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1 UNIVERSIDADE DE COIMBRA FACULDADE DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA – FCTUC DEPARTAMENTO DE QUÍMICA LABORATÓRIO DE QUÍMICA III PROF. DRª. MARIA JOÃO MORENO Caracterização da cinética da reação de hidrólise do p-nitrofenil acetato a p- nitrofenol na ausência e presença da enzima α-quimiotripsina Aline Gomes Edilzo Andrade Filho Experimento realizado em 27/NOV e 04/DEZ de 2012. Coimbra/ Portugal. 2 Objetivo Caracterização da reação de hidrólise do p-nitrofenil acetato (PNPA) a p- nitrofenol (PNP) na ausência de catalisador enzimático: determinação da constante de velocidade, ordem de reação e energia de ativação. Caracterização da cinética da mesma reação quando catalisada pela enzima α-quimiotripsina: determinação da constante de dissociação (KM) e da constante catalítica (k2), efeito da temperatura e da concentração de enzima. Introdução Teórica Estudos de atividade de enzimas são tradicionalmente realizados em soluções diluídas. A presença destas macromoléculas pode afetar a atividade de enzimas, principalmente, por meio de três elementos, a saber, a adsorção do substrato sobre a interação de proteínas, não covalente direta entre a enzima e a macromolécula adicionada inerte, e o chamado “efeito de aglomeração”. O efeito passado (também chamado de "efeito de preenchimento de espaço" ou "efeito de volume excluído") poderia alterar a conformação da enzima levando a alterações na sua atividade catalítica. Para simular um ambiente mais fisiológico para se estudar a cinética da enzima, polímeros neutros, tais como dextranos, polissacáridos ou poli (etileno glicol), ou Carbopol biomacromoléculas são frequentemente adicionadas ao meio de reação. Enzimas é um grupo de substâncias orgânicas de natureza proteica com atividade intra ou extracelular que têm funções catalisadoras. Porém, existem algumas limitações para seu uso em catálise de processos químicos em laboratório tais como: alta temperatura, variação de pH, estabilidade em solventes orgânicos e baixa seletividade, entre outras. O p-nitrofenol (PNP) é um poluente comumente encontrado em efluentes de pesticidas, produtos farmacêuticos, produtos petroquímicos e outras indústrias. Devido aos seus efeitos nocivos, efluentes contendo PNP precisam ser tratados antes de serem despejados em corpos receptores. Muitos métodos de tratamento têm sido desenvolvidos para remoção de diferentes contaminantes, sendo a adsorção um processo amplamente utilizado devido a fácil utilização e baixo custo. 3 Diversos tipos de adsorventes têm sido empregados em estudos de adsorção. A turfa é um adsorvente alternativo ao carvão ativado, pois é um material de baixo custo, de alta porosidade, não exige ativação e é viável em muitos países como no Brasil. Figura 1: estrutura do PNP. Procedimento experimental: Curva de calibração para converter absorvância em concentração de PNP e Cinética da hidrólise do PNPA a PNP. Para a determinação da hidrólise da reação do p-nitrofenil acetato (PNPA) a p-nitrofenol (PNP) na ausência e na presença de um catalizador enzimático fez-se o preparo das soluções com diferentes concentrações (1×10-5, 2.5×10-5, 5×10-5, 7.5×10-5 e 1×10-4 M de p-nitrofenol em “tampão”:etanol 95:5; com cerca de 5 ml de cada solução preparadas por diluição da solução fornecida (1×10-3 M de p-nitrofenol em água:etanol 95:5), para a obtenção da curva de calibração. Foi necessário fazer uma linha de base no espectrofotómetro com uma solução de “tampão”:etanol 95:5 entre os comprimentos de onda de 250 e 500nm, a partir da linha de base efetuou- se a leitura do espectro de absorção das soluções, o que permitiu obter o comprimento de onda no qual a absorção é máxima. A solução tampão utilizada foi preparada com hidrogenofosfato de sódio com concentração 0,01 M e com uma solução de NaCl de concentração 0,15 M o pH dessa solução tampão foi acertado com solução de HCl e NaOH o que proporcionou um pH= 7,4. Em seguida, para verificar a cinética da reação de hidrólise do p-nitrofenil acetato a p-nitrofenol, foi preparada as soluções com as seguintes concentrações para o p-nitrofenil acetato em etanol (G1, G2 e G3 - 1.2×10-3M; G4, G5 e G6 - 2.5×10-3M; G7 e G8 - 5×10-3M), na qual foram colocadas em gelo. 4 Depois se preparou uma solução de 8 ml por diluição de 20 vezes de p- nitrofenil acetato por diluição com tampão, o solvente final é tampão:etanol 95:5, está solução também foi colocada em gelo. Por fim, foi realizada a leitura do espectro de absorvância destas soluções entre 250 e 500nm. As soluções em seguida, foram colocadas em banho às temperaturas indicadas de 20°C para (G1 e G4), 35°C (G2, G5 e G7) ou 45°C (G3, G6 e G8) durante 5 minutos. As leituras de absorvâncias foram efetuadas no comprimento de onda de 401nm. Cinética da hidrólise do PNP acetato a PNPA catalisada pela enzima α- quimotripsina. Nesta etapa foi estudado o efeito da concentração do substrato (grupos 1, 2, 3, 4, 7 e 8). Foram colocadas 2,6 ml de solução tampão em um cuvette e adicionou- se 200 µL da enzima α-quimotripsina e agitou-se por inversão e em seguida foi adicionado 200 µL de solução de p-nitrofenil acetato em etanol, essa solução foi agitada por inversão e depois se realizou a leitura da absorvância ao comprimento de onda selecionado anteriormente, a leitura foi realizada a cada 5 s e durante pelo menos 1 minuto. As temperaturas das reações foram realizadas a 20°C e 35°C,sendo que para 20°C foram os grupos (G1,G2 e G7 com concentrações de (1,2x10-3 M, 2,5x10-3 M e 5,0x10-3 M) e para 35°C para os grupos G3,G4 e G8. Para o estudo do efeito da concentração da enzima (grupos 5 e 6), realizou- se o mesmo estudo feito acima, só que mantendo a concentração do substrato com 1,2x10-2 M em etanol e variando somente a concentração da enzima. O volume utilizado para a concentração da enzima foi de 100 µL, 150 µL e 200 µL (o volume do tampão foi corrigido de forma a manter o volume total igual a 3 ml). Resultados e Discussão: Curva de calibração O comprimento de onda obtido no espectro de absorção da solução de p- nitrofenol mais concentrada foi de 410nm, sendo este o máximo de absorvância 5 obtido. O p-nitrofenol é uma substância que apresenta dois pontos de absorvância, isto ocorre porque há um equilíbrio ácido-base do p-nitrofenol, apresentando, a forma ácida comprimentos de onda iguais a 314,9 e 320,0nm, enquanto a forma básica apresenta comprimento de onda igual a 410nm. Outro fator que pode ser observado enquanto se fazia as leituras de absorção é que o p-nitrofenol apresenta uma coloração amarelada o que indica estar com um pH = 8 e em pH ácido permanece incolor. Figura 2: Representação do PNP com diferentes colorações. Como pode se observar nos gráficos abaixo, quanto maior a concentração de p-nitrofenol maior a absorvância, isto evidência a equação de Beer Lambert A= ε.b.c onde: A = absorbância (adimensional) b = caminho ótico (cm) c = concentração (mol.L-1) ε* = absortividade molar (mol-1.L.cm-1) ⇒ característico de cada substância em cada λ. Assim observamos no gráfico 1, que a absorvância é diretamente proporcional à concentração da espécie absorvedora de luz e à distância percorrida pelo feixe luminoso através da solução. Gráfico 1 e 2: Espectro de absorvância da solução de PNP (em relação ao tempo e a concentração). 6 Parâmetros cinéticos para a hidrólise do p-nitrofenil acetatoa p-nitrofenol na ausência da enzima A velocidade de uma reação química depende das condições nas quais a reação ocorre. Uns dos fatores que influenciam a velocidade são: pressão, concentração, temperatura e presença de catalisadores. Neste trabalho foi realizado o estudo sobre o efeito da temperatura bem como a utilização de enzimas como catalisadores que serão discutidos posteriormente. Para verificar a influência da temperatura na reação de hidrólise, os tubos foram colocados em diferentes temperaturas de 20°C, 35° e 45°C e em diferentes tempos que variaram de (5, 10, 15, 20, 25 minutos). E a influência da concentração também foi verificada visto que se fez esse estudo em diferentes concentrações. Sabe-se que para que uma reação ocorra é necessário que haja colisões moleculares (efetivas e eficazes) além de uma energia cinética mínima que propicie a ruptura das ligações entres os reagentes e a formação de novas ligações, originado assim os produtos. Essa energia mínima é denominada de energia de ativação (Ea) e quanto maior ela for mais lenta é a reação. Para determinar a velocidade inicial da reação utilizou-se a seguinte equação Equação 1: Fórmula usada para encontrar a velocidade inicial experimental. Logo, utilizando o Excel e o aplicativo solver, foi possível determinar as constantes de velocidades K e a ordens das reações. Nos gráficos 3, 4 e 5, podemos perceber que ao aumentar a concentração dos reagentes ocorre um aumento gradativo na velocidade da reação, isso deixa em evidência que a velocidade da reação é proporcional a concentração dos reagentes. Esse fator é expresso pela lei da ação das massas ou lei cinética (Guldberg e Waage). Onde a velocidade é obtida pela equação: V= K [A]α [B]β sendo que, K é a constante cinética, [A] e [B] são as concentrações molares dos reagentes e α e β são as ordens cinéticas. 7 Em relação à temperatura a velocidade da reação também aumentou de acordo com o aumento da temperatura bem como o valor da sua constante de velocidade (k). Isto ocorre devido à elevação da temperatura aumentar as frequências de colisões intermoleculares e a energia cinética (agitação molecular) favorecendo a ruptura das ligações, fazendo assim com que um maior número de moléculas alcance a energia de ativação mínima – Ea. Gráficos 3, 4 e 5: Velocidades iniciais experimentais e de ajuste em função da concentração do substrato a diferentes temperaturas - 20ºC, 35ºC e 45ºC, respectivamente, sem enzima. Reação Velocidade Inicial Constante de Velocidade Ordem da Reação 20°C 3,72E-10 9,50E-08 0,79 35°C 2,36E-09 9,50E-07 0,92 45°C 5,24E-09 3,10E-06 0,94 Tabela 1: Valores da velocidade inicial, constante de velocidade K e ordem da reação em diferentes temperaturas. 8 A ordem da reação obtida foi 1, isso indica que os expoentes α e β na concentração dos reagentes são 1, ou seja a reação é dita de 1° ordem em relação ao reagente o que implica que ao se dobrar a concentração inicial do reagente o efeito na rapidez da reação aumenta na mesma proporção, ou seja também dobra. Nos gráficos 6, 7 e 8, que nos mostra a concentração em função do tempo, pode-se observar que à medida que a reação se desenvolve os reagentes vão sendo consumidos e consequentemente a concentração de reagentes diminuem até se tornar mínima, e a dos produtos aumenta de acordo com o que vão sendo formados. Nos gráficos abaixo, a quantidade de produtos no início é baixa e começa a aumentar até que no final da reação se torna máxima. Gráficos 6, 7 e 8: [PNP] em função do tempo para as temperaturas de 20ºC, 35ºC e 45ºC, respectivamente, sem enzima. A velocidade da reação catalisada por uma enzima é aumentada devido ao abaixamento da energia de ativação necessária para converter o substrato no 9 produto. Os cálculos e ajustes feitos para a Energia de Ativação sem enzima nos deram como valor 95,1KJ. Gráfico 9 e 10: Gráficos da energia de ativação. Parâmetros cinéticos para a hidrólise do p-nitrofenil acetato a p-nitrofenol catalisada pela enzima α-quimotripsina. A quimotripsina é uma enzima digestiva que é sintetizada pelas células acinares pancreáticas, essa enzima catalisa a hidrólise de peptídeos (amida), sendo que possui uma maior especificidade por resíduos de aminoácidos hidrofóbicos e volumosos (aromáticos). A cinética desta reação é estudada através da hidrólise do éster e da Quimotripsina que pode atuar como uma esterase, bem como um Protease, ou seja, um catalisador enzimático. Esse estudo foi realizado na presença 10 da enzima α-quimotripsina em diferentes temperaturas, sendo elas de 20°C e 35°C. As enzimas não alteram o equilíbrio químico das reações catalisadas, apenas diminuem a energia de ativação. O mecanismo da hidrólise do p-nitrofenil acetato segue abaixo, como mostra a figura 3. Figura 3: Hidrólise do p-nitrofenil acetato. O mecanismo de ação hidrolítica do éster acetato de p-nitrofenil (PNPA), com a enzima α-quimiotripisina segue na Figura 4. Figura 4: Reação do PNPA com a enzima. 11 O mecanismo mais simples para explicar a ação enzimática é o modelo de Michaelis-Mentem que diz que a velocidade é dependende da formação do complexo enzima-substrato ES, sendo que primeiramente ocorre a ligação da enzima ao substrato reversivelmente formando o complexo ES. Representação da reação através da figura 5, passo rápido da reação. Figura 5: Representação geral da reação Em seguida, o complexo ES dissocia-se em enzima livre e produto da reacção sendo que a reação nesta etapa é mais lenta; como mostra a representação da reação figura 6 A curva hiperbólica que representa a relação entre [S] e Vinicial é descrita algebricamente pela equação de Michaelis-Mentem Equação 2: Equação de Michaelis-Mentem. Um dos fatores que afetam a velocidade da reação na presença de enzima é a concentração do substrato, como pode se observar nos gráficos 9 e 10, não se obtém uma reta linear como nos gráficos que foram obtidos na ausência de enzimas conforme aumenta as concentrações do substrato. Esses gráficos apresentam uma curvatura em determinado ponto, isso evidência que existe um ponto máximo de saturação, no qual a reação adquire uma velocidade máxima em que a velocidade aumenta de forma insignificante, ou seja, essas reações catalisadas por enzimas são saturáveis, e a sua velocidade de catálise não é linear, de acordo em que se aumentam as concentrações do substrato. As enzimas que exibem uma dependência hiperbólica de V0 em função de [S] diz-se que seguem a cinética de Michaelis-Mentem. 12 Durante a reação a enzima existe em duas formas, a não ligada ao substrato, ou a forma livre E, e a forma ligada dita complexada ao substrato denominada ES. No gráfico é possível perceber que em concentrações pequenas do substrato [S], a maior quantidade da enzima estará na forma livre (E), ou seja, a velocidade da reação é proporcional à medida que se aumenta o substrato [S] formando ES, o que faz o gráfico ser inicialmente crescente. No entanto, em determinado ponto o gráfico apresenta uma curvatura que se torna praticamente constante, o que permite concluir que a velocidade inicial máxima da reação (Vmáx) foi atingida, ou seja, praticamente todas as moléculas da enzima estão complexadas ao substrato ES, sendo que a concentração da enzima livre E é insignificante,ou seja, a Vmáx é a velocidade máxima que a reacção pode alcançar, na situação em que todas as enzimas se encontram ligadas ao substrato. Neste caso, diz-se que a enzima está “saturada” com o substrato e a velocidade da reação não aumenta mais com os aumentos de [S]. Gráficos 11 e 12: Representação gráfica da velocidade experimental e de ajuste em função da concentração do substrato para as temperaturas de 20ºC e 35ºC, respectivamente, para reação catalisada por enzima. A temperatura é um dos fatores que também influenciam a velocidade de uma reação, observa-se que com a elevação da temperatura indo de 20° C para 35°C houve um aumento na velocidade da reação, pois ao se aumentar a temperatura conseqüentemente aumenta-se a energia cinética e a entropia das moléculas presentes no meio reacional, o que faz com que ocorra um aumento no número de colisões entre os reagentes o que resulta no aumento da velocidade da reação. No 13 entanto, é importante ressaltar que em reações catalíticas na presença de enzimas existe um fator importante que é a temperatura ótima para uma maior atividade enzimática, ou seja, as atividades das enzimas digestivas pancreáticas, como é o caso da quimotripsina são reduzidas em altas temperaturas (36 °C). Isso ocorre em temperaturas elevadas, devido às enzimas sofrerem processos de desnaturação, o que provoca alterações nas ligações químicas que mantêm a estabilidade da molécula e a estrutura tridimensional. Se a temperatura fornecida for capaz de romper as ligações hidrogênio, estas que são relativamente resistentes ao calor, desencadeia-se uma sequência de alterações estruturais, levando a enzima a um novo estado conformacional ou a um estado sem estrutura definida. A temperatura que provoca a desnaturação da enzima, geralmente, está pouco acima da temperatura ótima da mesma. Conclusão: Na determinação das velocidades iniciais nas experiências sem a enzima, podemos perceber que a temperatura e a concentração são uns dos fatores que alteram a velocidade da reação, visto que quanto maior a concentração dos reagentes maior a velocidade da reação, isso deixa em evidência que a velocidade da reação é proporcional à concentração dos reagentes. Já no caso das temperaturas também ocorre um aumento gradativo na velocidade da reação quando se aumenta a temperatura aumenta as frequências de colisões intermoleculares e a energia cinética (agitação molecular) favorecendo a ruptura das ligações e facilitando a formação de produtos. Nos casos das reações com enzimas, observa-se que essas reações apresentam uma menor energia de ativação e uma velocidade de reação maior que as experiências realizadas sem enzimas, no entanto a temperatura é um fator que tem que se levar em consideração devido e enzima apresentar uma temperatura ótima, pois em temperaturas elevadas a enzima desnatura-se e a atividade dela volta a diminuir. Com relação à Energia de Ativação, podemos concluir que o valor obtido para os dados sem enzima está dentro do que prevê a literatura, ou seja, por volta dos 100KJ, enquanto que o valor para com enzima que segundo a literatura tem que ser 14 inferior aos 100KJ, não foi por nós encontrado devido ao fato de erros grosseiros nos cálculos e ajustes. BIBLIOGRAFIA ABUIN, ELSA; LISSI, EDUARDO y BRIDI, RAQUEL. KINETICS OF P - NITROPHENYL ACETATE HYDROLYSIS CATALYZED BY α- CHYMOTRYPSIN IN PRESENCE OF POLYETHYLENE GLYCOL. J. Chil. Chem. Soc. [online]. 2011, vol.56, n.4, pp. 948-950. ISSN 0717-9707. doi: 10.4067/S0717- 97072011000400028. Silvia Jaerger (IC), Carlos A. P. Almeida (PQ), Andreia N. Fernandes (PQ). Cinética da remoção do p-nitrofenol por adsorção em turfa fibrosa. VOET, D.; VOET, J. G.; PRATT, C. W. Fundamentos de bioquímica. [Fundamentals of biochemisthy]. Porto Alegre: Artmed, 2000. 15 ANEXOS 1) Tabela de dados para temperatura de 20ºC com diferentes concentrações sem enzima. [PNPA] stock em etanol (M) 1,20E-03 [PNPA] stock em etanol (M) 2,50E-03 [PNPA] stock em etanol (M) 5,00E-03 t (s) Abs 401 nm [PNP] [PNPA] t (s) Abs 401 nm [PNP] [PNPA] t (s) Abs 401 nm [PNP] [PNPA] 0 0,0335 3,035E-06 0,000247 0 0,044 4,022E-06 0,000246 0 0,055 5,010E-06 0,000245 30 0,0335 3,035E-06 0,000247 30 0,045 4,049E-06 0,000246 30 0,056 5,055E-06 0,000245 60 0,0337 3,053E-06 0,000247 60 0,045 4,095E-06 0,000246 60 0,056 5,082E-06 0,000245 90 0,0338 3,062E-06 0,000247 90 0,046 4,122E-06 0,000246 90 0,057 5,145E-06 0,000245 120 0,034 3,080E-06 0,000247 120 0,046 4,149E-06 0,000246 120 0,058 5,209E-06 0,000245 150 0,0341 3,089E-06 0,000247 150 0,046 4,176E-06 0,000246 150 0,058 5,245E-06 0,000245 180 0,0343 3,107E-06 0,000247 180 0,047 4,212E-06 0,000246 180 0,058 5,290E-06 0,000245 210 0,0343 3,107E-06 0,000247 210 0,047 4,240E-06 0,000246 210 0,059 5,345E-06 0,000245 240 0,0344 3,116E-06 0,000247 240 0,047 4,276E-06 0,000246 240 0,060 5,399E-06 0,000245 270 0,0346 3,134E-06 0,000247 270 0,048 4,312E-06 0,000246 270 0,060 5,435E-06 0,000245 300 0,0347 3,143E-06 0,000247 300 0,048 4,339E-06 0,000246 300 0,060 5,462E-06 0,000245 330 0,0348 3,152E-06 0,000247 330 0,048 4,375E-06 0,000246 330 0,061 5,517E-06 0,000244 360 0,035 3,171E-06 0,000247 360 0,049 4,412E-06 0,000246 360 0,061 5,544E-06 0,000244 390 0,0351 3,180E-06 0,000247 390 0,049 4,439E-06 0,000246 390 0,062 5,580E-06 0,000244 420 0,0351 3,180E-06 0,000247 420 0,049 4,475E-06 0,000246 420 0,062 5,626E-06 0,000244 450 0,0353 3,198E-06 0,000247 450 0,050 4,493E-06 0,000246 450 0,063 5,680E-06 0,000244 480 0,0355 3,216E-06 0,000247 480 0,050 4,529E-06 0,000245 480 0,063 5,725E-06 0,000244 510 0,0356 3,225E-06 0,000247 510 0,050 4,566E-06 0,000245 510 0,064 5,761E-06 0,000244 540 0,0356 3,225E-06 0,000247 540 0,051 4,593E-06 0,000245 540 0,064 5,807E-06 0,000244 570 0,0358 3,243E-06 0,000247 570 0,051 4,629E-06 0,000245 570 0,065 5,861E-06 0,000244 16 2) Tabela de dados para temperatura de 35ºC com diferentes concentrações sem enzima. [PNPA] stock em etanol (M) 1,20E-03 [PNPA] stock em etanol (M) 2,50E-03 [PNPA] stock em etanol (M) 5,00E-03 t (s) Abs 401 nm [PNP] [PNPA] t (s) Abs 401 nm [PNP] [PNPA] t (s) Abs 401 nm [PNP] [PNPA] 0 0,0343 3,10717E-06 0,000246893 0 0,0391 3,54199E-06 0,000246458 0 0,0435 3,94057E-06 0,000246059 30 0,0346 3,13434E-06 0,000246866 30 0,0396 3,58728E-06 0,000246413 30 0,0454 4,11269E-06 0,000245887 60 0,0353 3,19775E-06 0,000246802 60 0,0405 3,66881E-06 0,000246331 60 0,0475 4,30293E-06 0,000245697 90 0,036 3,26116E-06 0,000246739 90 0,0417 3,77752E-06 0,000246222 90 0,0501 4,53845E-06 0,000245462 120 0,0367 3,32458E-06 0,000246675 120 0,0427 3,8681E-06 0,000246132 120 0,0526 4,76492E-06 0,000245235 150 0,0374 3,38799E-06 0,000246612 150 0,0439 3,97681E-06 0,000246023 150 0,0547 4,95516E-06 0,000245045 180 0,0381 3,4514E-06 0,000246549 180 0,0449 4,0674E-06 0,000245933 180 0,0571 5,17257E-06 0,000244827 210 0,0388 3,51481E-06 0,000246485 210 0,0462 4,18516E-06 0,000245815 210 0,0596 5,39904E-06 0,000244601 240 0,0397 3,59634E-06 0,000246404 240 0,0475 4,30293E-06 0,000245697 240 0,0621 5,62551E-06 0,000244374 270 0,0405 3,66881E-06 0,000246331 270 0,0485 4,39351E-06 0,000245606 270 0,0645 5,84292E-06 0,000244157 300 0,0414 3,75034E-06 0,00024625 300 0,0498 4,51128E-06 0,000245489 300 0,067 6,06939E-06 0,000243931 330 0,0422 3,82281E-06 0,000246177 330 0,051 4,61998E-060,000245380 330 0,0698 6,32304E-06 0,000243677 360 0,0429 3,88622E-06 0,000246114 360 0,0522 4,72869E-06 0,000245271 360 0,0723 6,54951E-06 0,00024345 390 0,0438 3,96775E-06 0,000246032 390 0,0535 4,84645E-06 0,000245154 390 0,0749 6,78503E-06 0,000243215 420 0,0447 4,04928E-06 0,000245951 420 0,0547 4,95516E-06 0,000245045 420 0,0775 7,02056E-06 0,000242979 450 0,0454 4,11269E-06 0,000245887 450 0,056 5,07292E-06 0,000244927 450 0,0801 7,25609E-06 0,000242744 480 0,0463 4,19422E-06 0,000245806 480 0,0574 5,19975E-06 0,000244800 480 0,0827 7,49162E-06 0,000242508 510 0,047 4,25763E-06 0,000245742 510 0,0585 5,29939E-06 0,000244701 510 0,0853 7,72715E-06 0,000242273 540 0,0479 4,33916E-06 0,000245661 540 0,0598 5,41716E-06 0,000244583 540 0,0878 7,95362E-06 0,000242046 570 0,0488 4,42069E-06 0,000245579 570 0,0611 5,53492E-06 0,000244465 570 0,0905 8,19821E-06 0,000241802 17 3) Tabela de dados para temperatura de 45ºC com diferentes concentrações sem enzima. [PNPA] stock em etanol (M) 1,20E-03 [PNPA] stock em etanol (M) 2,50E-03 [PNPA] stock em etanol (M) 5,00E-03 t (s) Abs 401 nm [PNP] [PNPA] t (s) Abs 401 nm [PNP] [PNPA] t (s) Abs 401 nm [PNP] [PNPA] 0 0,0326 2,95317E-06 0,000247047 0 0,0402 3,64E-06 0,000246 0 0,0542 4,90987E-06 0,00024509 30 0,0334 3,02564E-06 0,000246974 60 0,0447 4,05E-06 0,000246 30 0,0579 5,24504E-06 0,000244755 60 0,0345 3,12528E-06 0,000246875 120 0,0503 4,56E-06 0,000245 60 0,0623 5,64363E-06 0,000244356 90 0,0359 3,25211E-06 0,000246748 180 0,0569 5,15E-06 0,000245 90 0,0676 6,12E-06 0,000244 120 0,0373 3,37893E-06 0,000246621 240 0,064 5,8E-06 0,000244 120 0,0732 6,63104E-06 0,000243369 150 0,0389 3,52387E-06 0,000246476 300 0,0715 6,48E-06 0,000244 150 0,079 7,15645E-06 0,000242844 180 0,0405 3,66881E-06 0,000246331 360 0,0792 7,17E-06 0,000243 180 0,0856 7,75433E-06 0,000242246 210 0,042 3,80469E-06 0,000246195 420 0,0872 7,9E-06 0,000242 210 0,0923 8,36126E-06 0,000241639 240 0,0437 3,95869E-06 0,000246041 480 0,0951 8,61E-06 0,000241 240 0,0995 9,0135E-06 0,000240987 270 0,0455 4,12175E-06 0,000245878 540 0,1033 9,36E-06 0,000241 270 0,1069 9,68385E-06 0,000240316 300 0,0473 4,28481E-06 0,000245715 600 0,1112 1,01E-05 0,00024 300 0,1142 1,03451E-05 0,000239655 330 0,0492 4,45693E-06 0,000245543 660 0,1194 1,08E-05 0,000239 330 0,1219 1,10427E-05 0,000238957 360 0,051 4,61998E-06 0,00024538 720 0,1274 1,15E-05 0,000238 360 0,1298 1,17583E-05 0,000238242 390 0,0529 4,7921E-06 0,000245208 780 0,1356 1,23E-05 0,000238 390 0,1376 1,24649E-05 0,000237535 420 0,0548 4,96422E-06 0,000245036 840 0,1436 1,3E-05 0,000237 420 0,1455 1,31805E-05 0,000236819 450 0,0567 5,13633E-06 0,000244864 900 0,1517 1,37E-05 0,000236 450 0,1534 1,38962E-05 0,000236104 480 0,0588 5,32657E-06 0,000244673 960 0,1597 1,45E-05 0,000236 480 0,1615 1,46299E-05 0,00023537 510 0,0607 5,49869E-06 0,000244501 1020 0,1677 1,52E-05 0,000235 510 0,1695 1,53547E-05 0,000234645 540 0,0628 5,68892E-06 0,000244311 1080 0,1756 1,59E-05 0,000234 540 0,1775 1,60794E-05 0,000233921 570 0,0647 5,86104E-06 0,000244139 1140 0,1835 1,66E-05 0,000233 570 0,1855 1,68041E-05 0,000233196
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