HPLC - Cromatografia Líquida de Alta Eficiência

Prévia do material em texto

Química Analítica / JCM
HPLC - Cromatografia líquida de alta eficiência
� HPLC
� High Performance (pressure) Liquid Chromatography
☺ nas colunas de enchimemto o fluxo é baixo mesmo para granulometrias elevadas (150-200 µµµµm)
� < granulometria < HEPT - exige pressões muito elevadas
☺ mistura de nucleosidos - 1967 - 60 min / 10-20 psig
1969 - 24 min / 400 psig
1970 - 1,25 min / 5000 psig
� Condições actuais:
☺ colunas de 5 a 25 cm com enchimento de 3 a 10 µµµµm
☺ 5000 - 10 000 psig / 40 000 - 100 000 pratos / m
� Constituíntes
1 psig = 108 kPa
HPLC - tipo de cromatoografia que emprega uma fase móvel líquida e uma fase estacionária finamente dividida e que,
para ter um fluxo razoável, opera a pressões elevadas
BombasSistema de 
solventes DetectorColunaInjector
Aquisição e 
trat. de dados
Química Analítica / JCM
Validação
� Num laboratório de cromatografia com dois analistas foram realizados vários 
testes para verificar se o método em uso para a determinação por GC de etanol 
em hiclato de doxiciclina (valor teórico: 4,5%) poderia ser considerado válido. 
Foram obtidos os seguintes resultados:
� tempos de retenção relativos: metanol: 0,3 / acetona : 0,6 / etanol 1,0
☺ Metanol e acetona são possíveis impurezas
� solução amostra: 12345 / 12450 / 11950 / 12456 / 12100
� Soluções de etanol a: 20%: 3120 / 40%: 4980 / 60%: 7305 / 80%: 9850 / 100%: 12300 / 
� 120%: 14650
� solução amostra (repetição): 12245 / 12650 / 12405 / 12158 / 12250
� solução amostra (outro dia /analista): 11900 / 13070 / 12347 / 11250 / 12440
☺ Nota: as percentagens indicadas dizem respeito ao valor teórico: 4,5%.
� O método é selectivo?
� Qual o valor obtido?
� Que conclusões poderá tirar quanto à validade do método e à destreza dos 
analistas envolvidos na determinação? 
� Que sugeria para melhorar a confiança no resultado?
Enviar até 11.04.07 para: marques@uma.pt
Química Analítica / JCM
Química Analítica / JCM
Química Analítica / JCM
Resolução
� Desconhecendo a resolução dificilmente se pode dizer se um método é selectivo
� Se 4,5 % é a percentagem teórica, corresponde à solução a 100%!!
� Por isso se indicam soluções acima e abaixo deste valor
� Não se pode confundir o significado dos 4,5% e da % das soluções padrão
� A maioria dos alunos retirou a solução a 20% que neste caso não seria preciso
� A área foi mudada de 3500 para 3120
� Claramente um dos analistas tem falta de formação
� Nota: os resultados de ambos os analistas são exactos mas um deles pouco preciso
� A repetibilidade pode ser boa mas não a reproductibilidade
� A solução não é colocar o bom analista a fazer sempre o método mas dar formação ao outro 
analista
� Resultado
� Quando se indica que o valor teórico é de 4,5 % significa que se admite que o erro esteja no 5!
☺ Não tem valor indicar um resultado com 3 algarismos significativos
☺ Seria diferente se o valor teórico fosse de 4,50 % 
Química Analítica / JCM
HPLC
� Sistema de solventes
� desgaseificação / vácuo - hélio (sparging)
� Bombas
☺ bombas de duplo pistão
☺ válvulas proporcionais
☺ câmara de mistura
� eluição isocrática - composição da FM é constante
� eluição de gradiente - composição da FM varia ao longo
do cromatograma
☺ Bombas isocráticas
☺ Bombas binárias
☺ Bombas quaternárias
Química Analítica / JCM
Bombas
� Bombas
� pressão elevada (> 6000 psig) - riscos de fugas
� saída contínua (sem pulsação) / pistão
� fluxos de 0,1 a 10 ml/min
� reproductibilidade de fluxo de 0,5% !!
Química Analítica / JCM
Injector
� Injector
� o uso de septum é limitado a cerca de 1500 psig
� injecção em loop de volume fixo ( 5 - 500 µl)
☺ típico 20 µµµµl
� Autoinjector
☺ Capacidade de preparação de amostras
Química Analítica / JCM
HPLC - colunas
� Enchimento
� sílica (aglomeração de partículas altamente regulares
☺ eventualm. cobertas por filme orgânico
� alumina / polímeros porosos / resinas permutadoras de iões
colunas de aço com 10 a 30 cm de comprimento e 4 a 10 mm de diâmetro interno
enchimento de 5 a 10 µµµµm / 5000 - 6 000 psig / 40 000 - 60 000 pratos / m
colunas de aço com 10 a 30 cm de comprimento e 4 a 10 mm de diâmetro interno
enchimento de 5 a 10 µµµµm / 5000 - 6 000 psig / 40 000 - 60 000 pratos / m
Micro: 3 a 7,5 cm de comprimento / DI = 1 a 4,6 mm / <10 000 psig / 3 ou 5 µµµµm / até 100 000 pratos / m
Vantagens: velocidade elevada e baixo consumo de solventes
3.0 and 4.6mm Standard Super-Link System™
HPLC Columns
Química Analítica / JCM
HPLC - enchimentos
� A cromatografia de partição representa a maioria das aplicações
� líquido-líquido: fase estacionária é um solvente adsorvido no suporte (apenas usado 
ocasionalmente)
� fase ligada: fase estacionária orgânica está ligada à superfície do suporte por ligações 
covalentes (> estabilidade - > uso) 
� Enchimentos de fase ligada
� outros grupos funcionais: aminas alifáticas / éteres / nitrilos / hidroc. aromáticos
� maior estabilidade / apresenta alguma limitação na capacidade de amostra 
� Cromatografia de fase normal
� fase estacionária polar / fase móvel não polar - o soluto menos polar elui primeiro
☺ água; trietilenoglicol; CN / hexano, éter isopropílico
� Cromatografia em fase reversa (+ de 75 % das aplicações)
� fase estacionária não polar / fase móvel polar / soluto mais polar elue primeiro
☺ C8; C18 / soluções aquosas de metanol, acetonitrilo, THF; soluções tamponadas
/ / CH3 / / CH3
- Si -- OH + Cl - Si -- R --Si -- O -- Si -- R ; R = octil (C(8) / octadecil (C18)
\ \ CH3 \ \ CH3
Química Analítica / JCM
Pré-colunas + forno
� Pré-colunas
� aumento da vida das colunas 
☺ mesma (similar) composição da fase estacionária / maior granulometria
☺ remoção de partículas e contaminantes dos solventes
☺ saturação da fase móvel com a fase estacionária
� Forno de colunas
� TA - 150 C (temperatura ambiente - ou ligeiramente acima - na maioria das 
aplicações)
☺ Maior a temperatura menores os tempos de retenção
☺ Maiores temperaturas causam maior degradação da coluna
� para a quantificação a termostatização é essencial (± 0,1 C)
☺ A identificação é essencialmente feita com base nos tempos de retenção
Química Analítica / JCM
HPLC
Química Analítica / JCM
Detectores HPLC
Química Analítica / JCM
Espectro electromagnético
� Espectro electromagnético
� Espectroscopia / espectrometria - informação geral / informação 
quantitativa
� a espectroscopia está na base do grande desenvolvimento da ciência actual, 
desde a química à astronomia
A espectroscopia - estudo da interacção da radiação electromagnética com a matéria
Espectro - representação bidimensional da força da interacção vs. energia
transições
nucleares
excitação
electrónica
vibração
molecular
rotação molecular
spin electrónico RMN
raios
cósmicos raios gama raios x UV VIS IV micro ondas ondas rádio
λ, cm
e- internos
Química Analítica / JCM
Fenómenos associados à absorção da luz
� R - Relaxação vibracional
� A - Absorção
� F - Fluorescência (mesmo spin)
� P - Fosforescência (spins dif.)
� IC - Conversão Interna (mesmo spin)
� ISC - conversão intersistema (spins
dif.)
� P aparece sempre a maiores 
comprimentos de onda (< E) que F
� Ambos os fenómenos são raros devido 
aos tempos de vida muito curtos
Química Analítica / JCM
HPLC - detectores
� Os detectores de absorção (UV + Vis) são 
usados na maioria das aplicações
� células analíticas
� detector de foto-diodos (diode array)
0.98 - 1.02Response Index
5 x 10-8 to 5 x 10-4 g/mlLinear Dynamic Range
5x 10-8 g/mlSensitivity (toluene)
0.97 - 1.03Response Index
5 x 10-7 to 5 x 10-4 g/mlLinearDynamic Range
1 x 10-7g/mlSensitivity
Química Analítica / JCM
UV – comprimento de onda 360nm 
Química Analítica / JCM
DAD
Química Analítica / JCM
Comparação de espectros UV
Química Analítica / JCM
Fluorescência vs. UV
Química Analítica / JCM
HPLC
� Critérios de escolha
� uma boa separação representa sempre um balanço entre as forças intramoleculares que se 
estabelecem entre amostra e fases estacionária e móvel
� usar uma fase estacionária com polaridade semelhante à amostra e uma fase móvel de 
polaridade muito diferente
☺ o contrário é possível mas menos eficaz (tr geralmente muito curtos)
☺ polaridades idênticas (amostra e fase estacionária) pode levar a tr muito longos
� alterar a polaridade do solvente (mistura) de forma a melhorar a separação
� Aspectos experimentais
� temperatura estável para trr reproductíveis
� desgaseificação dos solventes
� 2-3 réplicas e soluções padrão
☺ limite de detecção - menor concentração detectável (3x acima do ruído de fundo) 
☺ limite de quantificação - menor concentração determinada sem ambiguidade (10x vezes o ruído de 
fundo)
☺ Tailing - arrastamento do pico (coeficientes de partilha não lineares)
Cs
Cm
Cs
Cm
Cs
Cm
Química Analítica / JCM
Trabalho
� Descreva de forma breve o funcionamento de um detector ELSD
� Entregar por mail até 11 de Maio
Química Analítica / JCM
Tratamento de amostras
� Amostras puras
� apenas necessitam do solvente apropriado (solubilização seguida de filtração)
☺ o solvente deverá ser semelhante ou mais fraco que o usado na fase móvel
☺ usar THF ou metanol em fase reversa (água) pode provocar perdas de resolução
☺ a escolha do solvente pode ser condicionada pelo detector utilizado
� Amostras compostas
� a presença de impurezas não dissolvidas exige, no mínimo, uma filtração 
� extração da matriz (excipientes) 
☺ necessidade de determinar a % de recuperação
� uso de solventes diferentes do usado na injecção exige reconstituição da amostra
☺ extração / concentração / reconstituição 
� pré-colunas / separação de componentes de diferentes polaridades (Sep-Pak)
� Amostras biológicas
� caracterizadas por concentrações muito baixas
� precipitação das proteínas (acetonitrilo + centrifugação) / concentração / reconstituição 
Química Analítica / JCM
SPE
Química Analítica / JCM
LLE
Química Analítica / JCM
Derivatização
� Aminoácidos
☺ Reagente:6-aminoquinolyl-N-hydrozysuccinimidyl 
carbamate
� Liberta: N-hydroxysuccinimide (NHS)
☺ Reacção completa num minuto
☺ Derivados estáveis (+ de 1 semana)
☺ Fluorescem a 395 nm
AccQTag column 3.9 x 150mm (waters) 
Fluorescence detection with 250 nm excitation, 395 nm 
emission 
UV detection at 248 nm
A 140mM NaAC, 6.9mM Triethylamine, EDTA (1ml of a 
1mg/ml solution per liter) pH to 5.8 w / 5 - 10% 
phosphoric acid solution
B Acetonitrile
C Water
Química Analítica / JCM
Cromatografia preparativa
Química Analítica / JCM
Química Analítica / JCM
Aquisição e tratamento de dados
� Automação
� o uso de computadores veio aumentar a capacidade de utilização dos aparelhos
� preparação da amostra / injecção / controlo / aquisição / tratamento de dados
☺ sistemas de optimização de separações cromatográficas
� Aquisição de dados
� 20 - 200 Hz ( > 8 pontos por pico)
☺ para definir um pico são precisos pelo menos
3 pontos a “subir” e 3 a “descer”
� armazenagem (identificação)
� Tratamento de dados
� acumulação / “smoothing” / integração / derivatização
� determinação de tempos (tr) e intensidades (áreas / alturas)
☺ integração - definição do princípio e fim do pico 
☺ picos mal definidos (falta de resolução e “tailing”)
� correção da linha de base
� tratamento à posteriori
☺ utilizando novos parâmetros (“threshold” / integração)
� não melhora a separação!!