COMATOGRAFIA RESUM

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QuQuíímica Analmica Analíítica / JCAMtica / JCAM
Cromatografia
� Cromatografia 
� técnica baseada nas diferenças de distribuição dos componentes a separar entre 
duas fases: uma fase móvel e uma fase estacionária.
� técnica em que os componentes duma mistura se separam de acordo com as 
velocidades às quais são transportados por uma fase móvel através de uma fase 
estacionária
� fase móvel (eluente)
� fase que se move 
☺ gás - cromatografia em fase gasosa - GC)
☺ líquido - cromatografia em fase líquida - LC
� fase estacionária
� fase fixa (quer em coluna quer em superfície plana)
☺ normalmente um sólido activo
☺ pode ser um líquido depositado num suporte sólido inerte (GC)
� eluição
� processo de passagem através da fase estacionária (por acção da fase móvel)
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Cromatografia - Evolução histórica
� 1850 - Runge
� mistura de tintas em papel mata-borrão
� 1861- Schoenbein - Goppelsroder
� sais, água, vinho, leite, urina, ... / separação por capilaridade
� 1906 - Tswett
� pigmentos de plantas / coluna de giz moído (carbonato de cálcio)
� 1938 - Ismailov e Schraiber (1956 - Stahl)
� primeira descrição do TLC / CCF - camada fina / uso de alumina na separação de 
tinturas farmacêuticas
� 1941 - Martin e Synge (prémio Nobel em 1952)
� cromatografia de partilha (aminoácidos) / cromatografia gás-líquido
� 1967 - Huber e Hulsman 
� desenvolvimento da cromatografia Líquido-Líquido (HPLC)
� uso de partículas de 5 a 10 µm / pressão elevada
12 Prémios Nobel (entre 1937 e 1972) estão directamente relacionados com trabalhos em cromatografia
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Cromatografia - classificação
� quanto à forma do suporte
� coluna - a fase estacionária está confinada num tubo por onde é forçada (pressão 
/ gravidade) a passagem da fase móvel 
� planar (camada fina / papel) - fase móvel avança por capilaridade ou gravidade
� quanto aos processos físico-químicos
� adsorção - separação baseada nas diferenças de afinidades adsorventes dos 
componentes pela superfície do sólido activo
� partilha - separação baseada nas diferenças de solubilidade dos componentes na 
fase estacionária (GC) ou entre a duas fases (LC)
� permuta iónica - separação baseada nas diferentes tendências dos componentes
iónicos ou ionizados à permuta com iões da fase estacionária
� quanto à natureza da fase móvel:
� fase gasosa (GC) / fase líquida (HPLC) / fluido supercrítico (SFC)
� quanto à forma de introdução da amostra
� frontal - contínua (eluição após a saturação da fase estacionária)
☺ não permite a separação entre todos os componentes da mistura 
� zonal - descontínua (permite a separação total) A A+B
A+B+C
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Cromatografia - classificação
� quanto ao objectivo da separação
� analítica - controlo de qualidade (impurezas / pureza / doseamentos)
� preparativa - produção / purificação (evita as técnicas de extracção química) 
� quanto à composição da fase móvel
� isocrática - composição do eluente constante ao longo da eluição
� gradiente - composição do eluente varia de forma contínua
� quanto ao modo de operação
� análise por deslocamento
☺ fase móvel saturada com substância de maior afinidade para com a fase 
estacionária, deslocando os componentes da amostra de acordo com os 
respectivos graus de afinidade.
� análise por eluição
☺ a fase móvel passa continuamente na coluna arrastando a amostra e provocando o 
processo de separação. A separação dos componentes da mistura depende 
apenas do seu coeficiente de partilha entre as fases móvel e estacionária
� análise por gradiente de temperatura
☺ a separação é feita por um gradiente térmico no sentido da eluição da amostra
☺ isotérmica / temperatura escalonada / temperatura programada linearmente
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Métodos cromatográficos
Tipo de cromatografia fase móvel fase estacionária processo de distribuição
Cromatografia de partilha (coluna) L L partilha
Cromatografia de papel L L partilha
Cromatografia gás-líquido (GLC) G L partilha
Cromatografia de adsorção (coluna) L S adsorção
Cromatografia em camada fina (TLC) L S adsorção
Cromatografia gás-sólido (GSC) G S adsorção
Cromatografia permuta iónica L S reacção química reversível
Cromatografia de permeação gel L S crivagem molecular
Cromatografia - processo de separação que exige um equilíbrio competitivo entre a fase estacionária
a fase móvel e as moléculas da amostra.
Cromatograma - registo da concentração do soluto vs. tempo (volume) de eluição
Cromatógrafo - equipamento constituído por sistema de injecção, coluna e detector adequado para a
realização de separação (análise) e quantificação de misturas.
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Conceitos e equações básicas
� Separação dos componentes
� separação aumenta com o tempo de eluição (devido às diferenças de afinidades)
� Alargamento dos picos (bandas)
� os picos tendem a alargar com o tempo de eluição (diminuição da eficiência de separação)
� Coeficiente de partilha (K)
� razão entre a concentração na fase estacionária (CS) e a concentração na fase móvel (CM)
☺ idealmente, K é constante !!
� Coeficiente de retenção (Rr)
� razão entre a velocidade média do soluto e a velocidade média do eluente
� Factor de retenção (Rf) - muito usado em TLC
� razão entre a distância percorrida pela banda e a distância percorrida pela frente do eluente
no mesmo tempo.
Questão: um solvente atravessa uma coluna em 3 minutos mas o soluto demora 9 minutos a eluir! 
Qual a fração do tempo que o soluto passa na fase móvel? 
A eficiência da separação cromatográfica depende das velocidades relativas de
eluição e, consequentemente, dos respectivos coeficientes de partilha
K C
C
S
M
=
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Conceitos e equações básicas
� Tempo morto (tm)
� tempo necessário para um produto “não retido” atravessar a coluna
� Tempo de retenção (tr)
� tempo que decorre desde a injecção até meia eluição
� Tempo de retenção relativo (trr)
� tempo de retenção calculado em relação ao pico 
principal (ou de referência)
� Volume de retenção (Vr)
� volume de eluente introduzido desde a injecção até meia eluição
� Velocidade média de eluição
� Factor de capacidade (k’)
� descreve a velocidade com que dado composto migra ao longo da coluna
� valores típicos estão entre 1 e 5
� em GC, k’ varia mudando a temperatura e o enchimento da coluna
� em LC, k’ varia alterando a composição da fase móvel e da fase estacionária
tm
tr1
tr2
v = -------
L
tr
tr - tm
tm
k’ = -------------
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Conceitos e equações básicas
� Factor de selectividade
� razão entre os coeficientes de partilha do soluto mais retido pelo menos retido
� medida da separação de dois solutos
� α α α α é sempre superior a 1
� Forma dos picos
� tipicamente gaussianos (simétricos)
� alargamento resulta da variações de velocidade das moléculas de soluto ao longo 
da coluna - o tempo de residência em cada fase não é constante
☺ Tailing - arrastamento provocado por coeficientes de partilha não lineares
☺ Fronting - provocado por coef. partilha não lineares / amostra demasiado grande
� Modelos que descrevem a separação cromatográfica
� Modelo de equilibrio - modelo dos pratos teóricos
� Modelo dinâmico – modelo cinético
α = = =
−
−
K
K
K
K
t t
t t
B
A
B
A
rB m
rA m
'
'
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Modelo dos pratos teóricos
� considera transferências sucessivas entre as quais se estabelece equilíbrio 
termodinâmico / em vez de considerar o avanço real da fase móvel
�cada volume assim definido é um prato teórico
� N = L / H em que L - comprimento da coluna e H (HETP) - altura do prato teórico
� a eficiência de uma coluna aumenta com o número de pratos (ou inv. a H), podendo 
variar de algumas centenas (HPLC) a várias centenas de milhar (GC)
� Considerando uma distribuição aproximadamente gaussiana, N pode ser 
obtido por:
� ωωωω é a largura do pico na base (considerando tratar-se de um triângulo)
� δδδδ é a largura a meia altura do pico
N = 16 (tr/ωωωω)2 ou N = 5,54(tr/ δ)δ)δ)δ)2222
ω
A largura do pico representa uma boa medida da eficiência da coluna (permitindo a
comparação entre colunas) 
Apesar do modelo não caracterizar os vários parâmetros que influenciam a separação,
a sua simplicidade favorece a utilização 
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Modelo cinético
� a separação cromatográfica é um fenómeno cinético e não estático
� a deformação dos picos está associada ao fluxo da fase móvel e pode ter várias 
origens:
☺ existência de vários trajectos possíveis (anisotropia)
☺ difusão molecular longitudinal
☺ resistência à transferência de massa
� Anisotropia
� é independente do fluxo 
� exprime o movimento turbulento de difusão 
da fase móvel através da fase estacionária
� reflecte a homogeneidade da fase estacionária (enchimento)
� diminui com o diâmetro das partículas e é nula
para uma coluna vazia HA = dp λ λ λ λ = A
dp - diâmetro das partículas
l - irregularidade do enchimento
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Modelo cinético
� Difusão longitudinal
� representa a dispersão das moléculas 
� inversamente proporcional ao fluxo
� Resistência à transferência de massa
� as moléculas colocadas no centro do fluxo avançam mais 
rapidamente
� a fase estacionária não tem uma forma regular - diferenças 
de retenção das moléculas
� as diferenças (desfasamento) aumentam drasticamente com o fluxo provocando o 
alargamento progressivo do pico
Hb = B / U
B - difusão
U - velocidade da fase móvel
Hc = C . U
C - transferência entre fases
U - velocidade da fase móvel
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Equação de van Deemter
� H representa a altura equivalente de um prato teórico
H = A + B / U + C . UH = A + B / U + C . U
N = L / H
A - anisotropia
B/U - difusão
C.U - transferência 
A separação é máxima para H mínimo.
B domina para U baixos e C domina para 
U elevados
A difusão é muito menos significativa
em HPLC (líquido). A é também menor
em HPLC pelo que H min é cerca de 10x
menor que em GC e obtem-se para 
valores de U cerca de 10x inferiores.
Os picos tendem a alargar mais em GC
que em HPLC.
H
U - velocidade da fase móvel
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Partículas
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Resolução
� Resolução de uma coluna mede a capacidade de separar dois solutos
� A resolução depende de 3 factores:
� selectividade α α α α −−−− deve ser superior a 1 (importante mas insuficiente)
� factor de capacidade k’ - deve estar compreendido entre 1 e 10 
� eficácia da coluna N - deve ser a maior possível (ainda que seja pouco influente 
- raiz quadrada)
R t t
w w
N k
k
rB rA
A B
B
B
=
−
+
=
−





+






2
4
1
1
( ) '
'
α
α B é o soluto mais lento ( maior tr)
R = 1 - separação quase completa
R > 1,5 - separação completa
Nota: é muitas vezes exigida um R de 4-5 para que
as impurezas existentes sejam separadas.