2016816 115225 Microscopia

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Microscopia 
Tipos de Microscópios 
• Microscópios Óticos 
 Usam feixe de luz e lentes ópticas de cristal para produzir 
a imagem 
 
• Microscópios Eletrônicos 
 Usam feixe de elétrons e lentes eletromagnéticas para 
produzir a imagem 
Dimensões de estruturas vivas 
Microscópio simples ou lente de aumento 
usada por Anton von Leeuwenhoek - 1675 
Microscópios Óticos Simples 
Primeiras descrições de 
protozoários, bactérias, e de 
espermatozóides – chamados 
por ele de “animáculos”. 
Aumento de 200 x 
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Microscópios Óticos compostos 
Final do século XIX 
Microscópio monocular 
inventado pelo britânico 
Robert Hooke por volta de 
1690 Microscópio binocular 
Microscópio Ótico Composto Atual 
A imagem da amostra é obtida 
quando os raios de luz de um 
iluminador ( fonte de luz) 
passam através de um 
condensador, que possuem 
lentes que dirigem os raios de 
luz através da amostra. Em 
seguida os raios de luz passam 
para as lentes objetivas. A 
imagem da amostra é 
novamente ampliada pela lente 
ocular, junto aos olhos 
Microscópio ótico composto 
Formação da Imagem 
Esquema da Formação da Imagem 
AMPLIAÇÃO TOTAL = Aumento da Objetiva X Aumento da Ocular 
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É a Capacidade do sistema em distinguir objetos que estão muito 
próximos. Ou seja a capacidade de “resolver” os detalhes dessa 
imagem 
PODER DE RESOLUÇÃO 
Olho ~ 0.1mm; ML ~ 0.2μm; MEV ~ 1-3nm; MET ~ 0.2-0.4m. 
O Limite de resolução depende do comprimento de onda (λ) da 
radiação utilizada e da abertura numérica (AN) das lentes utilizadas. 
  
Limite de Resolução =__________________________ 
 AN objetiva + AN condensador 
Limite de Resolução 
O limite de resolução (LR) pode ser definido como a distância 
mínima entre dois pontos de modo que as respectivas imagens, 
fornecidas pelo sistema óptico, sejam distintas. 
O limite de resolução é inverso do poder resolvente, isto é, quanto 
menor o limite de resolução de uma lente objetiva, maior é o seu 
poder de resolução. 
ABERTURA NUMÉRICA 
 
ONDE : 
 n = índice de refração do meio entre a lente frontal e o objeto 
 = semi-ângulo formado pelo eixo óptico. 
n = 1  quando o meio é o ar, se emprega objetivas a seco 
n =1,52  quando o meio é o óleo de imersão e se emprega objetiva de 
imersão 
 
 Para o olho humano, o limite de resolução é de, sensivelmente, 0,1 
mm. Isto significa que a olho nu apenas conseguimos distinguir 
objetos distanciados entre si até 0,1 mm. 
 
 
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Microscopia ótica - sistema de lentes para direcionar o 
caminho que o feixe de luz percorre entre o objeto a ser 
estudado e o olho. Os principais tipos são: Microscopia 
luminosa, de campo escuro, de ultravioleta, de fluorescência e 
de contraste de fase 
 
 
Microscopia eletrônica - Feixe de elétrons controlado por 
um sistema de campo magnético. Os principais tipos são: 
Microscopia eletrônica de transmissão (TEM); Microscopia eletrônica 
de varredura (SEM) 
 
TIPOS DE MICROSCOPIA MICROSCOPIA ÓTICA 
 a) Microscopia de campo claro 
 
• A área observada aparece brilhantemente iluminada (clara) e os objetos 
estudados mais escuros contra 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
APLICAÇÃO 
• Na determinação de elementos morfológicos grosseiros de 
microrganismos 
• No estudo de motilidade e reprodução em microrganismos maiores 
(protozoários). 
Bactérias coradas pelo 
método de Gram 
• A luz dispersada entra na objetiva e o objeto aparece iluminado e 
brilhante sobre um fundo escuro. Isso se consegue pela utilização de um 
tipo especial de condensador que ilumina o objeto obliquamente. 
 
 
 
 
 
 
• Torna possível a visualização de partículas ou objetos muito pequenos, 
que não podem ser visualizados por microscopia de campo claro. 
• Mostra com maior clareza o contorno de objetos maiores que são difíceis 
de se observar porque o índice de refração é próximo ao do meio em que 
estão suspensos. 
• É um tipo de microscopia utilizada na observação de microorganismos não 
corados, suspensos em líquidos – preparações a fresco e em gota 
pendente. 
 
b) Microscopia de Campo Escuro 
Aplicação: 
 
• Na determinação de certas bactérias, por exemplo as espiroquetas 
 
• Requerimentos: condensadores especiais, óleo de imersão 
 
 
 
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Grande parte dos detalhes de células vivas não são detectados no 
microscópio de campo luminoso devido ao fato de as estruturas celulares 
serem transparentes e incolores, não apresentando contraste suficiente. 
 
O microscópio de contraste de fase tem um sistema óptico especial que 
torna possível a distinção de materiais biológicos que diferem ligeiramente 
no que se refere aos seus índices de refração. 
 
A luz que passa através de materiais com densidades ligeiramente 
diferentes é refratada ou desviada do seu trajeto original. 
 
Variações mínimas de fase, devidas às diferenças de índice de refração 
dentro do objeto, são ampliadas e transformadas em mudanças de 
amplitude (intensidade) as quais são visualizadas como diferenças de 
contraste na imagem. 
c) Microscópia de contraste de fase Aplicação 
• aplicado na visualização de características estruturais com diferenças 
muito sutis no seu índice de refração 
• células únicas contidas em espécimes muito finos (< 5 µm) e não 
coloridos, que são muito pobres em contraste 
• Requerimentos: objetivas especiais, condensadores especiais. 
 
 
 
 
 
 
 
 Corte transversal de um osso Espécime de fase fina 
 
 
 
 
 Neurônios 
 d) Microscopia de Ultravioleta 
• Utiliza luz ultravioleta 0,18 m <  < 0,4 m 
 
• Permite melhorar o limite de resolução comparativamente ao microscópio 
de campo luminoso. 
 
• A óptica é constituída por lentes de quartzo já que o vidro não transmite 
este tipo de radiação. 
 
• A imagem é registrada numa câmara fotográfica pelo uso de um 
conversor de imagem ou pela projeção numa tela de televisão 
 
 
Aplicação 
• Diferenciação de componentes celulares que absorvem a luz ultravioleta 
 
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e) Microscópia de fluorescência 
 
Fluorescência ===> propriedade de algumas substâncias que após serem 
excitadas com radiação de baixo comprimento de onda (ultravioleta), 
emitirem radiação de maior comprimento de onda. 
 
Quando microrganismos com um fluorocromos (corantes fluorescentes) são 
examinados com microscópio de fluorescência, com uma fonte de luz 
ultravioleta, parecem luminosos, brilhantes contra um fundo escuro. 
Requerimento: microscópio ótico, luz ultravioleta, filtro adequados 
 Pode usar substâncias química fluorescentes (fluorocromos) 
 
 
 
Proteínas fluorescentes 
Microscopia eletrônica 
O primeiro microscópio foi construído em 1931, na Universidade Técnica 
de Berlim, por Max Knoll e Ernst Ruska. 
 Ao invés de utilizar lentes de vidro o ME utiliza lentes eletromagnéticas 
 
Emprega um feixe de elétrons em vez de lentes óticas 
 
Os Elétrons acelerados por diferença de potencial de 50 000 a 100 000 
volts têm um comprimento de onda cerca de 100. 000 vezes menor que 
o da luz visível. 
 
 
 Com o valor de λ reduzido o poder de resolução é muito maior que do 
m.o. 
 
 O limite de resolução do microscópio eletrônico de transmissão atinge 
 0,4 a 0,5 nm (excepcionalmente 0,2 nm) 100 vezes maior microscópio 
óptico 
Tipos de Microscopia Eletrônica: 
 
Microscopia eletrônica de Transmissão(TEM) 
 
Microscopia eletrônica de varredura (MEV) 
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Imagem no Microscópio Eletrônico 
 a) Microscópio de transmissão b) Microscópio de varredura