cada onda de crescimento folicular é dividida em quatro fases: emergência, seleção, 
dominância e atresia ou ovulação. A emergência de uma onda é caracterizada por um 
crescimento de mais de 20 folículos pequenos que são estimulados pelo FSH (REIS, 2004). 
A concentração de FSH atinge seu pico quando o maior folículo denominado dominante 
(FD) atinge o tamanho de 4 a 5 mm (NASSER, 2006). 
Uma das maneiras do FD manter seu “status” é produzir substâncias que inibam o 
desenvolvimento de outros folículos antrais. Uma dessas substâncias é a inibina, um 
hormônio peptídeo produzido pela granulosa que inibe a secreção do FSH por efeito de 
retroalimentação negativa sobre a liberação de FSH, aparentemente pelo efeito direto 
sobre a hipófise (FLORIANI, 2006). 
A dinâmica folicular em animais zebuínos tem-se mostrado diferente da de bovinos 
de raças europeias, de modo que o diâmetro dos FD e a área do Corpo Lúteo (CL) são 
menores nas fêmeas zebuínas (BORGES et al., 2001). Rasi (2005) ressalta que a 
emergência da 3ª onda folicular está associada a uma fase luteínica mais prolongada 
(Figura 5). 
 
 
Figura 5 – Esquemas de ciclo estral. Em A, duas ondas foliculares, em B, três ondas foliculares (TECNOPEC, 2010). 
Produção in vivo de Embriões Bovinos 
 
Seleção e sincronização de receptoras 
As receptoras de embriões necessitam de cuidados tão rigorosos quanto os 
dispensados às doadoras. Os cuidados, em relação à sanidade (IBR, BVD, Leptospirose, 
Tuberculose, Brucelose, Tricomonose), nutrição, mineralização de qualidade e fertilidade, 
influenciam significativamente os resultados da técnica (TECNOPEC, 2010). 
Geralmente são utilizadas fêmeas cruzadas como receptoras jovens (zebu x taurino), 
com boa capacidade de conversão alimentar, com alta fertilidade e boa habilidade materna. 
Em geral, as receptoras eram descartadas após a primeira cria, porém atualmente o 
reaproveitamento de receptoras tem se tornado comum, pois os preços praticados pelos 
fornecedores de receptoras têm se tornado cada vez maior (TECNOPEC, 2010). 
Algumas considerações devem ser feitas em relação à sincronia da receptora com a 
doadora, tendo em vista que no momento da colheita, os embriões apresentam uma 
importante variabilidade em seus estágios de desenvolvimento (24 a 36 horas de diferença) 
(HAFEZ, 1995). Sendo assim, é adequado ter um grau de sincronia de aproximadamente 
24 horas entre a doadora e a receptora, o que permite eleger a receptora mais apropriada 
para cada tipo de embrião colhido. 
 
B A 
4 
 
Sincronização de receptoras com PGF2α 
A PGF2α e seus análogos são os hormônios mais utilizados na sincronização de cio. 
Porém, a PGF2α apresenta alguns limitantes em seu uso, tais como: necessidade de pessoas 
qualificadas para detecção de cio, alta variabilidade das respostas ao tratamento e limitada 
quantidade de receptoras detectadas em cio. 
Vários estudos sobre o uso de prostaglandinas demonstraram que a variação do 
intervalo entre a aplicação aos sinais de cio e ovulação pode ser atribuída ao estado da 
onda folicular no momento do tratamento. Se a luteólise for induzida antes da metade do 
período estático do folículo dominante, indica que este será o folículo ovulatório, sendo 
que o intervalo tratamento-cio será curto entre 2 e 3 dias. Porém, se a luteólise for induzida 
após esse momento, o folículo ovulatório será da próxima onda folicular e o intervalo 
tratamento-cio será maior, entre 4 a 6 dias. 
Além disso, estudos revelam que a PGF2α não é efetiva nos primeiro 5 a 6 dias do 
ciclo estral. Um dos protocolos de sincronização de cios mais usados e mais eficientes 
consiste na administração de 2 doses de PGF2α num intervalo de 11 a 14 dias, o que 
possibilitará que todos os animais tratados estejam em fase luteal no momento da segunda 
aplicação. Este método é facilmente aplicado a um programa de TE, visto que permite que 
a primeira dose de PGF2α seja administrada na receptora no momento em que a doadora 
estiver em cio, antes da superovulação (SOV), com a 2
a
 dose sendo aplicada após 11-12 
dias, ou seja, 12 horas antes da aplicação de PGF2α na doadora, fazendo com que o cio da 
receptora e doadora seja o mais sincrônico possível. 
 
Uso do GnRH e suas associações 
Um protocolo muito usado para sincronizar a ovulação de receptoras é conhecido 
como OVSYNCH e consiste no seguinte esquema (Esquema 1) de tratamento: 
 
 GnRH PGF2α GnRH TETF* 
 
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 
Esquema 1: Protocolo OVSYNCH de sincronização da ovulação.*Transferência de embriões em tempo fixo, Fonte: 
TECNOPEC, 2008. 
A administração de GnRH e seus agonistas (GnRHa) induz a liberação de LH e FSH. 
A liberação de LH induz a ovulação ou a luteinização de grandes folículos presentes no 
momento do tratamento. A ovulação do folículo dominante permite a liberação de FSH, 
podendo ser complementado pelo GnRH exógeno, culminando com mais liberação de 
FSH, para iniciar o recrutamento de uma nova onda folicular. 
O mecanismo de ação do GnRH consiste: a primeira dose irá induzir a liberação de 
LH, resultando em ovulação ou luteinização do folículo dominante induzindo, 
consequentemente, a emergência de uma nova onda folicular dentro de 2 dias. A 
administração de PGF2a 7 dias após tem função de induzir a luteólise; 2 dias depois se 
administra outra dose de GnRH com a intenção de induzir outro pico de LH e sincronizar a 
ovulação do folículo dominante existente (MARTINEZ et al., 2001). 
O sistema OVSYNCH mostrou melhores resultados quando usados em vacas do que 
em novilhas. Resultados de outro estudo confirmaram que o GnRH nem sempre resulta em 
ovulação ou luteinização do folículo dominante em novilhas. Vale ressaltar que a 
emergência folicular será efetiva somente quando o tratamento causar ovulação 
(MARTINEZ et al., 1999). Para novilhas têm se obtido maior taxa na sincronização 
quando entre o GnRH e a PGF2α for administrado um implante de CIDRB (Esquema 2) 
5 
 
visando prevenir o aparecimento do cio, que ocorre em muitos casos antes da segunda dose 
de GnRH (MARTINEZ et al., 2001). 
 
 
GnRH PGF2α GnRH TETF 
 
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 
 
Implante de progesterona 
Esquema 2: Tratamento para TETF, com OVSYNCH associado à progesterona sem a necessidade de detecção de cio. 
 
O início do protocolo OVSYNCH em determinado estágio do ciclo estral é associado 
com redução na fertilidade; por exemplo, se a 1ª dose de GnRH for aplicada entre o D9 e 
D12 do ciclo estral, a mesma pode não resultar em ovulação com consequente não 
formação do CL. Neste estágio vacas que possuem apenas 2 ondas foliculares, comumente 
possuem pequeno potencial de folículo dominante, que não é responsivo ao GnRH. 
Consequentemente, não há formação de um CL 2 a 4 dias após a injeção de GnRH. O ciclo 
segue normalmente com a secreção de PGF2α uterina causando a luteólise, sem o 
aparecimento de cio induzido e sim fisiológico. Outra fase crítica para o uso do 
OVSYNCH é quando o ovário se encontra no metaestro. Neste estágio, houve uma 
ovulação fisiológica prévia e o potencial do folículo dominante ainda é pequeno e não é 
responsivo ao LH (< 9 mm), não havendo resposta à aplicação do GnRH (MOREIRA et 
al., 2000). 
Algumas estratégias vêm sendo desenvolvidas para minimizar o número de vacas 
que se encontram nestes estágios críticos do ciclo estral no início do tratamento 
OVSYNCH. Um método é a aplicação de 2 doses de PGF2α com intervalo de 11 - 12 dias 
entre as doses, em um intervalo de 14 dias antes do início do tratamento com OVSYNCH. 
Com este tratamento se todas as vacas estiverem ciclando espera-se que 90% das vacas 
estejam no momento ideal para começar o protocolo. 
 
Associação de progestágenos e estradiol 
A função principal do estradiol (E2) é de induzir a regressão dos folículos antrais em 
crescimento. Os resultados mais eficazes foram obtidos quando o estradiol foi aplicado até 
um dia depois da inserção do implante de progesterona (P4). 
O mecanismo pelo qual o estradiol causa regressão folicular envolve a inibição do 
FSH, até que o estradiol seja metabolizado. A partir de então, o FSH volta aumentar seus 
níveis e uma nova onda folicular é recrutada. A dose de 5 mg de E2 causa uma emergência 
folicular 4 dias após sua aplicação. O benzoato de estradiol (BE) na dosede 5 mg possui 
efeito similar. Os ajustes nos protocolos são controversos, mas tem-se notado maior 
sincronização da emergência folicular, quando o BE é aplicado no D0 (Dia 0) juntamente 
com 50 mg de P4 (MOREIRA et al., 2000). 
Tríbulo (2000) sugere a inserção do dispositivo de liberação lenta de P4 (Primer) 
combinado com 2 mg de BE no dia 0, e uma aplicação de PGF2α no dia 7, ou seja, no 
momento da retirada do CIDR, e mais uma dose de 1 mg de BE no D9, sendo que para 
todas as vacas foram consideradas que o D10 era o dia do estro (Figura 6). 
 
6 
 
 
Figura 6 – Protocolo para TETF em receptoras cíclicas (TECNOPEC, 2010). 
 
Fêmeas que falham na concepção apresentam menores níveis de progesterona do que 
aquelas que concebem. O desenvolvimento embrionário e a habilidade do concepto em 
secretar Interferon τ estão relacionados com a concentração sérica de progesterona. 
Uma forma estudada para aumentar a concentração de progesterona plasmática é a 
indução de múltiplas ovulações, através da indução de maior recrutamento folicular pela 
utilização de eCG (gonadotrofina coriônica equina; Figura 7A) ou FSH (Figura 7B) 
durante o protocolo de sincronização. 
 
 
Figura 7 – Protocolo para superovulação de receptoras (TECNOPEC, 2010). 
 
Seleção e superovulação (SOV) das doadoras 
Entende-se por doadoras as fêmeas que de alguma forma venham contribuir para o 
ganho genético de um rebanho. As doadoras devem ter características superiores à média 
de produtividade encontrada no rebanho, pois assim multiplica-se qualidade. Vacas sadias 
que já atingiram a puberdade devem ser escolhidas. Doadoras que apresentam problemas 
reprodutivos, ciclo estral irregular, metrite e/ou anestro não respondem bem ao tratamento 
superovulatório. 
A SOV é o aumento do número fisiológico de ovulações, próprio de cada espécie, 
provocado após administração exógena de gonadotrofinas. Nos bovinos, considera-se que 
houve resposta ao tratamento quando se conseguem mais de duas ovulações. A SOV, 
portanto, é um método de estimular diversos folículos terciários a se desenvolverem até o 
estágio de pré-ovulação, com subsequente ovulação (RASI, 2005). 
A resposta das doadoras a SOV apresenta grande variabilidade tanto na taxa de 
ovulação, quanto na produção de embriões viáveis. Há grande efeito da idade da doadora, 
do coeficiente de endogamia da doadora, da ordem de colheita, da dose da droga e do 
número de inseminações sobre esses resultados (PEIXOTO et al., 2002). As doadoras 
A B 
7 
 
podem ser superovuladas repetidamente a cada 40 dias, durante um período de 1 a 2 anos, 
com resultados satisfatórios (HASLER, 2003). 
Utilizando o cio natural realizam-se oito aplicações de FSH com intervalos de 12 
horas, para aumentar o recrutamento dos folículos e no 3° dia da SOV, realizam-se duas 
aplicações de PGF2α promovendo a luteólise, para que haja redução da P4 e consequente 
pico de LH, ocorrendo, assim, a ovulação (Figura 8; RASI, 2005). 
 
DIA 0 10 11 12 13 14 15 
MANHÃ CIO FSH FSH 
FSH 
PGF2α 
FSH CIO IA 
TARDE FSH FSH 
FSH 
PGF2α 
FSH IA 
Figura 8 – Protocolo de SOV baseado no cio natural associado com FSH + PGF2α; IA = Inseminação Artificial. 
 
O uso de P4 e E2 em protocolos foi um grande avanço para a biotecnologia da 
reprodução animal, permitindo que a SOV fosse iniciada em fases aleatórias do ciclo estral 
dos bovinos. O Benzoato de Estradiol (BE), em protocolos de SOV, é utilizado com a 
função de suprimir o desenvolvimento folicular e sua resposta é mais eficaz quando 
combinada com aplicação de P4 IM na introdução de implante vaginal, CIDR
®
, de P4 
(Figura 9; RASI, 2005). 
 
DIA 0 4 5 6 7 8 9 
MANHÃ 
P4 + E2 
+ CIDR
®
 
(implante) 
FSH FSH 
FSH 
 
FSH 
CIDR
®
 
(retirada) 
CIO IA 
TARDE FSH FSH 
FSH 
PGF2α 
FSH IA 
Figura 9 – Protocolo de SOV com E2+P4+ CIDR+PGF2α; IA = Inseminação Artificial. 
 
Nem sempre a ovulação está sincronizada nos tratamentos de SOV e, portanto há 
dificuldade no acerto das inseminações realizadas, levando a recuperação de inúmeras 
estruturas não fecundadas. O GnRH tem sido utilizado para controle da ovulação no final 
destes protocolos, assim como o LH (Figura 10). 
 
DIA 0 4 5 6 7 8 9 
MANHÃ 
P4 + E2 
+ CIDR
®
 
(implante) 
FSH FSH 
FSH 
PGF2α 
FSH 
CIDR
®
 
(retirada) 
GnRH / 
LH 
IA 
TARDE FSH FSH 
FSH 
PGF2α 
FSH IA 
Figura 10 – Protocolo de SOV com E2 + P4+ CIDR® +PGF2α + GnRH/LH para a inseminação em tempo fixo; IA = 
Inseminação Artificial. 
 
O protocolo de Transferência de embriões em tempo fixo (TETF) para doadoras 
taurinas consiste em aplicar no dia do início do protocolo (D0) 3 ml de BE (Ric-BE
®
) e 
inserir um dispositivo de liberação de P4 (Primer
®
), no D4 iniciar a SOV com 8 doses de 
FSH (Folltropin
®
) aplicadas de 12/12 horas, no D6 às 18h se usa PGF2α (Prolise
®
), no D7 
às 18h se retira o dispositivo de liberação de P4, no D8 às 18h usa-se LH (Lutropin
®
), no 
D9 se faz duas IA sendo uma às 6h e outra às 18h. A colheita dos embriões é realizada no 
D15 (Figura 11; TECNOPEC, 2010). Já o protocolo recomendado para SOV em doadoras 
zebuínas é diferente das doadoras taurinas, onde o indutor de ovulação (LH) é aplicado 
com 12 horas de antecedência e as IAs também são adiantadas 12 horas em relação às 
doadoras taurinas (Figura 12; TECNOPEC, 2010). 
 
8 
 
DIA 0 4 5 6 7 8 9 16 
 
MANHÃ 
Inserir 
PRIMER 
+ 3 ml 
RIC-BE 
Folltropin Folltropin Folltropin Folltropin 
 
 IA 
 
Coleta de 
embriões 
 
TARDE 
 Folltropin Folltropin Folltropin 
+ 2 ml 
Prolise 
Folltropin 
Retirada 
PRIMER 
Lutropin IA 
Figura 11 – Protocolo TETF doadoras taurinas; IA = Inseminação Artificial. 
 
DIA 0 4 5 6 7 8 9 16 
 
MANHÃ 
Inserir 
PRIMER 
+ 3 ml 
RIC-BE 
Folltropin Folltropin Folltropin Folltropin 
 
Lutropin IA 
 
Coleta de 
embriões 
 
TARDE 
 Folltropin Folltropin Folltropin 
+ 2ml 
Prolise 
Folltropin 
Retirada 
PRIMER 
IA 
Figura 12 – Protocolo TETF doadoras zebuínas; IA = Inseminação Artificial. 
 
Convencionalmente, a indução da superovulação em vacas doadoras de embriões é 
realizada aplicando, por via intramuscular, doses decrescentes de FSH, duas vezes ao dia, 
durante quatro dias (duração da fase folicular do ciclo estral). A aplicação de doses 
decrescentes tem por objetivo mimetizar a queda fisiológica do FSH durante a fase 
folicular, melhorando a resposta superovulatória. 
 
Colheita, rastreamento e classificação de embriões: 
A colheita normalmente é realizada com o animal em posição quadrupedal, por 
método transcervical. Realiza-se anestesia epidural, utilizando-se 2 a 4 ml de lidocaína 2% 
e limpeza do reto e assepsia da região vulvar. Utiliza-se um cateter de silicone contendo 
um balão inflável na sua extremidade, guiado inicialmente por um mandril de metal em seu 
lúmen para torná-lo rígido, para que o cateter seja introduzido e posicionado em um dos 
cornos uterinos. Remove-se o mandril e infla-se o balão com 10 a 20 ml de ar, para evitar 
refluxo de líquido durante a lavagem. O balão deve estar no terço médio do útero, para que 
a lavagem seja realizada no terço final. O cateter é acoplado a um equipo ligado a uma 
bolsa de um litro de PBS e a um filtro próprio para embriões. Todo o equipamento está 
disponível comercialmente com custos acessíveis. Cada corno uterino é lavado 
aproximadamente 10 vezes, utilizando-se 500 ml de PBS para cada (Figura 13). O PBS 
deve estar numa temperatura de 25 a 30 ºC. Manter 2-3 cm de líquido no filtro para as 
estruturas não grudarem no fundo. O filtro comas estruturas deve seguir para o laboratório. 
 
Figura 13 – Lavagem uterina para coleta de embriões 
9 
 
O conteúdo do filtro é transferido para placa de Petri previamente quadriculada para 
procura dos embriões. Realizam-se duas procuras completas removendo todas as estruturas 
viáveis e inviáveis encontradas. Os embriões viáveis encontrados devem ser avaliados e 
classificados segundo os critérios da IETS (International Embryo Transfer Society; 
STRINGFELLOW e GIVENS, 2010): 
EXCELENTE ou BOM (Grau I) – estágio de desenvolvimento corresponde ao 
esperado; massa embrionária simétrica e esférica com blastômeros individuais que são 
uniformes em tamanho, cor e densidade; forma regular, a Zona Pelúcida (ZP) não deve 
apresentar superfície côncava ou plana, deve ser lisa e, preferencialmente intacta; menos de 
15% de células extrusadas. 
REGULAR (Grau II) – estágio de desenvolvimento corresponde ao esperado; forma 
regular, ZP intacta ou não, irregularidades moderadas na forma geral da massa embrionária 
ou no tamanho; pelo menos de 50% das células compõem massa embrionária viável; 
menos de 15% de células extrusadas. 
POBRE (Grau III) – estágio de desenvolvimento não corresponde ao esperado; 
irregularidades maiores na forma geral da massa embrionária ou no tamanho; menos de 
75% das células degeneradas; pelo menos 25% das células compõem massa embrionária 
viável. 
MORTO OU DEGENERADO (Grau IV) – estágio de desenvolvimento não 
corresponde ao esperado, embrião em degeneração; massa embrionária de menos de 25% 
de todo material celular presente no interior da ZP. 
 
Transferência dos embriões: 
Somente embriões classificados como grau I a III devem ser transferidos para 
receptoras. A transferência, de preferência deve ser realizada por via transcervical. O 
embrião precisa ser previamente acomodado no centro de uma palheta de 0,25ml, como 
mostra a Figura 14. 
 
 
 
Figura 14 – Esquema de palheta contendo embrião. 
 
As receptoras devem estar sincronizadas com a idade do embrião, ou seja, se o 
embrião tem 7 dias, a receptora deve ter ciclado 7±1 dias atrás. Antes de transferir os 
embriões, avaliar o CL da receptora, confirmando assim a ovulação. A TE ou inovulação 
consiste na deposição do embrião no terço médio-final do corno uterino ipsilateral ao 
corpo lúteo. Utilizando aplicador semelhante ao utilizado na inseminação artificial, passa-
se a cérvix, realizando-se a inovulação o mais cranialmente possível, na luz do corno 
uterino ipsilateral ao CL. 
 
 
 
 
 
10 
 
Produção in vitro de Embriões Bovinos 
 
As diversas vantagens e aplicações da produção in vitro de embriões (PIV) estão 
relacionadas à: determinação e controle do sexo dos produtos; aumento da eficiência dos 
programas de produção; rápidas e melhores possibilidades para executar programas de 
cruzamento; avaliação do efeito materno sobre a descendência; rápida multiplicação de 
raças; facilidade de importação e exportação de material genético da fêmea; formação de 
bancos de gametas congelados; aumento da eficiência do sêmen congelado de alto valor 
genético; e estudo e desenvolvimento de outras biotécnicas reprodutivas a partir da 
micromanipulação de gametas e embriões (GONÇALVES et al., 2002). 
 
Coleta dos Complexos cumulus oócitos (COC’s): 
O advento da aspiração folicular in vivo ou OPU (ovum pick up; Figura 15) e o 
aprimoramento das condições de cultivo in vitro tornaram viável à aplicação da PIV em 
escala comercial (Gonçalves et al., 2007). Os índices atuais de blastocistos obtidos com a 
técnica de produção in vitro de embriões giram em torno de 20 a 50% (média de 35%). 
Segundo Gonçalves et al. (2002), cada fêmea bovina é capaz de produzir 50 a 100 
embriões/ano, com um regime de duas punções semanais por doadora, durante vários 
meses. 
A OPU apresenta maior flexibilidade em relação a TE, pois permite a obtenção de 
oócitos de fêmeas a partir dos 6 meses de idade (ainda com resultados inferiores nessa 
idade), de vacas prenhes até o terceiro mês de gestação ou mesmo após o parto. 
A aspiração folicular duas vezes por semana produz maior percentagem de embriões 
grau 1 e maior número de embriões transferíveis do que aspirações realizadas uma vez por 
semana (GIBBONS et al., 1994). No entanto, a aspiração folicular semanal de animais da 
raça Nelore pode produzir um bezerro por semana via PIV (WATANABE et al., 1998), 
isso demonstra a capacidade da associação OPU/FIV em multiplicar de maneira rápida e 
eficiente animais geneticamente superiores. 
 
 
Figura 15 – Esquematização da metodologia de Ovum pick up (OPU). 
 
Classificação de oócitos: 
Os complexos cumulus-oócito (COC´s) colhidos devem ser separados em quatro 
categorias, de acordo com as características baseadas na compactação e transparência das 
células do cumulus e homogeneidade e transparência do ooplasma, utilizando o sistema de 
classificação descrito por Leibfried e First (1979). Consideram-se COCs viáveis os de 
classificação I a III, sendo os COCs de classe IV descartados. 
11 
 
Grau I: Oócitos com cumulus compacto e mais de três camadas de células. Ooplasma 
com granulações finas e homogêneas, preenchendo o interior da zona pelúcida e de 
coloração marrom (Figuras 16A e 17). 
Grau II: Oócitos com menos de três camadas de células do cumulus oophorus. 
Ooplasma com granulações distribuídas heterogeneamente, podendo estar mais 
concentradas no centro e mais claras na periferia ou condensadas em um só local 
aparentando uma mancha escura. O ooplasma preenche todo espaço interior da zona 
pelúcida (Figuras 16B e 17). 
Grau III: Oócitos que possuem o cumulus presente, mas expandido. Ooplasma 
contraído, com espaço entre a membrana celular e a zona pelúcida, preenchendo 
irregularmente o espaço perivitelino, degenerado, vacuolizado ou fragmentado (Figura 
16C). 
Grau IV: Oócitos desnudos sem células do cumulus, citoplasma com cor e 
granulação anormais ou com células expandidas com aspecto apoptótico (Figura 16D). 
 
 
Figura 16 – Classificação de oócitos (STRINGFELLOW e GIVENS, 2010). 
 
Figura 17 – Oócitos graus 1 e 2. 
 
Maturação in vitro: 
Para que o oócito seja capaz de ser fecundado e posteriormente se desenvolver até o 
estágio de blastocisto, precisa ser maturado e, durante essa fase, sofrer diversas 
transformações tanto em seu citoplasma quanto em seu núcleo. Durante todo o seu 
desenvolvimento, o oócito se encontra no estágio diplóteno da prófase I, o reinício da 
meiose, ou maturação, tem início após o pico pré-ovulatório de LH durante o estro. A 
retirada do oócito do contato com as células foliculares, in vitro, é suficiente para dar início 
ao processo de maturação nuclear. A maturação nuclear do oócito compreende a 
progressão do estágio diplóteno prófase I até a fase de metáfase II. O período de maturação 
in vitro varia de 18 a 24 horas em atmosfera controlada contendo 5% de CO2 em ar e 
umidade saturada (GONÇALVES et al., 2007). 
12 
 
Diferentes condições de cultivo e protocolos já foram testadas in vitro para a 
maturação de oócitos, vários meios de maturação, tais como fluído sintético de oviduto 
(SOF; GANDHI et al., 2000;), Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), Ham’s F-10, 
Ham’s F-12 (SMETANINA et al., 2000) e meio de cultivo tecidual 199 (TCM 199), têm 
sido utilizados. 
 
Fertilização in vitro: 
O co-cultivo (espermatozoide e oócito) é realizado em temperatura de 39°C, 
atmosfera com 5% de CO2 e umidade saturada. Os espermatozoides viáveis contidos em 
uma palheta de sêmen precisam ser separados do plasma seminal, crioprotetores, 
extensores e dos espermatozoides mortos antes de serem co-cultivados com os oócitos. Em 
bovinos, o métodode separação espermática mais utilizado é o gradiente de PERCOLL. 
Após a separação, os espermatozoides são diluídos a uma concentração de 1 a 5 x 10
6
 
sptz/ml de meio (GONÇALVES et al., 2007). 
 
Cultivo in vitro de embriões: 
O co-cultivo de embriões com células somáticas foi utilizado por muitos anos com 
bons resultados. Entretanto, esse sistema tem sido substituído ao longo do tempo por 
sistemas mais simples que utilizam meios semi-definidos como os meios Charles 
Rosenkrans-1 (CR-1), Charles Rosenkrans-2 (CR-2; ROSENKRANS et al., 1993), meio 
simples otimizado enriquecido com potássio (KSOM) e fluído sintético de oviduto (SOF) 
associados a uma atmosfera gasosa controlada contendo baixa tensão de oxigênio 
(GONÇALVES et al., 2007). Fatores de crescimento como o semelhante à insulina (IGF-1) 
e fator de crescimento e transformação β1 (TGFβ1) têm sido adicionados ao meio de 
cultivo in vitro objetivando melhorar o desenvolvimento embrionário (MATSUI et al., 
1997). 
O tempo de cultivo in vitro varia de 7-9 dias, em temperatura de 39ºC com atmosfera 
controlada (5% de CO2) e umidade saturada. A taxa de blastocistos geralmente é avaliada 
no 7º dia de cultivo in vitro e a taxa de eclosão in vitro no 9º dia (GONÇALVES et al., 
2007). 
 
Micromanipulação de Embriões 
 
A produção de animais geneticamente idênticos é de grande utilidade à indústria 
pecuária, principalmente por aumentar o número de descendentes de pais geneticamente 
valiosos. Além disso, o uso de animais monozigóticos em vários estudos comparativos 
reduziria substancialmente o número de animais necessários para a geração de dados 
estatisticamente válidos (YANG e ANDERSON, 1992). 
 
Bipartição de embriões 
Apenas 25% da massa celular total do embrião são requeridas para manter sua 
viabilidade embrionária. Neste caso, embriões bipartidos podem manter ainda razoável 
capacidade de desenvolvimento (WILLADSEM e POLGE, 1981). 
13 
 
A bipartição de embriões com finalidades comerciais iniciou-se em meados da 
década de 80 (BAKER e SHEA, 1985). A partir deste período, vislumbrou-se a 
possibilidade de aumentar a progênie de machos e fêmeas pela colheita e posterior 
bipartição de embriões. A bipartição de embriões permite aumentar o número de bezerros a 
partir de menor número de embriões (TORRES et al., 2012). 
Com o auxílio de um estereomicroscópio com base de transiluminação acoplado a 
um dispositivo de micromanipulação mecânico, cada estrutura é posicionada de forma a 
permitir uma divisão o mais equitativa possível da massa embrionária, objetivando a 
separação do embrião em duas metades com a maior semelhança. Este procedimento 
simplificado de bipartição embrionária utiliza lâmina metálica de microcirurgia (Figura 18) 
(FERNANDES et al., 2007). Os embriões podem ser bipartidos nas fases de mórula, 
blastocisto inicial e blastocisto (OLIVEIRA et al., 2012). Embriões na fase de mórula 
podem ser bipartidos em qualquer sentido. Aqueles na fase de blastocisto são divididos de 
forma a se obter metades equitativas da blastocele e botão celular. 
 
 
Figura 18 – Sequência de bipartição de uma mórula. 
 
Separação de Blastômeros: 
A totipotência dos blastômeros isolados ou em grupos pequenos já foi relatada, 
principalmente com células originadas de embriões de 2 a 8 células. Para embriões com 
estágio de desenvolvimento mais adiantado a totipotência é dependente de um grupo maior 
de células (WILLIANS et al., 1984). 
A separação dos blastômeros de embriões de 2 a 8 células pode ser obtida pela 
ruptura da zona pelúcida e posterior proteólise ou separação mecânica. Uma vez rompida a 
zona pelúcida, os blastômeros podem ser separados por repetidas pipetagens em meio de 
cultivo apropriado. Os blastômeros de embriões bovinos de oito células produzidos in 
vitro, mesmo após separação em duas metades, mostraram a mesma capacidade de 
desenvolver para o estágio de blastocisto quanto os embriões de oito células intactos. Além 
disso, uma alta taxa de gestação foi obtida com a transferência desses blastocistos 
(TAGAWA et al., 2008). 
Considerações finais 
 
A utilização e o desenvolvimento de biotécnicas da reprodução de bovinos permitem 
o aumento da eficiência produtiva e reprodutiva. O número de descendentes deixados por 
uma fêmea ao longo de sua vida aumentou com o aperfeiçoamento das técnicas de TE, PIV 
e Bipartição. Contudo, embora as técnicas apresentem resultados satisfatórios, pesquisas 
ainda são requeridas objetivando redução dos custos da produção de embriões, ainda 
proibitivos para a grande maioria dos proprietários. 
14 
 
 
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