SNParray e MLPA

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A tecnologia de SNParray
I Seminário da Liga Acadêmica de Genética Molecular
LAGMOL
LIGA ACADÊMICA DE GENÉTICA MOLECULAR
Yuri Nascimento Froes
Microarray: SNParray
Permite investigar a expressão de centenas ou milhares de genes em uma dada amostra usando uma reação de hibridização;
As sondas são os fragmentos gênicos conhecidos que estão imobilizados em uma matriz sólida, ou seja, as sequências correspondentes aos genes de interesse;
Os alvos consistem no cDNAs marcados que estão em solução, os quais são provenientes de amostras biologias (russo et al. 2003).
O que são SNP?
Single Nucleotide Polymorphism;
Polimorfismos de um único nucleotídeo (SNPs) são trocas ocorridas no DNA onde um nucleotídeo é trocado por outro qualquer (A/T, A/G, A/C, G/C, G/T) e vice-versa (Pennisi, 1998);
Essas modificações pontuais nas seqüências de DNA são encontradas tanto nas regiões do genoma codificantes de proteínas (éxons) quanto nas não codificantes (íntrons). 
MUITAS VEZES SILENCIOSOS, MAS NEM POR ISSO SEM EFEITO!
Objetivo da SNParray
Objetivo principal:
Detecção de duplicações, perdas e polimorfismo que não são visualizados em exame de cariótipos.
Chips com sondas específicas
Um array pode ser definido como uma coleção ordenada de sondas, cada sonda representando uma única espécie de ácido nucleico e correspondendo ao gene de interesse. 
Marcadores 
Os fluorocromos são moléculas orgânicas que funcionam como corantes;
Estas moléculas se ligam aos mRNA ou cDNA.
Modo de sinalização:
Cy3 (Cyanine 3): verde;
Cy5 (Cyanine 5): vermelho;
Cy3 + Cy5 = Amarelo.
Hibridização
É a ligação do mRNA ou cDNA de uma amostra biológica com o gene de interesse clínico (sonda).
Perfil de expressão com aquisição de dados em microarray de DNA
Sinais emitidos pela sonda
Sondas menores que 400 pares de base fornecem menos 50% do sinal obtido que com sondas de aproximadamente 600 – 2000 pares de bases (Brentani et al. 2005).
Chip utilizado
CytoScan 750K
Leitura
Os dados podem ser analisados e quantificados por uma variedade de métodos de bioinformática.
Aplicações da SNParray
Geralmente a técnica de SNParray de DNA tem aplicações direcionadas para análise de expressão gênica e de mutações pontuais;
São técnicas com custo elevado, mas com grande importância clínica para diagnóstico de marcadores tumorais e outras doenças genéticas.
Outras aplicações da técnica microarray:
Farmacogenômica (ligação proteica);
Diagnostico de doenças infeciosas;
Genética forense;
Mapeamento de DNA;
Genotipagem;
Análise de variante de splicing.
Referências bibliográficas
Mocellin S, Rossi CR. Principles of gene microarray data analysis. Adv Exp Med Biol. 2007;593:19-30.
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Tecnologia de MLPA 
Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification
LAGMOL
LIGA ACADÊMICA DE GENÉTICA MOLECULAR
Roniere Sousa
O que é MLPA?
O MLPA é uma técnica de genética molecular semi-quantitativa inicialmente desenvolvida por Schouten e colaboradores em 2002.
Esta técnica tem como base a PCR multiplex e utiliza mais de 40 sondas, cada uma específica para uma sequência de DNA diferente (principalmente éxons de um gene específico de interesse) o que permite avaliar o número de cópias relativas de cada sequência de DNA.
Aplicações
Detecção de deleções ou duplicações de éxons;
Detecção de trissomias;
Caracterização de aberrações cromossômicas em linhagens celulares e amostras tumorais;
Detecção de mutações e SNPs;
Análise de metilação de DNA.
Quantificação da expressão gênica.
Etapas
Resumidamente, a reação de MLPA pode ser dividida em cinco etapas principais: 
Desnaturação do DNA (98° C);
Hibridização das sondas MLPA (16 horas a 60° C);
Reação de ligação – Ligase (15 minutos a 54º C);
Reação de PCR;
Separação dos produtos de amplificação por eletroforese e análise dos resultados. 
	Os resultados sob a forma de eletroferogramas podem ser observados usando o software GeneMapper v4.1 (Applied Biosystems, Foster City, USA). Estes resultados permitem a efetuação de uma avaliação preliminar à qualidade do ensaio de MLPA através da análise dos picos de fluorescência.
	A análise dos resultados de MLPA pode ser feita utilizado o software Coffalyser 9.4 (MRC-Holland, Amsterdam, The Nertherlands) um programa baseado em Excel capaz de efetuar todas as etapas de normalização dos dados.
	Durante a primeira etapa, o DNA é desnaturado e incubado com uma mistura de sondas de MLPA. Cada sonda de MLPA consiste em dois oligonucleótidos individuais, em que cada um possui uma das sequências primer PCR. Estas duas sondas de oligonucleótidos hibridizam nas sequências alvo adjacentes (1) e por conseguinte são ligadas durante a reação de ligação (2). Após a ligação ocorre a PCR, no qual apenas as sondas ligadas irão ser amplificadas exponencialmente com um par de primers universal (3). Numa última etapa os produtos de amplificação são separados usando a eletroforese capilar (4).
(adaptado de http://www.mlpa.com)
Link para vídeo
https://youtu.be/q7UXKMHghuE
Vantagens
Até 96 amostras podem ser analisadas simultaneamente, estando os resultados disponíveis em 24 h, o que torna o MLPA numa técnica rápida e de elevado rendimento;
Técnica muito sensível (apenas 20 ng de DNA são necessários para a análise);
Específica (MLPA pode ser utilizado para distinguir sequências que diferem em apenas um nucleótideo);
Reprodutível;
Simples;
Fiável e de baixos custos quando comparada com outras tecnologias, como o caso do aCGH;
Os números de cópias podem ser determinados a partir de apenas uma única amostra de um indivíduo afetado. 
Desvantagens
O desenvolvimento das sondas é complexo e caro. Atualmente, mais de 300 conjuntos de sondas específicas para um grande número de distúrbios genômicos raros e comuns estão disponíveis comercialmente a partir da empresa MRC Holland;
Incapacidade de detectar ploidia e alterações estruturais cromossômicas equilibradas, bem como a contaminação celular materna em amostras XX;
Baixa sensibilidade para mosaicismo.
Referências bibliográficas
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