apostila Micro Biorremediation

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Microbiologia da Biorremediação 
 
Prof: Fabio A. Chinalia 
 
 
 
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1. Biodegradação com crescimento microbiano 
 
Os microrganismos são capazes de crescer e produzir biomassa porque conseguem 
transformar quimicamente vários compostos químicos orgânicos e inorgânicos. Nesse 
processo de transformação os microrganismos obtêm o carbono, nitrogênio, fosforo, 
enxofre, e outros elementos químicos necessários a vida. Portanto, para que os 
microrganismos cresçam é necessário que eles sejam capazes de transformar as 
substancias químicas. 
A degradação de substancias sintéticas (xenobioticas) pode ser um fator limitante 
para o crescimento microbiano e, consequentemente, para o processo de biorremediacao. 
A grande maioria dos processos de biorremediacao se apoiam nessa capacidade que os 
organismos possuem em utilizar essas substancias. 
Para que a estratégia de biorremediacao seja bem sucedida é necessário que o 
microrganismo utilize a substancia a ser tratada ou como fonte de carbono ou como fonte 
de energia, preferencialmente, os dois. 
 
 
 
 
Geralmente os testes de 
biorremediacao iniciam-se com testes de 
degradação onde um microrganismo 
especifico é exposto a um composto 
especifico e a cinética de crescimento e 
transformação é observada e medida. A 
princípio, quanto mais rápido e ávido um 
microrganismo pelo substrato melhor seria 
sua atuação como agente biorremediador. 
 
 
 
No entanto existem vários outros fatores que influenciam no processo de 
biorremediacao. Um exemplo seria a presença de fontes alternativas de carbono ou 
energia. Embora no laboratório um microrganismo pode crescer rapidamente em uma 
substancia poluidora, no ambiente podem existir outras fontes orgânicas mais vantajosas 
para o seu crescimento. Dessa forma, o processo de biorremediacao deve levar em conta a 
disponibilidade desses compostos no ambiente para poder gerenciar os planos ou 
estratégias de biorremediacao. 
Várias espécies de bactérias e fungos tem sido isolados com a capacidade de 
crescer na mais variada composição orgânica natural ou sintética. Quando existe uma 
relação entre o crescimento microbiano e o consumo da substancia em tratamento 
geralmente observa-se um padrão definido chamado de cinética de degradação ou 
biorremediacao. Um organismo especifico irá degradar um composto em uma velocidade 
especifica a espécie. 
 
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As regras básicas para a degradação nesses casos são: 
i. Presença de microrganismos decompositores 
ii. Presença de concentrações adequadas da substancia 
iii. Presença de aceptores de elétrons para sustentar o metabolismo microbiano 
(por exemplo, oxigênio). 
iv. Fatores inibidores ou limitantes (nutrientes e variáveis abióticas). 
 
2. Eficiência da transformação metabólica 
 
Existem maneiras de se medir a eficiência desse processo metabólico de 
biorremediacao. Uma das formas é calcular a percentagem de carbono presente na 
substancia que foi transformada em biomassa microbiana. Esse cálculo descreve a 
eficiência com que o microrganismo desempenhou o processo de biodegradação. Para 
atingir esse calculo é necessário o uso da seguinte formula: 
 
Cassimilado = Csubstrato – Cmineralizado 
 
i. O carbono assimilado refere-se a biomassa de microrganismo 
ii. O carbono do substrato refere-se a massa presente no substrato 
iii. O carbono mineralizado refere-se a massa de C transformada em CO2 
 
A eficiência desse processo varia significativamente de acordo com a espécie de 
microrganismos e o tipo de substancia a ser tratada (Tabela abaixo). 
 
 
 
 
 
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Existem casos onde o processo de mineralização pode suplantar o processo de 
fixação de carbono na biomassa. Subba-Rao et al (1982) demonstraram que 93-98% dos 
300 g l-1 benzoato, fenol ou 2,4-D presente em agua de lago foram mineralizados 
diretamente em CO2 e agua. Esse fato exemplifica que embora alguns microrganismos 
sejam capazes de obter energia a partir de benzoato, fenol ou 2,4-D, estes não utilizam 
esses compostos como fonte de carbono no processo de formação de biomassa. 
Seto & Alexandre (1985) também observaram que esse fenômeno pode estar 
associado as concentrações das substancias que estão sendo biodegradadas. Os autores 
reportam que a glicose em concentrações abaixo de 100 g l-1 não é transformada em 
biomassa e sim diretamente mineralizada. No entanto, acima desse valor, esses mesmos 
autores demostraram que a quantidade de carbono mineralizado e transformado em 
biomassa não parece variar mais. Isso é, a partir de um valor especifico o metabolismo 
microbiano se adapta para a formação de biomassa através de um processo duplo de 
aproveitamento de carbono e de energia contida na substancia a ser degradada. 
Nem todas as substancias são passiveis de tratamento por biorremediacao usando 
microrganismos. Os metais pesados como chumbo, cadmio, mercúrio, etc, são exemplo de 
substancias que não passam por nenhum processo de decomposição. Os metais podem 
mudar sua “especiação” (carga elétrica), podem acumular ou serem absorvidos, mas, não 
são degradados em elementos mais simples. Por outro lado, a matéria orgânica pode ser 
transformada em dióxido de carbono e agua. A abosorcao por resinas, matrizes orgânicas 
ou fitorremediacao são estratégias de biorremediacao mais adequadas para tratar a 
presença de metais presados no ambiente. 
 
 
3. Tipos nutricionais 
 
Os microrganismos podem ser 
classificados como mostra o quadro ao 
lado em relação sua capacidade de utilizar 
as substancias orgânicas como fonte de 
energia e fonte de carbono. 
 
Quando uma substancia não pode 
ser utilizada como fonte de carbono é 
necessário complementar o processo 
metabólico para que ocorra produção de 
biomassa microbiana. Nesses casos o CO2 
atmosférico pode ser usado como fonte de 
carbono e as substancia como fonte de 
energia. 
 
OBS: a luz é a fonte de energia dos 
fototróficos e o CO2 a fonte de carbono. 
Agindo dessa forma esses organismos (algas 
e plantas) são raramente utilizados como 
agentes biorremediadores. 
 
 
 
 
 
 
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4. Tipos de metabolismo 
 
1. Fermentação 
 
 
2. Respiração aeróbia 
 
C6H12O6 + 6 O2 → 6 CO2 + 6 H2O 
 
 
 
3. Respiração anaeróbia ou 
“desnitrificação” 
 
C6H12O6 + 4NO3 → 6 CO2 + 6 H2O + 2N2 
 
OBS: Hidrogênio = eléctron, portanto 
nesse contexto existem os doadores de 
elétrons e os aceptores de elétrons. 
Existem 3 formas microbiológicas 
básicas de geração de energia a partir da 
degradação de substancias orgânicas: 
i. Fermentação 
ii. Respiração aeróbia 
iii. Respiração anaeróbia 
 
Em todas elas o “hidrogênio” presente 
nas ligações com o carbono (chamado de 
elétron) deve ser transferido para um 
“aceptor” final. No caso da fermentação o 
etanol é um aceptor final desse “elétron”. A 
matéria orgânica é chamada de “doador de 
elétrons”. No exemplo da respiração aeróbia e 
anaeróbia, o doador de elétrons é a glicose e 
os aceptores finais de elétrons são o oxigênio 
e o nitrato, respectivamente. 
Note que o aceptor de final de elétrons 
de um processo fermentativo é um composto 
orgânico. Isso não ocorre nos outros 
processos metabólicos usados nesse 
exemplo. 
 
 
 
5. Rendimento energético dos metabolismos 
 
O rendimento de energia de 
um processo metabólico 
depende do tipo de reação 
utilizada. A maior 
quantidade deenergia é 
formada quando o oxigênio 
é utilizado como aceptor 
final de elétrons. Depois do 
oxigencio cita-se o nitrato e 
o sulfato como compostos 
mais comumente utilizados 
pelos microrganismos 
 
OBS: a quantidade de energia gerada na 
respiração anerobia é menor que a aerobia. Por 
isso, os microrganismos tem um rendimento de 
crescimento menor em reações anaeróbias. 
 
 
 
 
 
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6. Etapas do processo de biodegradação 
 
É muito importante entender que para um microrganismo biodegradar uma 
substancia orgânica é necessário que esta substancia entre dentro da célula. A célula 
microbiana não possui boca ou aparelho mastigador, portanto, a única maneira que existe 
para essa substancia entrar dentro da célula é através da atuação de exoenzimas que 
transformam as substancias poliméricas em seus respectivos monômeros. 
As proteínas, lipídios e vários tipos de açúcares são exemplo de substancias 
poliméricas compostas de monômeros como aminoácidos, ácidos graxos e açúcares 
menores. As vezes as substancias poluidoras são também muito grandes ou se arranjam 
em estruturas poliméricas que precisam ser previamente degradadas para poderem entrar 
dentro da célula; por exemplo, o petróleo. 
O processo de biorremediacao só pode acontecer se a substancia entrar dentro da 
célula microbiana, pois, qualquer transformação que ocorra a essa substancia fora desse 
ambiente não resulta em aproveitamento de energia e geração de biomassa. 
É claro que existe possibilidade de mudanças e atenuações causadas apenas pela 
transformação extracelular de substancias toxicas, mas, esse processo é feito de forma 
aleatória, ou seja, não é fácil de controlar ou gerenciar. 
Para que um plano de biorremediacao seja bem sucedido é necessário controlar o 
processo para que ele chegue até o seu final de forma prevista ou “modelável”. Por isso, é 
necessário conhecer os tópicos da figura abaixo: 
 
 
i. Atuação de 
exoenzimas 
ii. Matriz aquosa de 
difusão 
iii. Processo de 
assimilação 
iv. Metabolismo 
microbiano 
 
 
7. Biodisponibilidade 
 
 Uma substancia é considerada 
“biodisponivel” tanto quanto esta é solúvel em 
agua. 
 Quando uma substancia entra em um 
sistema ambiental como o solo, parte dessa 
substancia se “fraciona” ou se “divide” de 
forma diferente nos seguintes constituintes 
do solo: 
i. Partículas inorgânicas 
ii. Partículas orgânicas 
iii. Matrix aquosa 
iv. Bolhas de gás 
Calculando coeficientes de 
biodisponibilidade 
 
Octanol
Water 
 
 O “coeficiente de particão” é uma 
forma de calcular quão biodisponivel é um 
composto organico no ambiente. 
 
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 Geralmente a parte que se separa na 
matrix aquosa é a considerada 
“biodisponivel” para os microrganismos. 
 
 Isso acontece porque as substancias 
que estão presente no solo e que vão ser 
biorremediadas pelos microrganismos devem 
primeiro talvez reagir com as exoenzimas das 
células, difundir no meio aquoso e então 
penetrar na célula para ser decomposta 
intracelularmente. 
 
 Esse processo de difusão na matriz 
aquosa muitas vezes controla o processo de 
biorremedicao. Portanto, a cinetica ou 
velocidade de biorremediacao de um solo 
pode estar diretamente associada aos 
processos de difusão que pode ser chamado 
de “biodisponibilidade”. 
 
 Os microrganismos possuem 
mecanismos para melhorar a 
biodisponibilidade de várias substancias no 
ambiente. Por exemplo, são várias as 
bactérias que produzem biosurfactantes que 
auxiliam na dissolução de petróleo 
aumentando sua biodisponibilidade e assim 
acelerando o processo de biorremediação. 
 Ao se adicionar um composto organico 
em um frasco erlen contendo uma mistura 
de octanol (solvente organico), agua e ar, 
imita-se as condicoes de um solo, por 
exemplo. 
 O composto organico pode se 
dissolver melhor no octanol do que na 
agua, nesse caso ele será menos 
biodisponivel para os microrganismos. 
 Caso o composto organico prefira 
mistura-se com a água, esse composto 
será mais biodisponivel para os 
microrganismos. 
 Portanto, para se calular e prever o 
quanto um composto será biodisponivel em 
um ambiente é calculado o “coeficiente de 
partição” especifico desse composto. 
 Esse calculo é feito variando-se as 
concentracoes do composto especifico (a, 
b, c ou d) para observar se tais 
concentraçoes afetam na proporção 
dissolvida no octanol. 
Ad
so
rp
tio
n c
oe
ffic
ien
t
concentration
a
b
d
c
 
No gráfico vemos que as concentrações das substancias a, b, c e d que 
aparecem dissolvidas no octanol (valores do eixo Y) variam de acordo com a 
concentração colocada no frasco teste (eixo X). As regressões lineares desses 
pontos mostram que para cada composto existe um coeficiente de inclinação 
especifico. Esse coeficiente de inclinação é conhecido como “coeficiente de 
partição” e descreve quão biodisponivel será o composto no ambiente. Nesse 
exemplo, o composto “d” será o mais biodisponivel. 
 
 
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8. Conceitos básicos de metabolismo microbiano 
 
O processo de degradação (catabolismo) é 
geralmente a atividade metabólica mais 
importante para o microrganismo desempenhar 
suas funções de biorremediador (obter energia e 
carbono). 
Didaticamente, podemos sistematizar as vias 
metabólicas nas etapas abaixo. 
 
 
 
É importante ressaltar que a na fermentação não 
ocorre o ciclo de Krebs e a cadeia de transporte, 
esses dois últimos acontecem durante os 
processos de respiração (aerobia e anaeróbia). 
O metabolismo é normalmente dividido 
em dois grupos: 
 Reacções catabolicas, que são 
aquelas que aproveitam a energia 
química de uma substancia para gerar 
mais ATP dentro dos microrganismos. 
 Reacoes anabólicas, que são aquelas 
que consomem energia para produzir 
novos compostos orgânicos dentro dos 
microrganismos. 
 
Esses dois metabolismos estão 
interligados. Os produtos intermediários 
do catabolismo podem ser utilizados por 
vias anabólicas para a produção de 
proteína, gorduras e lipídios do 
microrganismo. 
 
Por exemplo, a acetil coenzima A 
gerada no ciclo de Krebs é a substancia 
chave para a produção de vários 
aminoácidos e ácidos graxos que irão 
compor as proteínas e gorduras 
microbianas. 
 
 
 
 
9. Vias metabólicas importantes 
 
A Glicólise 
Glicólise é a sequência metabólica composta por um conjunto de dez reações catalizadas 
por enzimas livres no citosol, na qual a glicose é oxidada produzindo duas moléculas de 
piruvato, duas moléculas de ATP e dois equivalentes reduzidos de NADH+, que serão 
introduzidos na fermentação ou na cadeia respiratória. 
 
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A fermentação 
A fermentação é um processo anaeróbio de síntese de ATP sem o envolvimento da cadeia 
respiratória. No processo aqui tratado, o aceptor final de hidrogênios é um composto 
orgânico o etanol e por este motivo constitui um metabolismo contrastante com a 
Respiração Celular, cujo o aceptor de eletron é geralmente uma substancia inorgânica. 
 
 
 
O ciclo de Krebs 
Trata-se de uma parte do metabolismo dos microrganismos onde o piruvato formado na 
glicólise é transformado em uma serie de reações que liberam o hidrogênio(elétrons) e 
assim os disponibiliza para alimentar uma reação em cadeia que vai gerar ATP. Essa 
reação é chamada de fosforilação oxidativa ou “cadeia respiratória”. 
 
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Cadeia respiratória Parte 1 
Os elétrons que são capturados e transportados pelas NADs no cilco de Krebs são 
transportados até o complexo de citocromos onde as reações de oxirredução em cadeia 
geram uma corrente elétrica capaz de gerar ATP. No final esse hidrogênio (eletron) pode 
se ligar ao Oxigenio no caso das reações aeróbias, ou pode se ligar a um composto como 
o NO3 no caso das reações anaeróbias. 
 
 
 
 
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Cadeia respiratória Parte 2 
O princípio das reações de oxirredução baseia-se na reação em cadeia que vai gradativamente mas 
rapidamente diminuindo o potencial energético do elétron até que a ligação com o aceptor final ocorre de 
forma controlada para gerar ATP 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Vias metabólicas: Resumo 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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10. Incluindo degradação e produção de proteínas e lipídios a via central que é o 
ciclo de Krebs (Acetil-CoA) 
 
 
O catabolismo ocorre em três 
estágios: 
• Primeiro estágio: as moléculas 
nutrientes complexas (proteínas, 
carboidratos e lipídeos 
não−esteróides) são quebradas em 
unidades menores: aminoácidos, 
monossacarídeos e ácidos graxos 
mais glicerol, respectivamente. 
• Segundo estágio: os produtos do 
primeiro estágio são transformados 
em unidades simples como a 
acetil−CoA (acetil coenzima A) que 
exerce papel central no 
metabolismo. 
• Terceiro estágio: a acetil−CoA é 
oxidada no ciclo do ácido cítrico a 
CO2 enquanto as coenzimas NAD+ 
e FAD são reduzidas por quatro 
pares de elétrons para formar três 
NADH e um FADH2. As 
coenzimas reduzidas transferem 
seus elétrons para o O2 através da 
cadeia mitocondrial transportadora 
de elétrons, produzindo H2O e ATP 
em um processo denominado 
fosforilação oxidativa. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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11. Ciclo celular 
 
 
Durante o processo de obtenção de energia e carbono o 
microrganismo cresce. 
Esse processo começa timidamente e de forma aleatória (não 
organizada) por um tempo, mas, se a fonte de alimento não 
faltar, com o tempo, todas as células sincronizam o seu 
crescimento. Esse resultado é conhecido como “curva de 
crescimento”. 
 
Vale a pena ressaltar que esse fenômeno microbiológico 
é facilmente observável em condições de laboratório, 
mas, no ambiente isso pode não acontecer por causas 
de limitações como “biodisponibilidade” do alimento. 
 
 
12. Biorremediação do tolueno 
 
Algumas bactérias possuem a capacidade de crescer utilizando substancias toxicas 
como tolueno, benzeno e etilbenzeno. Essas bactérias assim o fazem porque possuem um 
complexo enzimático capaz de transformar o tolueno em substancias intermediarias do 
metabolismo comum da célula. 
A quantidade de energia que é liberada no processo de “biodegradação” do tolueno 
é suficiente para fazer a célula crescer e também serve como fonte de carbono para a 
produção de mais biomassa microbiana. 
Dentre as espécies de bactéria capazes de degradar o tolueno, cada uma pode 
utilizar uma via metabólica diferente de acordo com sua informação genética. Diferenças 
genéticas e estruturais de cada espécie alteram a eficiência desse processo de 
degradação, por isso, existem espécies mais eficientes do que outras no processo de 
biorremediação. 
A ilustração abaixo mostra que algumas espécies possuem vias diferentes para 
transformar o tolueno em um composto intermediário do metabolismo microbiano que é o 
composto chamado de catecolato. 
 
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 A velocidade ou cinética com que esse processo ocorre no ambiente depende de vários 
fatores fisiológicos e abióticos do ambiente. 
 
 
13. A significância de ser muito pequeno 
 
Os procariotos variam de tamanho que pode ir de 0,2 a 50 mm em diâmetro. 
Existem apenas alguns que possuem tamanho de 80 mm ou maior como as bactérias 
sulfurosas ou cianobactérias. A difusão de material no interior da célula limita o tamanho 
desses organismos, pois, quanto maior a célula mais lentamente as substancias difundem 
de um lado a outro da célula. 
Existem vantagens significativa em ser pequeno. Por exemplo, nutrientes e produtos 
de excressao se defundem mais rapidamente em células pequenas do que em amiores. 
Portanto, as celulas pequenas podem apresentar um metabolismo mais acelerado do que 
celulas maiores. 
Considerando o caso de uma esfera, o volume da esfera é uma função cubica da 
metade do diâmetro (o radio): 
V = 4/3 π r2 
Para calcular a superfície de um volume utiliza-se a função quadrada: 
S = 4 π r2 
Agora é possivel fazer a relação entre superfície e volume de uma esfera celular: 
Rs/v = S/V 
 
 
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Portanto, a conclusão da comparação do cálculo entre superfície e volume de 
células muito pequenas é que elas possuem uma maior superfície do que volume celular. 
Qual a importância disso? 
As células menores são mais competentes para “roubar” nutrientes do ambiente que 
células maiores porque elas possuem mais superfície de contato com o ambiente do que 
células grandes.