Proteinas Heterologa

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Expressão Heteróloga de Proteínas
Mestrandos Fernanda & Tiago F. Chaves
 PPG EM BIOLOGIA CELULAR E DO DESENVOLVIMENTO 
Disciplina: BIOLOGIA MOLECULAR 2016.1 
Professores: Rafael Rosa e Yara Muniz
INTRODUÇÃO
Expressão Heteróloga De Proteína 
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INTRODUÇÃO
Expressão Heteróloga De Proteína 
 
(hétero+logo) Que consiste em elementos diferentes
INTRODUÇÃO
Expressão Heteróloga De Proteína 
Indução experimental de uma proteínas recombinante inseridas para se expressar em uma célula (Hospedeiro) que normalmente não expressa está especifica proteína. 
INTRODUÇÃO
Expressão Heteróloga De Proteína 
Indução experimental de uma proteínas recombinante inseridas para se expressar em uma célula (Hospedeiro) que normalmente não expressa está especifica proteína. 
Proteínas recombinante
São proteínas produzidas artificialmente a partir de genes clonados. Atravez da técnica de DNA recombinante
INTRODUÇÃO
Expressão Heteróloga De Proteína 
Importante na compreensão dos estudos funcionais das mesmas.
Utilização de microrganismos geneticamente modificados (OGMs), capazes de sintetizar proteínas em grande quantidade
Processo economicamente vantajoso de produção em relação aos processos clássicos.
sistemas de expressão: procariotos e eucariotos.
Histórico
Herbert Boyer e Stanley N. Cohen- tecnologia de DNA recombinante. Plasmídeo pSC 101 
1973
 Itakura Keiichi e colaboradores 1º proteína recombinante - SOMATOSTATINA 
1977
Hebert Boyer desenvolve a INSULINA 
humana recombinante 
1978
Insulina foi aprovada (FDA) para utilização comercial desenvolvido pela Empresa de Boyer, a Genentech. 
1977
PROTEÍNAS
essenciais na estrutura, na função, e no regulamento das células
responsáveis pela homeostasia celular
 inúmeras finalidades: diagnóstica, terapêutica, biotecnológicas e prevenção (vacinas)
Clonagem gênica: isolamento, amplificação e purificação de um gene (s), a partir do material genético de um organismo.
Vetores: veículos de clonagem que permitem que os fragmentos de DNA a serem clonados sejam introduzidos e propagados em uma célula hospedeira adequada.
Célula hospedeira: células de fácil manipulação, crescimento rápido e constituição genética bem conhecida.
Relembrando
Escolher o vetor
Preparar o vetor
Preparar o Inserto
Clonar o Inserto
 no Vetor
Transformação em célula
de expressão
Indução
Cultura de células
Extração
Purificação
Processo:
Proteína de Interesse
Hospedeiro
Origem
Procariota X Eucariota ?
Proteína a ser Expressada
Características: 
Propriedades
Sequência nucleotídica
Propriedades químicas (Tamanho, pI, modificações pós- traducional)
Estabilidade (pH, temperatura)
Toxicidade
Destino (intra/extracelular)
 
 PROCARIOTO
Bactérias (E. coli)
Hospedeiros 
EUCARIOTO
Leveduras (Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris) 
Baculovírus/células de inseto (Drosophila melanogaster) 
Cultura de células de mamíferos (Células COS e CHO) 
Células de plantas (Cloroplastos e protoplastos) 
Bactérias (E. coli)
Expressão heteróloga de proteínas em procarioto 
Vantagens 
Bem caracterizada geneticamente
Diversidade de vetores de clonagem
Controle da expressão genica facilitado
Crescimento rapido
Secreção do produto no meio de cultura
Desvantagens 
Não realiza modificações pós-traducionais (glicosilações, ligações dissulfeto e enovelamento incorreto)
Produção de proteases 
Baixo nível de expressão 
Leveduras (Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris) 
Expressão heteróloga de proteínas em eucariotos 
Vantagens 
Expressão rápida e de baixo custo
Genoma pequeno e de simples análise (cerca de 200X menor do que dos mamíferos)
Permitem modificações de enovelamento de proteínas e algumas pós-traduções
Desvantagens 
Estruturas de glicanos N-ligados diferenets das proteínas de mamíferos.
Necessitam de peptídios sinais para proteinas da via segretora.
Baculovírus/células de inseto (Drosophila melanogaster) 
Expressão heteróloga de proteínas em eucariotos 
Vantagens 
Desvantagens 
Cultura de células de mamíferos (Células COS e CHO) 
Expressão heteróloga de proteínas em eucariotos 
Vantagens 
Desvantagens 
VETOR
 
Promotores
Principais promotores:
	Lac = semelhante ao da E.coli (reprimido pela lacl na ausência de indutor – lactose ou IPTG
	Tac – região operadora (onde a RNApolimerase se liga)e a promotora (onde o repressor se liga)
	T7 – utiliza a RNApolimerase do fago T7 = indução indireta
	aumento de expressão da proteína T7 RNA polimerase que se liga ao promotor do DNA plasmidial = aumento de expressão
	
Promotor metalotioneína liga-se zinco = 10x mais
 
Expressão
Plasmideos introduzidos em células (E. coli)
Células plaqueadas em meio semi-sólido (37ºC ) por 12 a 14hrs
Células submetidas a antibióticos que as células que não produzem proteínas recombinantes sejam sensíveis
Colônias inoculadas em meio rico com indutor (lactose ou IPTG)mais 5-6 horas de cultivo
Coletas das bactérias por centrifugação 
Eletroforese de uma amostra de bactérias induzidas (PM maior)
Códons não utilizados pela E.coli podem ser substituídos por códons sinônimos mais utilizados (Códon adaptation index – CAI)Códons ideais são comercializados
ANÁLISE DE PROTEÍNAS
•Eletroforese; 
•Focalização Isoelétrica; 
•Eletroforese Bidimensional(2D). 
Eletroforese de proteínas
Separação com base na migração de proteínas carregadas em um campo elétrico. 
Migração afetada pela massa-carga e forma da proteína. 
Submete-se as proteínas ao SDS que desdobra a proteína = Aumento de negatividade
Eletroforese de Proteínas
Vantagens :
Método analítico: útil tanto separar quanto visualizar proteínas. 
Estimar rapidamente o número de diferentes proteínas presentes em uma amostra ou o grau de pureza. 
Permite determinação do ponto isoelétrico e massa molecular aproximada. 
Desvantagem:
Não é utilizado para purificar grandes quantidades de proteínas porque afetam sua estrutura e a função. 
Focalização isoelétrica
•Processo utilizado para a determinação do ponto isoelétrico (pI) de uma proteína. 
Em gel com gradiente de pH, uma mistura de proteínas é aplicada e migram até que o pH coincida com o pI
Eletroforese Bidimensional
Combinação da Focalização isoelétrica e da Eletroforese de proteínas
Em um primeiro gel com diferença de pH é determinado o ponto isoelétrico
Depois a coluna já separada por pI é horizontalmente submetida ao gel poliacrilamida SDS
Bibliografia
Santos A K, Resende R R . PRODUÇÃO DE PROTEÍNAS RECOMBINANTES HUMANAS: Boa, Barata E Em Larga Escala. Edição Vol. 2, N. 08, 24 de Fevereiro de 2015. DOI:http://dx.doi.org/10.15729/nanocellnews.2015.02.24.006