Resumo 1

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MICROBIOLOGIA – 1ª PROVA
Ágar: agente geleificante obtido a partir de algas marinhas.
Meios de cultura: é um conjunto de substâncias capazes de promover o crescimento de organismos em condições de laboratório.
Classificação:
Quanto à composição do meio (conteúdo químico):
- Meio quimicamente definido: os constituintes químicos são adicionados em quantidades conhecidas e precisas, ou seja, é aquele meio que se sabe o que tem e quanto tem, sendo assim “caracterizado” qualita e quantitativamente. Ex: ágar Mac Cokey, CLED.
- Meio quimicamente indefinido ou complexo: é formado por digestão proteica, sangue, leite, soro, onde não se sabe o que tem e/ou a quantidade, sabe-se apenas aproximadamente sua composição. Ex: ágar sangue e ágar chocolate.
Obs: em sua composição tem algum extrato como de levedura, de carne, de peptona.
Quanto à consistência:
- Sólido: contém uma grande quantidade de ágar (1-1,5g, 15g, 17g); é utilizado para obtenção de colônias puras isoladas, sendo possível detectar (através de estrias múltiplas) várias características macroscópicas da colônia (cor, aspecto), observar possível contaminação, visualizar infecção mista ou não, além de propriedades bioquímicas da bactéria (fermentação).
- Semi-sólido: contém uma quantidade média de ágar (0,05-0,5g, 3g, 5g); é utilizado para observar a motilidade, constatando se as mesmas possuem ou não flagelos para poderem ser classificadas como móveis ou imóveis.
- Líquido: não tem ágar; são os conhecidos caldos e são utilizados para observação do crescimento através de turvação.
Quanto a utilização em laboratório:
- Meio seletivo: em sua composição química contém substâncias que inibem o crescimento de determinado grupo de bactérias e favorecem o crescimento de outro grupo que se deseja isolar. Ex: Manitol salgado, Mac Cokey, EMB.
- Meio diferencial: dentro de um grupo já selecionado esse meio é capaz de diferenciar gênero e espécies de bactérias desse grupo, através de diferenciação presuntiva por coloração ou morfologia. Ex: Manitol salgado, Mac Conkey, EMB, TCBS.
Obs: todo meio diferencial é seletivo, mas nem todo meio seletivo é diferencial.
- Meio enriquecido: meio no qual são adicionadas substâncias, geralmente nutritivas, que promovem o crescimento de bactérias exigentes nutricionalmente ou fastidiosas. Ex: Ágar sangue e ágar chocolate.
- Meio de enriquecimento: contém excesso de nutrientes, sendo usado para manter amostras que estão “se perdendo”, ou seja, quando o microorganismo não se encontra nas melhores condições metabólicas, favorecendo assim o crescimento das bactérias. Ex: geralmente são os caldos como, BHI, caldo selenito, tetrationato.
- Meio indicador: é utilizado no estudo das propriedades bioquímicas das bactérias, auxiliando, assim, na sua identificação. Ex: TSI, citrato, fenilalanina, lisina, SIM.
- Meio de transporte: são géis utilizados para transportar amostras, é isento de nutrientes, não promovendo o crescimento de colônias, geralmente mantém o pH favorável, previne a desidratação de secreções e evita a oxidação e auto-destruição enzimática dos patógenos presentes durante o transporte do meio, ou seja, permite que a bactéria esteja viável até a chegada no laboratório. Ex: Meio de Stuart e Meio de Cary-Blair.
- Meio de manutenção: utilizado para estocar bactérias, mantendo as colônias viáveis por um determinado período. Ex: Ágar nutriente.
- Meio de isolamento: utilizado para isolamento, diferenciação e enumeração de espécies. Ex: Ágar CLED (urina).
- Meio para teste de sensibilidade: utilizado na realização de teste de sensibilidade. Ex: Ágar Mueller Hinton (antibióticos).
Meios:
- Mac Conkey: é seletivo, pois cresce gram negativo, e diferencial, pois diferencia fermentador de não fermentador através da fermentação da lactose (lactose + fica rosa).
- Manitol salgado: é seletivo, pois cresce o gênero estafilococos, e diferencial através da fermentação do manitol (manitol + fica amarelo).
- Mueller Hinton: meio base utilizado para teste de sensibilidade, como o antibiograma. Tem componentes que favorecem o crescimento tanto de gram positivo quanto de gram negativo.
- TSI (laranja): é utilizado para observar a fermentação de carboidratos (lactose, sacarose e glicose), a produção de sulfeto de hidrogênio (H2S) e se há produção de gás.
A glicose fica no fundo do tubo, se ocorrer fermentação, fica amarelo, sendo glicose (+). A lactose e a sacarose ficam na inclinação do meio, se ocorrer fermentação, também fica amarelo, sendo lactose (+) e sacarose (+), ou seja, se todo o meio ficar amarelo, ocorreu a fermentação de todos os carboidratos.
Se o fundo do tubo ficar preto ou enegrecido, significa H2S (+), logo, indica também glicose (+), pois a produção de sulfeto de hidrogênio só ocorre em meio ácido, pois o sulfeto de hidrogênio é incolor e ao reagir com íons de ferro, produz cor enegrecida, indicando assim uma prévia fermentação naquele local.
Se ocorrer desprendimento do meio no fundo do tubo, formação de bolhas ou o meio se rachar indica que houve produção de gás.
Se alguma porção do meio ou por inteiro ficar rosa, significa (-).
Tubo 1: glicose (+), lactose (+) e sacarose (+), produção de gás (+).
Tubo 2: glicose (+), lactose (-) e sacarose (-).
Tubo 3: sulfeto de hidrogênio – H2S (+), glicose (+), lactose (-) e sacarose (-).
Tubo 4: tudo (-).
- Citrato (verde): utilizado para saber se a bactéria vai utilizar o citrato como única fonte de carbono. Caso isso aconteça, ocorre uma alcalinização do meio, e o indicador de pH presente no meio faz com que se torne azul, sendo citrato (+); se não ocorrer mudança de cor é citrato (-).
Tubo 1: citrato (-). Tubo 2: citrato (+)
- Fenilalanina (marfim): utilizado para pesquisar a presença da enzima fenilalanina desaminase, caso a bactéria tenha a enzima, ocorre desaminação da fenilalanina presente no meio, formando ácido pirúvico, que é identificado pelo reativo de cloreto férrico que reage com o ácido conferindo coloração verde ao meio, sendo (+), se não mudar de cor (-).
- SIM (amarelo): é utilizado para observar a produção de sulfeto de hidrogênio (H2S), a presença da enzima triptofanase e consequente formação de indol e, a motilidade.
Se o meio ficar preto ou enegrecido, significa H2S (+).
Quando a bactéria tem a enzima triptofanase, ocorre degradação do triptofano presente no meio, gerando produtos, entre eles o indol, que é identificado pelo reativo de kovacs que reage com o indol dando origem a um anel rosa/vermelho, sendo indol (+). Se não ocorrer a formação de anel é (-).
Quando ocorre o crescimento só no local da picada, significa que a bactéria é imóvel. Se ocorrer crescimento no local da picada e ao redor, provocando turvação, significa que a bactéria é móvel.
Tubo 1: sulfeto de hidrogênio – H2S (+).
Tubo 2: indol (+) e móvel (turvação).
Tubo 3: imóvel (crescimento só na picada).
- Lisina (violeta): é um meio líquido utilizado para pesquisar a presença da enzima lisina descarboxilase, tem glicose, indicador de pH e, óleo mineral que serve para ocluir/vedar a entrada do meio, visto que a reação enzimática só ocorre na ausência de oxigênio.
Quando ocorre a fermentação da glicose (fica amarelo), o produto dessa fermentação ativa a enzima lisina descarboxilase que provoca descarboxilação da lisina, alcalinizando o meio, e o indicador de pH presente no meio faz com que o meio volte a ser lilás (+).
Se a bactéria não tiver a enzima, ocorre apenas a fermentação da glicose e o meio fica amarelo (-).
OBS:
Quando tiver lactose (8g, 10g) na composição o meio é diferencial, logo é seletivo.
Se tiver manitol é diferencial.
Se tiver alta concentração de sal (NaCl) é seletivo.
Todas as provas bioquímicas (lisina, citrato, SIM, TSI, fenilalanina) são indicadores.
Coloração de gram:
Consiste no tratamento sucessivo de um esfregaço bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes cristal violeta, lugol, álcool e safranina/fucsina. Essa técnica permite a separação de amostras bacterianas em gram-positivas (camada de peptideoglicanoé mais espessa) e gram-negativas (camada de peptideoglicano é mais delgada) baseando-se na composição da parede bacteriana, e permitindo determinar a morfologia e o tamanho das bactérias analisadas, sendo assim uma técnica morfotintorial.
É baseado na capacidade das paredes celulares de bactérias gram-positivas de reterem o corante cristal violeta durante o tratamento com álcool, enquanto as paredes celulares de bactérias gram-negativas não o fazem.
- Técnica: 
Em uma lâmina limpa, adiciona-se uma gota de salina. Com a alça bacteriológica devidamente flambada, coleta-se o inóculo do meio de cultura e o espalha sobre a salina com o auxílio da alça, o espalhamento da amostra deve ser feito de modo que todo o conteúdo do inóculo esteja uniforme na lâmina a ser analisada. Em seguida:
Fixação da bactéria: passa a lâmina de 3 a 4 vezes sob o bico de Bulsen até que o líquido contido (bactéria + solução salina) seque, de modo a matar as bactérias existentes no mesmo, proporcionando assim fixação da bactéria à lâmina.
Coloração: com o esfregaço preparado, adiciona-se cristal violeta, corante principal que cora a parece celular, de modo a cobrir todo o esfregaço durante 1 minuto.
Lava-se o esfregaço com água destilada para a retirada do excesso de cristal violeta da amostra.
Fixação da coloração: adiciona-se lugol, que possui a função de mordente, ou seja, aumenta a afinidade do corante pela célula formando um complexo cristal violeta-iodo (iodopararrosanilina), de modo a cobrir todo o esfregaço durante 1 minuto.
Descoloração: adiciona-se álcool absoluto, diferenciador, sua ação permite que algumas células se descorem mais facilmente que outras, a adição do álcool deve ser rápida e precisa, devendo ser colocada até “esgotamento” do corante.
Obs: o álcool dissolve a porção lipídica das membranas externas das bactérias gram-negativas e o complexo cristal violeta-iodo é removido. Já nas bactérias gram-positivas, o álcool desidrata as espessas paredes celulares e provoca a contração dos poros do peptideoglicano, tornando-as impermeáveis ao álcool, o corante é retido e as célula permanecem coradas.
Lava-se novamente a amostra com água destilada.
Contra-coloração: adiciona-se safranina ou fucsina durante 30 segundos, corante secundário, que irá corar as células anteriormente descoradas com o álcool absoluto
Lembrando que todo esse procedimento deve ser realizado dentro da zona de segurança do bico de Bulsen.
Por fim, lava-se a lâmina com água destilada e seca-se delicadamente a amostra de modo a retirar qualquer excesso de água. Colocam-se algumas gotas de óleo de imersão e observa-se a diferenciação das bactérias gram-positivas das gram-negativas ao microscópio óptico, utilizando a lente objetiva de imersão (100 X).
Ao serem observadas no microscópio, as bactérias gram-positivas aparecerão coradas de roxo/violeta, pois devido a sua espessa camada de peptideoglicano são coradas pelo cristal violeta, enquanto as bactérias gram-negativas aparecerão coradas de vermelho/rosa, pois devido a sua camada delgada são descoradas pelo álcool e re-coradas pela safranina ou fucsina.
OBS: não é usada para bactérias ácido-resistentes.
Antibiograma:
Além de orientar a escolha da terapia antimicrobiana mais adequada, o teste de sensibilidade aos antimicrobianos representa uma importante ferramenta no monitoramento da evolução da resistência bacteriana e age também como um método auxiliar na implantação de medidas de controle de bactérias multirresistentes.
Os principais métodos de avaliação são difusão dos discos, diluição em caldo ou ágar, e-test e automatizado.
A automatização tem alto custo, número de diluições pequeno e baixa flexibilidade na escolha dos antibióticos.
Difusão dos discos: consiste no preparo de uma suspensão de bactérias de cultivo recente (escala 0,5 de MacFarland, que consiste na aferição indireta de uma suspensão bacteriana pelo seu grau de turvação), inoculação desta suspensão na superfície de uma placa ágar Mueller Hinton, e adição dos discos de papel impregnados com antimicrobianos. Após incubação em estufa, é analisado o padrão de crescimento ou inibição ao redor de cada disco, sendo então medido o tamanho de cada halo e o resultado pesquisado em tabelas apropriadas segundo a espécie bacteriana em análise. É uma técnica de grande utilização, pois é de fácil execução, escolha dos antibióticos é flexível e o custo operacional é menor.
- Técnica:
Com o auxílio de uma alça bacteriológica, retirar 3 colônias de bactéria isolada em meio de cultura e fazer o repique em caldo Mueller Hinton, TSB ou BHI, ou solução salina estéril e comparar turbidimetricamente com o tubo contendo sulfato de bário correspondente à escala 0,5 de MacFarland.
Introduzir um swab estéril na suspensão, retirar o excesso de líquido nas paredes do tubo e semear pela técnica de distensão na placa de ágar Mueller Hinton em três direções, deixar semiaberta na bancada durante 5 minutos para que ocorra evaporação do caldo e sua absorção pelo meio de cultura.
Inocular os discos contendo antibiótico, não devendo ultrapassar 12 discos nas placas de 150mm e não mais que 5 discos nas placas de 90mm. Flambar a pinça rapidamente, pressionar levemente os discos e não fazer a remoção dos mesmos, pois a difusão de droga é imediata.
Incubar a placa invertida durante 18 à 24 horas na estufa de cultura à 35ºC em aerobiose e se necessário promover atmosfera de CO2 para determinadas bactérias mais exigentes.
Após período de incubação proceder à leitura das placas medindo com paquímetro, halômetro ou régua milimetrada os halos formados correspondentes. Anotar e depois consultar a tabela do CLSI para enquadrar nas categorias sensíveis, pouco sensíveis ou intermediárias, ou resistentes.
Na interpretação dos resultados, considerar os mecanismos intrínsecos e específicos de resistência das bactérias que podem inclusive auxiliar na identificação do microrganismo.
Alguns erros são possíveis como, preparo do meio de cultura, inóculo não padronizado, discos estocados inadequadamente, discos fora da validade, medição incorreta dos halos.
Além disso, têm-se o teste de sensibilidade, o d-test, e o teste quantitativo, o e-test que é uma fita plástica disponível comercialmente, impregnada por concentrações crescentes de antimicrobiano na face ventral e marcada, na face dorsal, com a escala das concentrações testadas a fim de facilitar a leitura do resultado, 
estando baseado na difusão do gradiente antimicrobiano no ágar para a determinação da sensibilidade da amostra bacteriana ao antimicrobiano testado, sendo um teste caro e que apresenta número limitado de antibióticos testados por placa.
Cocos gram-positivos:
Para a identificação é necessário a avaliação preliminar da característica macroscópica e crescimento da colônia microbiológica, bem como a realização do esfregaço e coloração de gram, apresentando-se de forma arredondada (cocos) e com coloração roxa, podendo estar disposto aos pares ou em cadeias (estreptococos) ou em forma de “cachos de uva” (estafilococos). Além disso, pode apresentar β-hemólise (hemólise total das hemácias) ou α-hemólise (hemólise parcial), podendo ainda apresentar γ-hemólise (ausência de hemólise).
Para a identificação e diferenciação dos gêneros de cocos gram-positivos a primeira prova a ser realizada é da catalase, que verifica a presença da enzima catalase que decompõe peróxido de hidrogênio (H2O2) em H2O e O2 (causa desprendimento de bolhas).
Catalase (-): estreptococos ou enterococos.
Catalase (+): estafilococos.
Provas para identificação de estafilococos:
Quando é catalase positiva, a próxima prova a ser realizada é da coagulase, que verifica se o microrganismo possui coagulase, que reagindo com um fator plasmático, forma um complexo que atua no fibrinogênio do plasma formando fibrina, podendo ser produzida duas formas de coagulase, livre (enzima extracelular produzida quando o microrganismo é submetido ao cultivo num caldo) e ligada (fator de aglutinação; permanece ligada à parede da célula domicrorganismo).
Obs: coagulase livre faz em um tubo (formação de coágulo) e a ligada em lâmina (formação de grumos).
Coagulase (-): é do gênero estafilococos (coagulase negativa), mas não é aureus.
Coagulase (+): Staphylococcus aureus.
Para confirmar que é Staphylococcus aureus, faz-se o teste da DNAse, que verifica se o microrganismo possui a enzima desoxiribonuclease, a qual degrada DNA impregnado no meio, caso positivo, após a utilização de um revelador (HCl 1N - normal) é possível verificar a formação de um halo ao redor da estria semeada, pois o HCl precipita os monômeros de DNA.
DNAse (+): Staphylococcus aureus (β-hemólise).
DNAse (-): é do gênero estafilococos (DNAse negativa), mas não é aureus.
Obs: coagulase e DNAse tem correlação genética, portanto, se uma for positiva a outra também será positiva.
Quando a coagulase for negativa, logo DNAse negativa, faz-se o teste da novobiocina, que verifica a resistência do microrganismo a esse antimicrobiano.
Resistente: Staphylococcus saprofhyticus.
Sensível: é outra espécie coagulase (-), que pode ser Staphylococcus epidermides.
Provas para identificação de estreptococos:
Quando a catalase é negativa a próxima prova a ser realizada é da hemólise em ágar sangue.
Quando for β-hemólise faz-se o teste da bacitracina, se for sensível, faz CAMP e PYR, se for resistente faz CAMP e hipurato.
Bacitracina sensível, CAMP (-) e PYR (+): Streptococcus pyogenes
Bacitracina resistente, CAMP (+) e hipurato (+): Streptococcus agalactiae.
Quando for α-hemólise ou γ-hemólise faz-se o teste da optoquina, se for sensível é Streptococcus pneumoniae, se for resistente faz-se a prova da bile-esculina.
Bile-esculina (-): Streptococcus viridans.
Bile-esculina (+): enterococos.
Provas para identificação de enterococos.:
Quando a bile-esculina é positiva faz-se o teste do caldo salgado (6,5% de NaCl) e PYR.
Caldo salgado (+) e PYR (+): enterococos.
Caldo salgado (-): não-enterococos.
Para distinguir os enterococos faz-se a prova da arabinose, que é um açúcar que é fermentado.
Arabinose (+): Enterococcus faecalis.
Arabinose (-): Enterococcus faecium.
Classificação dos estreptococos:
Quanto ao padrão de hemólise:
- α (parcial) 
- β (total) 
- γ (não tem hemólise)
Quanto à sorologia: classificação de Rebecca C. Lancefield de acordo com o antígeno de superfície.
- Grupo A: Streptococcus pyogenes 
- Grupo B: S. agalactiae 
- Grupo C: S.dysgalactiae, equi 
- Grupo D: S. bovis 
- Grupo F: S.milleri 
Quanto a propriedades bioquímicas:
- S pyogenes: catalase (-), aglutinação com anti-soro A, β-hemólise, bacitracina sensível, CAMP (-), PYR (+).
- S. agalactiae: catalase (-), aglutinação com anti-soro B, β-hemólise, bacitracina resistente, CAMP (+), hipurato (+).
- S. pneumoniae: catalase (-), sem aglutinação com anti-soros específicos, α-hemólise, optoquina sensível, bile-solubilidade (+)
Técnicas de coleta:
- Sangue e aspirado de medula óssea: fazer assepsia rigorosa no local da punção e coletar cerca de 5 a 6 ml de sangue venoso, que deverá ser injetado diretamente, em frasco contendo meio de cultura (ver detalhes no próximo ítem). A última gota de material deve ser distendida em uma lâmina de microscopia, para coloração de Giemsa.
- Líquor: fazer assepsia rigorosa no local da punção. Coletar 2 ml ou mais, para exame microscópico e cultura para fungos. Os tubos na rotina hospitalar, devem ser usados na seguinte sequência: 1º exame bioquímico, 2º exame de celularidade, 3º microbiológico, reduzindo assim a possibilidade de isolamento de contaminantes da pele. Entretanto, a coleta da amostra em tubos específicos para cada um desses exames, aumenta a sensibilidade do exame
- Urina: a amostra biológica mais apropriada para o diagnóstico de micose do trato urinário é obtida por sondagem ou citoscopia. Quando não for possível, e para evitar contaminação com microrganismos presentes nas áreas vizinhas, fazer limpeza prévia da região perineal com água e sabão, desprezar o primeiro jato de urina da manhã, e colher 3 a 5 ml de urina em tubo de ensaio estéril. Coleções de 24 horas, não têm valor para diagnóstico micológico.
- Fezes : fazer lavagem prévia da região anal com água e sabão, coletar porções de fezes em recipiente estéril com tampa ou “swab” anal, mergulhar o “swab” em salina estéril e enviar o tubo ao laboratório.
- Secreção ou pele de conduto auditivo externo: colher material por curetagem da lesão ou com “swab” estéril. Mergulhar o “swab” umedecido em salina estéril e enviar o tubo ao laboratório.
- Material de micose ocular: o melhor método para recuperação de fungos, requer raspado de córnea, aspiração de líquido intra-ocular ou biópsia. A coleta com auxílio de “swab” não é indicada em local de drenagem.
- Lesão de nariz e seios paranasais: coletar secreção, material necrótico ou tecido obtido por biópsia em recipiente estéril.
- Mucosa oral e orofaringe: coletar com “swab” estéril o material de lesão de mucosa jugal, papilas linguais ou região tonsilar. Mergulhar o “swab” umedecido em salina estéril e enviar o tubo ao laboratório.
- Secreção vaginal: com auxílio de espéculo, coletar material da lesão ou do fundo de saco vaginal com “swab” estéril. Mergulhar o “swab” umedecido em salina estéril e enviar o tubo ao laboratório.
- Liquídos corporais (pleural, ascítico, pericárdico, sinovial): fazer assepsia rigorosa no local da punção. Coletar cerca de 5 a 10mL de líquido em tubo de ensaio estéril.
- Pus e material de abscesso: devem ser colhidos de preferência, por aspiração de abscessos fechados, com seringa e agulha estéril. Se a lesão for aberta, limpar o local, com gaze esterilizada embebida em salina estéril, para eliminar os exsudatos superfíciais que são altamente, contaminados com bactérias. A seguir, colher o material com “swab”. Mergulhar o “swab” umedecido em salina estéril e enviar o tubo ao laboratório.
- Pele e pelos: se possível, descontaminar a pele com álcool 70% antes da coleta. Raspar com lâmina de bisturi as escamas cutâneas da borda das lesões . Pode-se utilizar também, uma lâmina de microscopia. Colocar o material entre duas lâminas limpas, de preferência esterilizadas, vedando-se as bordas das lâminas com fita adesiva para evitar perda do material. Os pelos tonsurados, devem ser retirados com pinça estéril e acondicionados entre lâminas ou em potes, de preferência esterilizados.
- Unhas: fazer limpeza prévia das unhas, escovando com água e sabão. Cortar com tesoura e desprezar a parte descolada da unha e, com lâmina de bisturi, raspar as áreas mais profundas e pulverulentas. Colocar este material entre lâminas e vedá-las com fita adesiva.