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Histórico Desde a antiguidade povos como os egípcios, gregos e romanos conheciam a arte de talhar e polir cristais de rochas e usam essas primeiras lupas primitivas como objetos decorativos. No entanto, somente em meados do século XIII, um monge chamado Alejandro Spina divulgou o segredo e a construção da fabricação de lentes corretivas. Os primeiros estudos científicos datam do século XVII conduzidos por Johanes Kepler que estudou os fenômenos óticos e a formação de imagens no olho. Atanásio Kircher (1601-1680) foi o primeiro a usar a palavra microscopium, nome dado ao microscópio daquela época. Muitos atribuem a invenção do microscópio a Galileu, porém foi Antonievan Leeuwenhoek, (1632-1723), quem realmente aperfeiçoou o instrumento e o utilizou na observação de seres vivos. Seu microscópio era dotado de apenas uma lente de vidro, permitindo um aumento de até 300 vezes. Com este instrumento Leeuwenhoek estudou os glóbulos vermelhos do sangue e constatou a existência dos espermatozóides. Robert Hooke, em 1665 publicou seu livro intitulado “Micrographia”onde descreveu o microscópio e como ele havia descoberto a circulação do sangue nos peixes. Em seu microscópio, Robert Hooke incorporou o ajuste fino e acrescentou mais uma lente. Após o aprimoramento, os microscópios ficarão constituídos por 2sistemas de lentes de cristal (oculares e objetivas) que produzem ampliações de imagem que vão em geral de 100 a 1000 vezes. Em 1932, surgiu o microscópio eletrônico permitindo aumentos de 5 mil a 500 mil vezes. A diferença básica entre os microscópios ótico e eletrônico é que neste último não é utilizada a luz, mas sim feixes de elétrons. No microscópio eletrônico não há lentes de cristal e sim bobinas, chamadas de lentes eletromagnéticas. Na história da microscopia, 200 anos foram necessários para que o microscópio deixasse de se ser um instrumento exótico e pouco acessível para ser usado em uma escala mais ampla. Então, a partir do séc. XIX, graças aos estudos realizados por microscopistas puderam afirmar o conceito de célula como verdade científica, surgindo a ciência da biologia celular. Unidades de medida utilizada em microscopia Em geral, podem-se dividir as unidades de estruturas biológicas em macroscópicas e microscópicas, sendo essa última invisível a olho humano nu. As unidades de medida em microscopia compreende o micrômetro, em microscopia ótica e o nanômetro e o angstrom, na microscopia eletrônica. Unidade de medida Símbolo Valor micrômetro 1 μm 0,001 mm nanômetro 1 ηm 0,000001 mm angstrom 1 Å 0,0000001 mm O aumento total do objeto observado é calculado multiplicando-se os valores do aumento da objetiva e da ocular. Ocular Objetiva Aumento 10x 10x(pequeno aumento a seco) 100x 10x 40x(grande aumento a seco) 400x 10x 100x(imersão em óleo) 1.000x Componentes do microscópio Adicionalmente, o microscópio apresenta uma base mecânica (base,braço, revólver, platina, charriot, parafusos macro e micrométrico e parafuso de regulagem do condensador) e um sistema de iluminação (fonte luminosa,diafragmas, condensador e filtros). Partes constituintes do microscópio de luz, em que (A) compõem o sistema ótico e (B) o sistema mecânico : -Partes mecânicas > O pé ou Base – suporta o microscópio, assegurando a sua estabilidade; > Braço ou Coluna – peça fixa à base, na qual estão aplicadas todas as outras partes constituintes do microscópio; > Tubo ou Canhão – cilindro que suporta os sistemas de lentes, localizando-se na extremidade superior a ocular e na inferior o revólver com objetivas; > Platina – peça circular, quadrada ou retangular, paralela à base, onde se coloca a preparação a observar, possuindo no centro um orifício circular ou alongado que possibilita a passagem dos raios luminosos concentrados pelo condensador; >Condensador – ajuda a focar a luz sobre a amostra analisada. É particularmente útil quando utilizado em conjunto com as lentes objetivas mais poderosas; >Diafragma – controla a intensidade e o tamanho do cone de luz projetado sobre o espécime. Como uma regra geral, quanto mais transparente o espécime, menos luz é requerida; > Charriot – possui uma pinça que prende a lâmina e a movimenta de um lado para o outro, permitindo uma análise da lâmina como um todo; > Parafuso Macrométrico – engrenagem que suporta o tubo e permite a sua deslocação a da platina, indispensável para fazer a focagem; > Parafuso Micrométrico – imprime ao tubo ou à platina movimentos de amplitude muito reduzida, completando a focagem. Permite explorar a profundidade de campo do microscópio; > Revólver – disco adaptado à zona inferior do tubo, que suporta duas a quatro objetivas de diferentes ampliações: por rotação é possível trocar rápida e comodamente de objetiva. -Partes ópticas e de iluminação >Lentes oculares – contêm as lentes oculares, as quais fornecem um poder de aumento de 10x a 15x, geralmente. É por aqui que você olha através; >Lentes objetivas – geralmente, há três ou quatro lentes objetivas em um microscópio, consistindo de poderes de aumento de 4x ou 5x , 10x, 40x e 100x. A fim de obter o aumento total de uma imagem, você precisa multiplicar o aumento das lentes oculares pelo aumento das lentes objetivas; >Fonte de luz – projeta luz para cima através do diafragma, lâmina e lentes. -Formação da imagem em um microscópio óptico O microscópio composto é um instrumento óptico que permite obter imagens virtuais de pequenos objetos com bastante ampliação, superando os aumentos fornecidos pelas lupas. Os componentes básicos de um microscópio composto são duas lentes convergentes: a objetiva, dirigida para os objetos, e a ocular, orientada para o olho do observador. A objetiva, posicionada diante do objeto, forma uma imagem real, invertida e ampliada do mesmo. A ocular funciona como uma lupa que amplia a imagem não do objeto inicial mas de uma imagem intermédia formada pelo sistema de lentes da objetiva, formando uma imagem virtual e ampliada da imagem formada pela objetiva. A imagem observada pelo olho humano quando olhamos através da ocular do microscópio óptico, resulta assim numa imagem ampliada, virtual e invertida (em ambos os sentidos) em relação ao objeto. -Tipo de microscópio > Microscopia de campo claro O microscópio de campo claro é o mais comum microscópio de luz. Nesse microscópio, o campo de visão aparece iluminado e os objetos que estão sendo observados apresentam-se mais escuros. Segundo Weiss et al., a microscopia de campo claro apresenta algumas vantagens como menor toxicidade por necessitar de menores concentrações de corantes; baixo contraste, devido ao uso de baixas concentrações de cromóforos naturais ou especialmente corantes vitais, pode ser grandemente aumentados; observações feitas no comprimento de onda de máxima absorção aumentam o contraste. Entretanto, apresenta algumas limitações como objetos de fase exibem mínimo contraste em foco e mostra contraste oposto por cima e abaixo do foco. Em aplicações biológicas, a observação de campo claro é amplamente usada para espécimes manchados, naturalmente pigmentados ou altamente contrastados montados em uma lâmina de microscópio de vidro. O espécime é iluminado por baixo e observado por cima . A luz viaja ao longo do eixo óptico, através da objetiva em direção à amostra que está sendo observada. A amostra então é vista pela luz que ela reflete. Filtros especiais são utilizados para abrandar a luz e aumentaro contraste. Esta técnica é muito usada na patologia para visualizar seções de tecido fixas ou filmes/sujeiras de células. O processamento de imagem de campo claro não é muito útil para células vivas não manchadas ou seções de tecido não manchados, pois na maioria dos casos, a luz passa através de amostras transparentes ou translúcidas com pouca ou nenhuma definição de estrutura. > Microscopia de campo escuro Microscópio utilizado para visualizar materiais muito pequenos como plâncton, bactérias e cristais. É um tipo de microscopia utilizada na observação de microorganismos não corados, suspensos em líquidos, preparações a fresco e em gota pendente. As imagens obtidas no campo escuro apresentam grande contraste e este pode ser ampliado pelo uso de sinal de vídeo. Baseia-se no princípio de que a luz é dispersa pela superfície dos materiais que possuem diferentes índices de refração. A luz dispersada entra na objetiva e o objeto aparece iluminado e brilhante sobre um fundo escuro. Tal consegue-se pela utilização de um tipo especial de condensador que ilumina o objeto obliquamente. A luz atinge o espécime a ser analisado e somente os feixes desviados pelo objeto percorrem o resto do sistema, isto é,objetivas e oculares, formando a imagem. A luz é direcionada para o exterior do cone que a objetiva compreende para iluminar a lâmina obliquamente. Somente a luz que é refletida ou difratada pelas características da amostra entra na objetiva. Assim, a amostra aparece como um fundo preto com as características refletidas ou difratadas aparecendo com brilho. A iluminação de campo escuro aumenta a visibilidade de detalhes que são freqüentemente ignorados pela iluminação de campo claro. Mesmo detalhes estruturais pequenos, que se encontram abaixo do limite de resolução da objetiva, são visíveis com campo escuro (esta maior visibilidade, que é mais parecida com a observação das estrelas mais distantes à noite, não é um aumento na resolução). A microscopia de campo escuro é uma técnica excelente para uma varredura rápida, com um amplo campo de visão, para partículas, ranhuras ou resíduos químicos . > Microscopia de contraste de fase Esse tipo de microscopia foi desenvolvida pelo holandês Zerniké, na década de 50, baseada nos princípios de difração da luz, isto é, o caminho do feixe luminoso, na formação da imagem por esse tipo de microscópio, sofre um retardo óptico, permitindo assim que se possa observar materiais biológicos sema coloração. Portanto, o microscópio de contraste de fase dispõe de certos recursos específicos para estudar células vivas e não coradas, particularmente útil para o estudo da mitose em células cultivadas in vitro, e exames rápidos de culturas de células, sangue, bactérias, algas, protozoários de ambientes aquáticos, conteúdo estomacal de animais, análise de materiais cerâmicos, têxteis e minerais. Então, grande parte dos detalhes de células vivas não são detectados no microscópio de campo luminoso devido ao fato de as estruturas celulares serem transparentes e incolores, não apresentando contraste suficiente. Contudo, o microscópio de contraste de fase tem um sistema óptico especial que torna possível a distinção de materiais biológicos que diferem ligeiramente no que se refere aos seus índices de refração. A luz que passa através de materiais com densidades ligeiramente diferentes é refratada ou desviada do seu trajeto original. Variações mínimas de fase, devidas às diferenças de índice de refração dentro do objeto, são ampliada se transformadas em mudanças de amplitude (intensidade) as quais são visualizadas como diferenças de contraste na imagem. O microscópio de contraste de fase apresenta sistemas de anéis metálicos postos no caminho da luz. Um na lente condensadora e outro nas objetivas. Uma singular particularidade é que as objetivas de fase apresentam a designação “Ph”,oriunda da palavras phase, diferenciando-a das demais. Esses anéis, após centralizados, promovem o retardo óptico, permitindo assim a visualização do espécime sem coloração. > Microscopia de contraste interferencial A microscopia interferencial mais conhecida é a chamada de microscopia de Normarski. A geração do contraste a uma alta abertura de trabalho é limitada em uma profundidade de campo raso, resultando na habilidade de tornar a seção com alto contraste de 200 a 300 nm de espessura. Esse tipo de contraste interferencial trabalha com a defasagem dos comprimentos de ondas. Assim, a defasagem gera uma deformação na imagem, permitindo o contraste interferencial, aumentando a superfície do material analisado. A aplicação dessa microscopia permite a observação de materiais biológicos sem coloração, sendo útil no monitoramento de culturas celulares, estudo de morfologia, taxonomia de pequenas larvas e ácaros e outros ectoparasitos. Esse tipo de microscopia utiliza-se de prismas ópticos posicionados na passagem da luz. Esses prismas modificam as fases luminosas que contrastarão com o meio em que se encontra o material a ser observado. Esse microscópio requer uma construção específica, apesar de não utilizar lentes objetivas especiais, ele necessita de um revólver com ranhuras para alojar os prismas de interferência, então as cores de interferência promoverão a visualização da imagem. >Microscopia de fluorescência A microscopia de fluorescência é, provavelmente, a mais versátil e poderosa técnica para localizar proteínas dentro da célula pela microscopia de luz. Fluorescência é a propriedade de algumas substâncias para, após serem excitadas com radiação de baixo comprimento de onda, emitirem radiação de maior comprimento de onda. Algumas substâncias absorvem a energia da radiação ultravioleta emitindo depois radiação dentro do espectro de luz visível. Microorganismos corados por um corante fluorescente aparecem como objetos luminosos quando observados com luz ultravioleta. É com os recursos desta técnica que se evidenciam, por exemplo, os antígenos quando associados a anticorpos acoplados a moléculas fluorescentes, e quantifica-se pelo processo de fluorometria os objetos de estudo da citoquímica normal e patológica. O mais fluorescente corante é chamado de fluorocromo, capaz de emitir luz visível. Dois exemplos de fluorocromo é o corante alaranjado de acridina que se liga aos ácidos nucléicos conferindo uma fluorescência amarelo esverdeada ao DNA e avermelhada ao RNA, e a eosina, que apesar de não ser um fluorocromo se comporta como tal, aumenta a fluorescência natural da elastina. Os fluorocromos, quando conjugados com anticorpos, torna possível a identificação de células individuais que reagem com o anticorpo (aplicação designada de imunofluorescência). Os fluorocromos podem se combinar com estruturas celulares, tornando-as fluorescentes, tornando-as passíveis de identificação e localização, como proteínas ou estruturas celulares. O microscópio de fluorescência utiliza um sistema óptico que interage pouco com a luz. Utiliza-se uma luz de mercúrio de alta pressão, cujos picos variam entre 312 e 579 nm. Nessa microscopia também há filtros especiais chamados de filtros de excitação e filtros de barragem. Os filtros de excitação localizam-se logo após a saída de luz antes do condensador, selecionando o comprimento de onda desejado. Já, os filtros de barragem localizam-se entre a objetiva e a ocular, após o objeto, deixando passar somente a luz fluorescente, então o material fluoresce contra um fundo escuro. >Microscopia de varredura confocal A microscopia de varredura confocal representa um dos mais importantes avanços da microscopia de luz já desenvolvida, principalmente, porque é uma técnica capaz de visualizar em profundidade células e tecidos vivos e fixados. O espécime é escaneado com uma série de muitos estreitos campos de visão, as imagens destes campos são recuperadas individualmente, e depois deestocadas, a imagem completa é construída como um mosaico de partes combinadas. O microscópio de varredura confocal é indicado para estudos de materiais espessos, sem coloração prévia, vivos ou pré-fixados. Essa microscopia permite o detalhamento de estruturas subcelulares que não apresentam limite de resolução compatível ao da microscopia de luz fluorescente convencional, como microtúbulos, elementos fibrilares do citoesqueleto e elementos finos da matriz celular. Nesse microscópio, a imagem pode ser obtida de planos focais específicos ou cortes ópticos. Os cortes ópticos são transferidos para um computador e são reconstruídos tridimensionalmente deforma a obter uma imagem no total. Logo, os microscópios tradicionais trabalham com imagem analógica, e os confocal a laser trabalham com imagens digitais. O microscópio de varredura confocal utiliza como fonte de luz o laser,sendo seu funcionamento complexo. Seu sistema óptico é o mesmo da de fluorescência tradicional, com exceção de que a iluminação se dá somente em pequenos pontos iluminados pelo laser. Acima da objetiva existe um orifício chamado pinhole ou íris que elimina a luz proveniente de objetos que estejam fora do plano focal. >Microscopia de polarização Esse microscópio apresenta dois prismas, ou filtros, chamados depolarizador e analisador. Esses filtros se posicionam entre a fonte de luz e o condensador (filtro polarizador) e entre a objetiva e a ocular (filtro analisador. Os filtros polarizadores promovem a seleção de apenas um plano de direção de vibração de ondas luminosas, conhecido por plano da luz polarizada(PPL). Sob o efeito do PPL, os componentes macromoleculares birrefringentes(anisotrópicos) apresentam brilho colorido ou não, promovendo um realce destes materiais em detrimento a outros não birrefringentes (isotrópicos), que se distinguem em fundo escuro. Os materiais biológicos mais estudados na microscopia de polarização citam-se células musculares estriadas, espermatozóides, paredes celulares, amido, colágenos e DNA. Em estudos com o colágeno, pode-se aumentar sua birrefringência utilizando-se de corantes como, Xylidine Ponceaus ou Picrossírus. Um outro corante, que se presta a estudos anisotrópicos, é o azul de toluidina, permitindo estudos de ordem e agregação molecular da cromatina,da matriz extracelular e outros componentes. - Comparativo das estruturas dos tipos de microscopias microscópio de campo escuro microscópio de contraste de fase microscópio de contraste de fase interferencial microscópio de fluorescência microscópio de varredura confocal microscópio de luz polarizada
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