Avaliação e criopreservação de sêmen em garanhão

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Avaliação e 
Criopreservação de 
Sêmen em Garanhão 
REALIZAÇÃO: 
 
Coordenadores: 
 
Gilberto Guimarães Lourenço 
Médico Veterinário-Mestrando em Reprodução Animal-UFV 
Responsável técnico pelo Haras LaGlória 
 
Rafael Guedes Goretti 
Médico Veterinário-Mestre em Reprodução Animal-UFV 
Responsável técnico pelo Haras Três Corações e outros 
 
Renan Reis de Oliveira 
Médico Veterinário – Mestrado em Reprodução Animal – UFV 
Doutorando em Reprodução Animal - UFV 
 
 
 
Parceiros:
 
VIÇOSA-MG 
Edição I 
 
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Apresentação: 
 
A falta de seleção na espécie eqüina para fatores ligados a reprodução, 
levou a realidade que temos agora, onde os eqüinos, de uma forma geral, são 
tidos como animais de baixa fertilidade. 
Conhecimentos sobre as características reprodutivas da espécie e saber 
avaliar o potencial reprodutivo de garanhões pode maximizar o uso de alguns 
animais e evitar grandes prejuízos devido a baixa fertilidade do macho durante 
a estação de monta. 
O advento de novas técnicas de avaliação do sêmen, somado às 
antigas, podem propiciam uma resposta cada vez mais precisa sobre o real 
potencial fértil de determinado indivíduo. O conhecimento destas técnicas é de 
extrema importância para profissionais envolvidos na reprodução de eqüinos. 
Com o desenvolvimento da inseminação artificial técnicas como o 
resfriamento e o congelamento de sêmen passaram a ser desenvolvidas. Hoje, 
o uso do sêmen resfriado e cada vez mais, do sêmen congelado, faz parte da 
rotina de profissionais envolvidos com cavalos. Se manter atualizado sobre 
novidades das técnicas de criopreservação pode ser o diferencial e garantir um 
mercado ainda novo para profissionais da área. 
Este curso tem por objetivo transmitir aos alunos importantes 
conhecimentos básicos e aplicados à reprodução de equinos, manejo 
reprodutivo e as artimanhas do dia-a-dia do profissional de campo. 
 Ao final do curso, espera-se que o aluno esteja apto a executar os 
diferentes métodos de resfriamento e congelamento de sêmen, bem como, 
conhecendo os principais métodos de avaliar o potencial fértil de garanhões. 
 
 
 
Gilberto Guimarães Lourenço 
 
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Rafael Guedes Goretti 
Renan Reis de Oliveira 
SUMÁRIO 
 
 
1 – Introdução.................................................................................................... 1 
2- Métodos de Avaliação do Sêmen Equino...................................................... 4 
2.1- Avaliação do Sêmen na Rotina de Haras............................................... 4 
2.2- Avaliações Realizadas para Animais Problema ou em Pequisas com 
Sêmen de Garanhões..................................................................................... 9 
2.3- Considerações Finais............................................................................ 14 
3- Resfriamento de Sêmen Equino................................................................... 15 
3.1 –Tipos de Contêiner para Refrigeração e Transporte de Sêmen Equino 
...................................................................................................................... 16 
3.2- Meios Diluidores.................................................................................... 18 
3.3- Concentração Espermática e Volume da Dose Inseminante................ 19 
3.4- Efeito do Garanhão no Sucesso do Resfriamento................................ 20 
3.5- Etapas na Refrigeração do Sêmen Equino........................................... 22 
4- Avaliação do Potencial Reprodutivo de Garanhões..................................... 25 
4.1- Etapas do Exame Andrológico.............................................................. 26 
4.2- Modelo de Laudo Andrológico............................................................... 36 
5- Princípios da Criopreservação e Técnicas de Congelamento do Sêmen de 
Garanhões........................................................................................................ 37 
5.1- Histórico da Técnica.............................................................................. 37 
5.2- Princípios da Criopreservação.............................................................. 38 
5.3- Meios Diluidores.................................................................................... 41 
5.4- Etapas do Congelamento...................................................................... 42 
5.5- Outras Aplicações do Congelamento de Sêmen................................... 46 
6. Referências Bibliográficas............................................................................ 50 
 
 
1 
 
1- INTRODUÇÀO: 
 
A eqüinocultura apresenta importância crescente no agronegócio 
brasileiro. Diferentemente da imagem aristocrata e distante da realidade da 
maior parte da população, a eqüinocultura envolve diferentes classes sociais e 
beneficia milhares de famílias. Em um recente estudo estimativo sobre a 
indústria do cavalo no Brasil, demonstrou-se que o rebanho efetivo é de cerca 
de 8,5 milhões de equinos e 1,2 milhões de muares e jumentos. Esse 
segmento agropecuário é responsável pela geração de 600 mil empregos 
diretos e 3,2 milhões de empregos indiretos (CNA, 2006). 
Para se maximizar a eficiência reprodutiva de um sistema de criação de 
eqüinos, faz-se necessário a obtenção de um potro por ano de todas as éguas 
do rebanho bem como a obtenção de um maior número possível de embriões 
no caso de éguas doadoras. Para isto são realizadas biotecnologias como a 
inseminação artificial (IA). 
Apesar de alguns historiadores mostrarem que a inseminação artificial já 
era utilizada desde 1332 em equinos por árabes, o marco inicial do uso da IA é 
de 1779, quando um monge italiano inseminou coletou o sêmen de um 
cachorro e inseminou uma cadela. 
Na espécie eqüina, a IA vem sendo empregada com sucesso devido a 
sua facilidade de implantação no plantel, proporcionando bons índices de 
fertilidade, menor desgaste do garanhão, e melhora do progresso genético. 
A IA trata-se de uma técnica utilizada para obter produtos de pais com 
alta qualidade genética, com a vantagem de não necessitar a presença física 
do garanhão selecionado, reduzindo traumas decorrentes do transporte dos 
animais ou até mesmo resultantes da monta natural. Além disso, com esta 
biotecnologia, há redução de transmissão de doenças venéreas e infecciosas 
como a endometrite, decorrentes do contato direto entre égua e garanhão, 
aumentando o numero de éguas inseminadas por ejaculado, e da taxa de 
prenhez proporcionando melhora na viabilidade econômica. 
Os avanços obtidos em reprodução eqüina proporciona melhora gradual 
nos processos envolvendo a IA, tais como a ultrassonografia para controle da 
ovulação e biotécnicas de avaliação, diluição e criopreservação do sêmem, 
 
2 
 
colaboram para a predição da fertilidade dos animais envolvidos no processo e 
maximiza os resultados. 
A espécie eqüina possui os índices mais baixos de fertilidade quando 
comparada com as demais espécies domésticas. Possivelmente o principal 
fator envolvido é a falta de seleção genética para fertilidade. Outros fatores 
seriam a falta de acompanhamento profissional e o uso de animais idosos 
(ciclo produtivo longo da equideocultura). Dentre os fatores que podem alterar 
os índices reprodutivos, a qualidade seminal assume um efeito considerável. 
As características do sêmen equino podem variar de acordo com 
diversos fatores, entre eles: 
- grau de estimulação sexual 
- freqüência de ejaculação 
- idade do garanhão 
- tamanho testicular- método da coleta do sêmen 
- estação do ano. 
A estação do ano influência as características físicas e bioquímicas do 
sêmen, os níveis de hormônios sanguíneos, o comportamento sexual e a 
fertilidade do garanhão e da égua. Nos meses de maior luminosidade, a 
produção de espermatozóides é maior e a libido é máxima. A concentração de 
testosterona plasmática também varia com estação do ano e pode ser 
responsável pelas alterações descritas. 
A fertilidade do garanhão está diretamente relacionada com a qualidade 
dos espermatozóides produzidos, das secreções que o envolvem e da correta 
deposição destes no trato genital feminino. Assim observamos que, em geral, a 
fertilidade depende de uma série de eventos, iniciando com a 
espermatogênese, seguindo para a espermiogênese e a maturação 
espermática. Depois, durante a ejaculação, diferentes secreções provenientes 
das glândulas acessórias promoverão mudanças importantes na composição 
da membrana espermática e nas proteínas de superfície. Na seqüência, os 
espermatozóides deverão ser capacitados, durante sua passagem pelo trato 
genital feminino, e sofrerem a reação do acrossoma até que um deles seja 
capaz de penetrar a zona pelúcida e finalmente se fundir com o oócito. Cada 
 
3 
 
um destes passos é mediado por um número de proteínas e, 
conseqüentemente, por genes. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
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2- MÉTODOS DE AVALIAÇÃO DO SÊMEN EQUINO 
 
 A qualidade seminal é um importante fator na determinação da 
fertilidade das mais diversas espécies. Por este motivo, ao longo dos anos, 
foram sendo desenvolvidos metodologias que buscam predizer o potencial fértil 
de um animal sem a necessidade de inseminar ou cobrir fêmeas. 
 De forma prática a avaliação seminal pode ser divida em duas partes: 
uma parte é realizada na rotina de haras e centrais (sêmen fresco, resfriado e 
congelado) antes da inseminação das éguas e outra parte de testes são 
aqueles que vêm sendo utilizados para detectar problemas reprodutivos em 
garanhões ou em pesquisas. 
 
2.1- Avaliação do sêmen de garanhões na rotina de haras 
 
Uma rotina de avaliação do sêmen pode evitar que falhas que venham a 
ocorrer durante a coleta e manipulação seminal venham a trazer prejuízos 
devido a queda de fertilidade, mesmo nos animais que apresentem uma boa 
qualidade do sêmen. Os cuidados com o sêmen antes da inseminação são 
indispensáveis para evitar quedas nas características seminais dos animais em 
avaliação. 
O conhecimento sobre os parâmetros de normalidade do sêmen de 
garanhões (aspecto, volume, concentração, motilidade, vigor, morfologia 
espermática) são de extrema importância, uma vez que pode haver variação 
entre animais. Com este conhecimento é possível estabelecer a melhor forma 
de manipular o sêmen em função dos possíveis problemas de cada animal 
(taxa de diluição, centrifugação, melhor meio diluidor, etc). 
 
 Após a coleta podem ser avaliados os seguintes parâmetros seminais: 
 
2.1.1- Aspecto: a avaliação é visual e representa principalmente a cor e a 
aparência. Depende fundamentalmente da concentração de espermatozóides e 
eventualmente da presença de sangue, pus, urina, células epiteliais, detritos, 
etc. A cor geralmente é esbranquiçada, branca, marfim ou amarela. As 
colorações avermelhadas, marrom e cinza escuro são indicativas de, 
 
5 
 
respectivamente, sangue vivo, sangue hemolisado e sujeira. A aparência 
poderá ser denominada de cremosa, leitosa, opalescente, serosa ou aquosa, 
correspondendo, aproximadamente, a uma determinada concentração 
espermática. A maior parte dos garanhões apresenta aspecto entre 
opalescente e seroso. Jumentos, de uma forma geral, possuem uma maior 
concentração espermática, apresentando, geralmente, um aspecto mais para 
leitoso. Animais pré púberes, em excessivo manejo de coletas/coberturas, ou, 
com problemas na produção/ejaculação de espermatozóides, geralmente 
apresentam um aspecto entre seroso e aquoso. 
 
2.1.2- Volume: é expresso em milímetros (mL). O valor pode ser influenciado 
por diversos fatores, como: método de coleta de sêmen, estação, estímulo do 
garanhão no momento da coleta, idade, condições patológicas, freqüência de 
coletas, tamanho testicular, dentre outros. Em média animais púberes 
produzem de 30-100 mL. Através do volume será possível calcular o número 
total de espermatozóides no ejaculado, para conhecimento do número de 
doses inseminantes. Alguns animais produzem certa quantidade de gel que 
dificulta a manipulação do sêmen. Este gel pode ser retido por filtros ou 
aspirado por seringas e deve ser descartado no momento do calculo das 
doses. 
 
2.1.3- Concentração: a concentração é geralmente determinada pelo número 
de espermatozóides (milhões) por mL. De uma forma geral, os mesmos fatores 
que influenciam a variação no volume irão influenciar a variação na 
concentração, que em média vai de 80-350 x 106 espermatozóides por mL em 
garanhões púberes normais. A determinação do número de espermatozóides 
por mL pode ser realizada basicamente por dois métodos. 
 
2.1.3.1- Contagem em câmara hematimétrica ou neubauer: 
Retira-se uma amostra de sêmen do ejaculado e dilui-se em água ou 
solução de formol salino. 
 
Ex: 20 l de sêmen em 1980 L de solução de formol salino (1: 100) 
 1 gota de sêmen em 19 gotas de água (1:20) 
 
6 
 
Em aumento de 400 x com auxílio de microscópio óptico identificam-se 
os quadrantes da câmara. A câmara é dividida em 25 quadrados maiores, cada 
quadrado maior (dividido por linha tripla) tem 16 quadrados pequenos. Devem 
ser contatadas apenas as cabeças dos espermatozóides. A contagem é feita 
fixando-se um L nas bordas dos quadrados maiores. Contam-se as cabeças 
que estiverem em cima da linha do L e as de dentro dos 16 quadrados 
menores. Devem ser contados ao menos 5 quadrados maiores. 
 
 
 
Figura 1: Imagens aumentadas da câmara de Neubauer e esquema a 
ser seguido na contagem das células. 
 
Cálculo da concentração: 
 
 das cabeças contadas nos 5 quadrados x 5 x 10 x diluição 
 
7 
 
EX: (20 + 18 + 28 + 22 + 33) x 5 x 10 x 20 = 121000 = 121 x 103 /mm3 
Para transformar a concentração para mL (cm3) x 1000 = 121 x 106 /mL 
Ou seja, cada mL de sêmen possui 121 x 106 espermatozóides. 
 
O método de determinação da concentração por câmara de Neubauer é 
bastante preciso e vem sendo o mais utilizado na rotina dos haras devido ao 
seu baixo custo. 
 
2.1.3.2- Contagem eletrônica da concentração: 
 
 Alguns aparelhos como espectofotômetros e densímetros avaliam a 
concentração de forma mais rápida e vêm sendo utilizados em centros de 
pesquisa e alguns haras. Como inconveniente tem-se o custo destes 
aparelhos. 
 
2.1.4- Motilidade e vigor espermático: dentre os testes, a avaliação da 
motilidade e do vigor são comumente usados por ser relativamente simples e 
barato. Embora possua uma correlação de baixa a média intensidade com a 
fertilidade, pois não avalia todos os atributos que os espermatozóides devem 
possuir para a fecundação, esta técnica continua sendo indicada para a 
avaliação da viabilidade espermática em razão da sua queda ser acompanhada 
pelo decréscimo do número de células com integridade estrutural. Esses dois 
critérios foram, por muito tempo, os únicos parâmetros empregados na 
avaliação da integridade dos espermatozóides. 
Para avaliação da motilidade pode-se dividir em motilidade total 
(espermatozóides se movimentando) e motilidade progressiva (células se 
movimentando em linha retaou movimentos ligeiramente circulares). 
O vigor espermático é um parâmetro avaliado em conjunto com a 
motilidade e é definido como a qualidade do movimento exibido pelos 
espermatozóides móveis (intensidade de batimento flagelar). Para tanto, faz-se 
uso de uma escala compreendida numa faixa de 0 a 5. 
A avaliação da motilidade e do vigor, são realizados colocando-se uma gota de 
semen entre lâmina e laminula pré-aquecida e observada em microscópio óptico 
com aumentos de 20 e 40X, onde são atribuídas notas percentuais subjetivas de 0 
 
8 
 
(zero) a 100% em relação a quantidade de espermatozóides moveis totais e 
móveis progressivos. O vigor também é observado de forma subjetiva, no entanto, 
empregando-se escala de 0 a 5. 
A natureza subjetiva é o grande problema das avaliações de motilidade e vigor 
por microscopia. A grande variação entre avaliadores ao analisarem uma mesma 
amostra pode comprometer os resultados na utilização de determinado sêmen. 
Nos últimos anos tem se buscado desenvolver uma maneira mais precisa para 
realizar esta avaliação. No entanto, o alto custo limita a utilização destes novos 
métodos por profissionais a campo. 
O Colégio Brasileiro de Reprodução Animal indica que o sêmen a fresco 
deve possuir padrões de motilidade na ordem de 70% e vigor 3 (0-5). 
 
2.1.5- Morfologia espermática: a morfologia dos espermatozóides é geralmente 
avaliada utilizando um microscópio em aumento de 1000 x sob óleo de 
imersão. A visualização em preparo de lâmina seca possui a vantagem de ser 
realizada em microscópico óptico, o sêmen é misturado a um corante (eosina-
negrosina) ou é realizado o esfregaço para posterior coloração (Giensa, 
panótico). A avaliação em preparo úmido é realizada em microscópio de 
contraste de fase, para tal, amostras do sêmen coletado são armazenadas em 
recipientes contendo solução tamponada de formol salino para posterior 
análise. Para a avaliação são contadas 200 células que têm suas alterações 
quantificadas e classificadas. O Colégio Brasileiro de Reprodução (1998) 
animal divide tais alterações em dois grandes grupos de acordo com o efeito na 
fertilidade: 
- defeitos maiores: patologias de cabeça (subdesenvolvida, isolada patológica, 
estreita na base, piriforme, pequeno anormal, contorno anormal, “pounch 
formation”), gota proximal, formas teratológicas, patologias de cauda 
(fortemente dobrada ou enrolada, dobrada com gota, enrolada na cabeça), 
formas duplas. 
- defeitos menores: patologias de cabeça (delgada, gigante, curta, larga, 
pequena normal, isolada normal), patologias de cauda e implantação (retro, 
obliquo, dobrada), gota citoplasmática distal. 
 O exame de morfologia espermática não deve nunca ser utilizado 
isoladamente para dizer se o potencial de fertilidade de um ejaculado é alto, 
 
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mas é razoável para dizer se o potencial de fertilidade de um cavalo é baixo 
devido a uma alta proporção de anormalidades espermáticas. 
 
2.2- Avaliações realizadas para animais problema ou em pesquisas com 
sêmen de garanhões 
 
 Em situações específicas, as avaliações realizadas na rotina não são 
suficientes para explicar os baixos resultados de baixa fertilidade. Nestas 
situações ou e centros de pesquisa tem se buscado desenvolver uma bateria 
de testes que sejam mais fidedignos em predizer a real causa da menor 
fertilidade de determinada partida de sêmen. Apesar da maior parte destes 
testes serem realizados apenas em laboratórios mais estruturados, alguns são 
de fácil execução e podem ser realizado na rotina do campo sem grande 
incremento de custos. 
 
2.2.1- Teste de coloração supravital: 
 As colorações supravitais também conhecidas como colorações de vivos 
e mortos, geralmente consistem da utilização de corantes derivados da 
fluoresceína em combinação ou não com outros corantes de fundo. A ação 
destes corantes depende da integridade das membranas, de forma a impedir 
ou não a penetração dos mesmos no compartimento nuclear do 
espermatozóide. Esta coloração avalia diretamente a integridade estrutural da 
membrana plasmática da cabeça do espermatozóide. 
A coloração supravital, geralmente é realizada com corante eosina-
nigrosina, sendo 10 µL de sêmen homogeneizados com 10 µL do corante a 
37ºC e depois realizado um esfregaço delgado em lâmina para leitura em 
microscópio óptico com objetiva de 40x. São consideradas normais as células 
que não se coram, e as que se coram de róseo após a exposição ao corante 
são consideradas lesadas. 
 
 
 
 
 
 
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Figura 2: Células coradas membrana lesada, 
células não coradas membrana íntegra (seta). 
 
2.2.2- Teste hiposmótico: 
 O teste hiposmótico (HOST) é um método utilizado para avaliar a 
integridade funcional da membrana da célula espermática em várias espécies: 
humana, caprina, canina, suína e eqüina. Este teste baseia-se na capacidade 
do espermatozóide em reagir quando exposto a soluções hiposmóticas. 
Nestas condições ocorre o influxo de água para o interior da célula, para que 
se estabeleça o equilíbrio osmótico entre os meios extra e intracelular, 
provocando o aumento de volume na célula e posterior dobramento da cauda. 
Para o teste uma alíquota de 10 µL sêmen é adicionada a um tubo 
plástico contendo 1 mL da solução hiposmótica (água destilada, solução de 
sacarose a 100 mOsmol/L) previamente aquecida a 37ºC. A mistura é incubada 
em banho-maria a 37ºC por uma hora, e fixada em solução de formol salino, 
para posterior avaliação entre lâmina e lamínula, por preparo úmido, em 
microscópio óptico com um aumento 1000x. São considerados estruturalmente 
normais àqueles espermatozóides que durante a incubação sofreram 
dobramento da cauda e os que não sofreram dobramento são considerados 
com membrana afuncional. 
 
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Para interpretação dos dados é importante realizar avaliação morfológica 
antes do teste pra subtrair o percentual de caudas dobradas referentes a 
alterações na morfologia espermática do animal em avaliação. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3: Células reativas ao teste hiposmótico. 
 
2.2.3- Teste de termo resistência (TTR): 
 O teste vem sendo utilizado rotineiramente para avaliar o sêmen bovino 
congelado. Este teste consiste na incubação de uma amostra de sêmen em 
banho-maria, em temperatura e tempo pré-determinados, de acordo com a 
espécie animal. O grande problema deste teste para eqüinos é a falta de 
padrões definido de tempo e temperatura que os espermatozóides devem 
resistir para que a partida de sêmen seja considerada satisfatória. Grande parte 
dos estudos tem utilizado a temperatura de 37ºC por até 240 minutos. A 
motilidade progressiva e o vigor espermático são as características seminais 
analisadas em intervalos de 30 minutos até que o sêmen possua motilidade 
progressiva mínima de 30% e vigor igual a 3. 
 
2.2.4- Teste por meio de sondas fluorescentes: 
 Todos os testes laboratoriais de análise de sêmen buscam a predição da 
capacidade fertilizante do sêmen. Dentre esses exames, a técnica que utiliza 
sondas fluorescentes vem ganhando importância por sua característica de 
marcar estruturas específicas das células e de detectar integridade estrutural 
ou funcionalidade de forma clara. 
 
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Várias sondas fluorescentes podem ser utilizadas para a avaliação da 
integridade da membrana plasmática espermática. O iodeto de propídio (PI) se 
destaca em pesquisas pela sua facilidade de preparação e aplicação da 
técnica, estabilidade e eficiência na avaliação da integridade da membrana, 
seja isoladamente ou associada a outro corante fluorescentepara avaliar a 
membrana plasmática. Esta sonda possui afinidade ao DNA e cora em 
vermelho o núcleo de células com membrana plasmática lesada. 
Já a aglutinina de Pisum sativum (PSA), quando conjugada a 
isotiocionato de fluoresceína (FITC), marca com sucesso o acrossomo 
espermático na cor verde amarelado, o que facilita a visualização e a 
identificação dos acrossomos lesados. 
Quanto à peça intermediária do espermatozóide, existem sondas 
fluorescentes próprias para avaliação da funcionalidade mitocondrial, dentre os 
quais destaca-se a carbocianina catiônica lipofílica, JC-1 (iodeto de 5,5`,6,6`-
tetracloro1,1`,3,3`-tetraetilbenzimidazolocarbocianina). Este corante necessita 
de um potencial de membrana mitocondrial altamente negativo para penetrar 
na organela e emitir fluorescência nos comprimentos de onda de luz vermelha 
ou verde, de acordo com sua concentração interna final. Em altas 
concentrações, o corante apresenta-se na forma de j-agregado e emite 
coloração vermelha, enquanto que em baixas concentrações encontra-se na 
forma de monômero e emite coloração verde. Então, em mitocôndrias 
funcionais, que apresentam potencial de membrana mitocondrial altamente 
negativo (-180 mV), o JC-1 penetra e acumula-se no interior desta organela e 
emite coloração vermelha. 
Embora o uso de sondas fluorescentes por microscopia de 
epifluorescência seja um método eficaz para a avaliação espermática, o 
número de espermatozóides avaliados normalmente não excede 200. Desta 
forma, a citometria de fluxo surge como uma técnica vantajosa em relação às 
formas clássicas para avaliação da célula espermática, uma vez que este 
sistema automatizado tem a capacidade de examinar 10.000 espermatozóides 
em menos de um minuto, permitindo maior exatidão nos resultados. 
 
 
 
 
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2.2.5- Avaliação computadorizada da motilidade espermática (CASA): 
Para eliminar o problema da subjetividade da avaliação convencional da 
motilidade e vigor, e se obter uma técnica que demonstre maior repetibilidade, 
foi desenvolvido o sistema computadorizado de análise espermática (CASA). 
Nesta avaliação, a trajetória da cabeça de espermatozóides presentes na 
amostra é reconstituída. A CASA proporciona a oportunidade de acessar 
múltiplas características em uma única amostra de espermatozóides. 
Além da motilidade espermática total (MT) e progressiva (MP) três 
valores para velocidade são comumente medidos pela CASA e usados para a 
descrição do movimento espermático: a velocidade curvilínea (VCL), a 
velocidade em linha reta ou progressiva (VSL) e a velocidade média do trajeto 
(VAP). Cada uma dessas velocidades descreve um aspecto diferente da 
trajetória do espermatozóide. O trajeto curvilíneo é uma projeção bidimensional 
da verdadeira trajetória tridimensional. A VCL é calculada pela somatória das 
distâncias ao longo da trajetória curvilínea percorrida, corrigindo o tempo gasto. 
O valor de VSL é determinado encontrando-se a distância em linha reta entre 
os primeiros e os últimos pontos da trajetória em relação ao tempo. Este valor 
fornece o espaço ganho dentro de um período. O valor de VAP fornece uma 
indicação do comprimento da trajetória geral do espermatozóide e é calculado 
encontrando-se o comprimento do caminho médio em relação ao tempo gasto. 
A amplitude do deslocamento lateral da cabeça (ALH) é utilizada como uma 
aproximação da amplitude do batimento flagelar. A freqüência do batimento 
flagelar (BCF) foi desenvolvida baseada nos fatos de que cada ponto no vértice 
é resultado da mudança no batimento, e cada momento em que o caminho 
curvilíneo cruza o caminho médio é o resultado de um novo batimento flagelar. 
Os valores de retilinearidade (STR), uma comparação da linha reta com a 
média das trajetórias, fornecem uma indicação da relação entre o espaço 
ganho e a trajetória geral do espermatozóide, calculados como VSL x VAP-1 x 
100. Uma trajetória com pontos espaçados de forma uniforme e com baixa 
amplitude, teria um valor alto de STR, uma vez que o caminho médio seria 
próximo do caminho em linha reta. Uma trilha circular teria um baixo STR. A 
linearidade (LIN), uma comparação da linha reta e as trajetórias curvilíneas, é 
uma expressão da relação entre a projeção bi-dimensional do caminho tri-
dimensional adotado pelo espermatozóide e seu ganho de espaço, calculado 
 
14 
 
como VSL x VCL-1 x 100. Uma trajetória circular teria uma baixa LIN, pois o 
caminho curvilíneo seria muito maior do que o espaço ganho. Uma alta LIN na 
trajetória é aquela em que o espermatozóide percorre um caminho curvilíneo 
com uma amplitude relativamente baixa do ALH e a direção geral do 
movimento é a mesma do caminho em linha reta. 
 
 
Figura 4: Caminhos utilizados no cálculo da velocidade da 
cabeça dos espermatozóides. O comprimento de cada caminho 
em questão é corrigido (distância/tempo) para dar a velocidade. 
Por exemplo, a distâcia percorrida ao longo do trajeto 
curvelinear dividido pelo tempo é a velocidade curvelinear 
(VCL), etc. (MORTIMER, 1997). 
 
2.3- Considerações finais: 
 
 Os exames de rotina da qualidade seminal, quando realizados de forma 
correta, oferecem bons indícios sobre o potencial reprodutivo de garanhões. No 
entanto, em alguns casos testes laboratoriais podem ser utilizados para 
fornecer uma resposta mais precisa sobre possíveis alterações. 
Apesar do desenvolvimento de uma série de testes que possibilitam 
avaliar isoladamente diferentes compartimentos dos espermatozóides, ainda 
não existe um teste que possa afirmar pontualmente sobre a fertilidade de 
determinada amostra seminal. Por este motivo, tem-se usado um conjunto de 
analises para buscar uma resposta mais precisa possível sobre a fertilidade 
dos animais. 
 
 
15 
 
3- RESFRIAMENTO DE SÊMEN EQUINO 
 
 O uso da inseminação artificial possibilitou aumentar de forma 
satisfatória o número de éguas prenhes ao final da estação de monta por 
garanhão. No entanto, com o desenvolver da técnica novos problemas foram 
surgindo, como a necessidade de manter o sêmen viável por um período maior, 
para realizar inseminações em diferentes propriedades sem a necessidade do 
transporte de garanhões. Baseado neste problema no começo do século XIX 
iniciaram-se os estudos sobre resfriamento de sêmen para transporte, o qual 
hoje, vem sendo utilizado nas mais diversas espécies. 
 O sêmen resfriado tem feito parte da rotina dos profissionais que 
trabalham com reprodução de eqüinos ao longo das ultimas décadas. Este 
cenário de ampla utilização do sêmen resfriado é bastante diferente quanto 
comparado, por exemplo, com a espécie bovina. Tal fato se deve aos 
resultados obtidos com o sêmen eqüino congelado. A variação de resposta 
entre garanhões ao congelamento, o baixo rendimento de doses por ejaculado, 
o intenso manejo das éguas durante as inseminações, além da grande 
variação nas taxas de prenhez em relação às obtidas por monta natural, uso do 
sêmen fresco ou resfriado, têm limitado maior difusão do congelamento de 
sêmen em equinos. 
 Para aumentar a duração da viabilidade dos espermatozóides, o 
resfriamento visa reduzir a taxa metabólica destas células, com isso, tem-se 
uma redução no consumo do substrato disponível e uma redução nos produtos 
do metabolismo espermático, muitas vezes tóxicos para célula. A temperatura 
corporal o metabolismo espermático é máximo, e continua alto na temperatura 
ambiente. Porém, com a queda de temperatura há uma redução neste 
metabolismo, sendo que a cada 10ºC de queda, o metabolismo reduz em cerca 
de 50%. Quando os espermatozóides são mantidos a 5ºC, apenas 10% de seu 
metabolismo são necessários para sua sobrevivência quandocomparado à 
preservação a 38ºC. 
 As principais vantagens da utilização do sêmen resfriado são: redução 
dos gastos com transporte de garanhões e éguas, prevenção de doenças 
transmissíveis pelo coito, movimenta o mercado de venda de sêmen, permite 
direcionar melhor o acasalamento através da utilização de garanhões 
 
16 
 
geneticamente superiores. Como desvantagens têm-se: custos com serviço 
veterinário (coleta e processamento do sêmen, acompanhamento da fêmea, 
hormônio para sincronizar ovulações); custos com materiais (meios diluidores, 
contêineres de resfriamento); variação de resposta ao resfriamento entre 
garanhões. 
 Diversos fatores irão influenciar o sucesso no resfriamento do sêmen 
eqüino, dentre eles estão: tipos de contêiner utilizados para refrigeração e 
transporte, o meio diluidor utilizado no resfriamento, a concentração 
espermática e o volume da dose inseminante, e o efeito do garanhão. 
 
3.1- Tipos de contêiner para refrigeração e transporte do sêmen eqüino: 
 
Sob o aspecto de equipamentos, existem sistemas passivos e ativos de 
resfriamento de sêmen. Os sistemas passivos possuem a vantagem de serem 
mais baratos, embora apresentem a desvantagem de proporcionarem taxas de 
resfriamento dependentes de fatores, como: temperatura ambiente, 
temperatura inicial da amostra, temperatura do produto refrigerante e massa da 
amostra, produzindo taxas de resfriamento exponenciais e negativas. Já os 
sistemas ativos são caros, mas permitem taxas de resfriamento pré-
determinadas pelo técnico, possibilitando combinar mais de uma taxa durante o 
processo. Proporcionam, ainda, taxas de resfriamento lineares. Diante disso, 
sistemas ativos de resfriamento, apesar de muito eficientes, são de pouca 
utilidade prática em condições de campo. 
Ao se resfriar o sêmen de 37°C a 5°C, a taxa de refrigeração deve ser 
controlada, principalmente entre 19°C e 8°C, intervalo este em que o 
espermatozóide esta mais susceptível ao choque térmico. Parece haver 
consenso entre os pesquisadores sobre a necessidade de se utilizarem taxas 
de refrigeração lentas, não superiores a -0,05°C/min, nesta faixa de 
temperatura, pois esta é a fase crítica de ocorrência das lesões nas 
membranas espermáticas. 
Alguns fatores devem ser levados em conta na escolha do contêiner 
para transporte de sêmen: capacidade de isolamento térmico do meio exterior, 
taxa de resfriamento adequada, manutenção da temperatura final pelo maior 
 
17 
 
tempo possível, proteção do sêmen, estrutura forte, serem simples, leves e 
baratos. 
Desde a introdução do primeiro contêiner (Equitainer) no mercado, 
vários outros vêm sendo desenvolvidos. Dentre eles: Max Sêmen Express®, 
Equitainer I®, Equitainer II®, Clipper®, Botutainer®, Botubox®, etc. Estes 
contêineres são produzidos visando atender ao máximo as características de 
resfriamento adequadas para espermatozóides eqüinos. São sistemas 
passivos de resfriamento com diferentes taxas de refrigeração e temperatura 
final de armazenamento. 
Na rotina de campo alguns veterinários têm realizado transporte em 
sistemas improvisados com caixa de isopor e alguma fonte de gelo. O grande 
problema com o uso dos containeres improvisados está na grande variação de 
resultados. Estes containeres não possuírem uma taxa de resfriamento 
padronizada e a falta controle na temperatura final de armazenamento, além 
disso, de uma forma geral são mais susceptíveis a variações na temperatura 
do ambiente externo. 
Para melhor informar os consumidores é importante que as empresas 
produtoras dos contêineres disponibilizem especificações técnicas como a taxa 
de refrigeração, temperatura final e o tempo máximo de estocagem. Através 
destas informações é possível adequar cada contêiner às diferentes durações 
de transporte, bem como avaliar o custo benefício de cada fabricante. 
 
 
Figura 1: Equitainer I 
®
 (manutenção da temperatura a 5ºC por 70 horas) e 
Equitainer II 
®
 (manutenção da temperatura a 5ºC por 48 horas). 
 
18 
 
 
Figura 2: Max sêmen Express
®
, 
container para manutenção do sêmen 
a 15ºC. 
 
 
Figura 3: Botubox
®
 (manutenção do sêmen a 15ºC) e 
Botutainer
®
 (manutenção do sêmen a 5ºC) 
 
3.2- Meios diluidores: 
 
 Os diluidores de sêmen são soluções destinadas a proteger os 
espermatozóides e prolongar sua sobrevivência durante a refrigeração e o 
transporte, além de apresentarem a vantagem de aumentar o volume da dose 
inseminante e auxiliarem na avaliação do sêmen. Em geral, o plasma seminal 
não é um bom extensor para os espermatozóides, justificando o efeito benéfico 
dos diluidores inclusive para inseminações com sêmen fresco. 
 A maior parte dos diluidores comerciais disponíveis no Brasil para 
refrigeração de sêmen eqüino são produzidos a base de leite em pó e podem 
conter: açúcares (substrato energético), antibióticos (prevenir crescimento 
 
19 
 
microbiana durante armazenamento), eletrólitos e tampões (controle da 
osmolaridade e pH). 
 Existem uma série de diluidores a base de gema de ovo que vem sendo 
testados para resfriamento de sêmen equino. No entanto, a variabilidade dos 
resultados na utilização destes diluidores, associado aos excelentes resultados 
obtidos com os meios a base de leite em pó disponíveis no Brasil, têm limitado 
a utilização destes diluidores a base de gema em nosso país. 
 Para melhores resultados na adição do meio diluidor é importante que 
este esteja a uma temperatura próxima a do sêmen e seja adicionado de forma 
lenta. 
 
 
 
Figura 4: Meios diluidores para transporte de sêmen eqüino. 
 
3.3- Concentração espermática e o volume da dose inseminante: 
 
 Conhecer a concentração do sêmen a ser enviado e calcular o volume 
correto pode evitar insucessos na inseminação de éguas, devido ao uso de 
baixas doses, e maximizar o número de éguas inseminadas por evitar o envio 
de uma dose maior que a necessária. 
 Muito se discute sobre a proporção correta entre diluidor e sêmen que 
antecede o resfriamento. Para inseminações realizadas com sêmen fresco tem-
se trabalhado principalmente com a proporção de 1:1 (sêmen : diluidor). No 
caso do sêmen resfriado a diluição de 1:2, 1:3 ou superior têm sido mais 
recomendada. Maior atenção que na proporção sêmen diluidor deve ser dada a 
 
20 
 
concentração espermática do sêmen a ser resfriado. O ideal é que esta 
concentração esteja entre de 25-30 x 106 espermatozóides por mL, podendo 
variar de 25 a 100 x 106 sptz./mL. 
 O volume da dose inseminante vai variar de forma a atender uma dose 
mínima de 500 x 106 espermatozóides viáveis no momento da inseminação. 
Tem-se recomendado para o sêmen resfriado volumes que variam de 30 a 60 
mL. Ao enviar o sêmen é importante levar em consideração a perda de 
viabilidade que ocorrerá durante o transporte, devendo sempre enviar um 
número maior de espermatozóides viáveis que o necessário para inseminação. 
 
 3.4- Efeito do garanhão no sucesso do resfriamento: 
 
 Antes do envio de sêmen de garanhões é de extrema importância o 
conhecimento das características seminais e da resistência aos diferentes 
sistemas de resfriamento do animal a ser trabalhado. 
 Darenius (1998) sugere que os garanhões a serem utilizados nos 
programas de IA com sêmen refrigerado devam possuir: órgãos genitais 
internos e externos sem alterações, produção semanal de espermatozóides em 
torno de 30-35 x 109, 70% de células morfologicamente normais, motilidade 
superior a 50% e, após 12 horas de refrigeração, uma redução da motilidade 
inicial não superior a 30%, considerando como motilidade mínima ao final 
desse período de 40%. 
 A qualidadee composição do sêmen podem influenciar de forma direta 
os resultados de fertilidade obtidos. Devido a variação de resposta ao 
resfriamento existente entre garanhões, recomenda-se a realização de testes 
com diferentes meios diluidores e containeres de resfriamento. Desta forma é 
possível definir se determinado animal deve ou não ser utilizado em programas 
de IA com sêmen resfriado, assim como a forma mais adequada de fazer esta 
utilização. 
 
 
 
 
 
21 
 
3.4.1- Ferramentas para melhorar os resultados no resfriamento de sêmen 
eqüino 
 
Coleta de sêmen: atenção à contaminação do sêmen é imprescindível. 
Higienização do pênis durante a estação e cuidados higiênicos com o material 
que vai entrar em contato com o sêmen são de extrema importância. Além 
disso, a coleta pode ser otimizada obtendo ejaculados com menor volume e 
maior concentração. Para isso, a coleta dever ser realizada com mínimo 
estímulo sexual possível do garanhão, realizando com apenas uma monta na 
égua. 
 
Diluidor de sêmen: em animais com baixa motilidade espermática podem ser 
testados diluidores alternativos. No Brasil existem diluidores como Max Sêmen 
Plus® e Botu-Turbo® que possuem constituintes que visam incrementar a 
motilidade dos espermatozóides refrigerados a 5ºC. 
 
Centrifugação: é uma boa alternativa para alguns animais que não respondem 
bem ao processo de refrigeração, apesar de não afetar aqueles animais que 
resfriam bem o sêmen. A centrifugação pode ser realizada a 600 x g por 10 
minutos após a diluição de sêmen com diluidor a base de leite na proporção de 
1:1 (sêmen : diluidor). Como inconveniente tem-se que cerca de 25% das 
células são perdidas no sobrenadante. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
22 
 
3.5- Etapas na refrigeração e utilização do sêmen eqüino resfriado: 
 
 
Preparo do material para resfriamento 
(meio diluidor, placa aquecedora, lâminas, 
lamínulas, verificar fonte de gelo, etc). 
 
 
Coleta de sêmen. 
 
 
Avaliação do sêmen (aspecto, motilidade, 
vigor, volume, concentração). 
 
 
23 
 
 
Cálculo do número de doses. 
Diluição final (25 x 10
6
 stpz/mL). 
 
 
Envase no recipiente. 
 
 
Preparo do container (identificação: 
garanhão, número de doses, horário da 
coleta, motilidade e vigor, volume, 
destinatário, etc). 
 
 
24 
 
 
Envio do sêmen. 
 
 
 
Recebimento, avaliação e inseminação 
artificial. 
 
Apesar dos grandes benefícios do uso do sêmen resfriado, esta técnica 
apresenta como limitação para preservação de material genético o tempo que o 
sêmen permanece viável. Grande parte dos garanhões apresentam queda na 
fertilidade após armazenamento por um período superior a 24 horas, podendo 
o sêmen de alguns animais não resistir inclusive à um tempo inferior. É 
importante enfatizar que a motilidade nem sempre é um bom indicador da 
fertilidade no sêmen refrigerado e que as inseminações devem ser realizadas 
em um período de tempo máximo de 24 horas antes da ovulação. 
 
 
 
 
 
25 
 
4- AVALIAÇÃO DO POTÊNCIAL REPRODUTIVO DE GARANHÕES 
 
Qual a forma ideal de determinar o potencial reprodutivo de um 
garanhão? Sem dúvidas, a forma mais confiável é através de sua taxa 
individual de prenhês em estações de monta utilizando-se éguas férteis e sobre 
manejo reprodutivo adequado. Nenhum parâmetro seminal individual ou 
característica física do garanhão é tão altamente correlacionado com seu 
potencial fértil. No entanto, muitas vezes veterinários são chamados para 
fornecer avaliações pontuais de animais com histórico de coberturas 
desconhecidos, ou, com histórico de queda em seus índices reprodutivos. 
Um ponto importante, no caso dos eqüinos, é a definição da “taxa de 
fertilidade”, que pode variar, dependendo do projeto de uso do cavalo. Por 
exemplo, determinado garanhão pode ser fértil o bastante para emprenhar uma 
ou poucas éguas por ano. No entanto, o mesmo animal pode ser ineficiente 
quando o número de éguas aumenta para 40 ou 100 éguas por ano. Tal fato 
diferencia o garanhão das espécies de produção onde animais de baixa 
fertilidade são descartados. Um garanhão com baixo potencial reprodutivo em 
muitas situações pode ser utilizado em programas de reprodução em função do 
interesse do proprietário. 
Para atender a necessidade de testar a fertilidade de garanhões uma 
entidade de pesquisa americana (The Society for Theriogenology) desenvolveu 
e publicou um protocolo a ser seguido. Este protocolo é chamado de Stallion 
Breeding Soundness Evaluation (BSE). Apesar de alguns testes serem 
adicionados, o corpo do BSE continua o mesmo, sem alterações oficiais desde 
sua introdução em 1983. Outra fonte de informação é fornecida pelo Colégio 
Brasileiro de Reprodução Animal e está contida no Manual para Exame 
Andrológico e Avaliação de Sêmen Animal. 
Analisando o panorama atual, o mercado equestre aumentou em muito a 
cota de éguas para alguns cavalos. Os transportes de sêmen resfriado e 
congelado tornaram-se comuns. Em parte, devido estas mudanças, novos 
pensamentos têm emergido de como usar, interpretar e ampliar a rotina de 
avaliar garanhões. 
 Algumas das situações onde o veterinário pode ser convocado para 
avaliar o potencial de determinados garanhões são: antes da compra de 
 
26 
 
animais; antes da estação de monta; para estimar o número de coberturas ou 
inseminações que podem ser realizadas durante a estação; qualquer momento 
onde haja suspeita de redução na fertilidade; quando proprietários querem 
aumentar o número de éguas para determinados cavalos na estação de monta; 
quando comportamentos sexuais anormais são observados; quando se 
suspeita que determinado garanhão carreie determinado patógeno. 
Ao contrário de outras espécies domésticas, a reprodução não vem 
sendo utilizada pra selecionar cavalos; reprodutores são selecionados de 
acordo com seu pedigree, desempenho atlético, características fenotípicas, etc. 
Portanto, conhecimentos sobre as individualidades desta espécie e dos 
critérios utilizados para avaliar seu potencial reprodutivo são de extrema 
importância para veterinários que se interessam pelo mercado reprodutivo 
eqüestre. 
 
AVALIANDO O POTENCIAL REPRODUTIVO DE GARANHÕES: 
 
 Para avaliar de forma satisfatória a capacidade reprodutiva de 
determinado animal é imprescindível atenção não apenas a qualidade seminal, 
ou, aos órgãos do sistema reprodutivo, mas a condição geral do animal, com 
possíveis alterações ao longo dos últimos tempos. 
 
4.1- Etapas do exame andrológico: 
 
 Identificação do animal: 
 
Descrições da propriedade, do proprietário e do animal são de fundamental 
importância para futuras avaliações e comercialização destes animais. 
 
 Obtenção de um histórico geral e reprodutivo: 
 
O histórico dos cavalos é parte indispensável do exame. Esta informação 
envolve possíveis alterações no ambiente e na rotina do animal, o desempenho 
reprodutivo em estações anteriores, regime de atividade sexual (monta/ doador 
de sêmen), resultados de exames de fertilidade realizados, condição de manejo 
 
27 
 
e alimentação, tempo de aparecimento de alterações, tratamentos executados 
e resposta clínica, data da aquisição, procedência do reprodutor e situação 
sanitária e reprodutiva do rebanho. 
 
 Realização de um exame físico: 
 
Conhecimentos sobre anatomia e fisiologia do animal são fundamentais 
para um adequado exame físico e do trato reprodutivo. Primeiro, a condição 
corpórea geral do animal deve ser avaliada. Caso o animal esteja em 
condições ruins pode ser indicativode falhas no manejo nutricional, doença 
debilitante, dentre outros. Nestes casos e em outros (mudanças na rotina nos 
últimos tempos, tratamento com antiinflamatórios corticóides, etc) onde a 
qualidade seminal possa ser afetada, caso os parâmetros seminais estejam 
abaixo de desejado, é necessário corrigir falhas e realizar novos exames com 
intervalo mínimo de 64-66 dias. Tal intervalo é importante para que esteja 
disponível um novo ciclo de células do epitélio seminífero no ejaculado, sem a 
influência das possíveis alterações. 
A conformação do animal é avaliada e qualquer alteração deve ser anotada. 
Defeitos genéticos devem ser incluídos como criptoquirdismo, hipoplasia, 
hérnia umbilical, alterações de aprumo (principalmente nos membros pélvicos), 
síndrome de Wobbler, dentre outros. Importância fundamental deve ser dada à 
capacidade e habilidade do cavalo em realizar a monta em éguas. Alterações 
musculares ou lesões nos membros posteriores (laminite, artrite degenerativa) 
e na coluna podem ser observadas e devem ser levadas em consideração no 
momento da realização do laudo. 
- Genitália externa: o método mais usado para avaliar de perto o pênis é 
através do estimulo do garanhão com uma égua em cio. Tal procedimento 
permite também avaliar a libido do animal e a capacidade de ereção. A 
extração manual do pênis do prepúcio para exame é difícil e geralmente leva a 
uma resistência do animal. Tranqüilizantes levam ao prolapso peniano, 
tornando o pênis acessível. O problema da utilização de tranqüilizantes é que 
estes levam a ataxia, logo, a coleta deve ser realizada antes ou deve-se 
esperar o fim do efeito do medicamento. 
 
28 
 
O pênis deve ser lavado antes da inspeção, pois debris epiteliais 
associados a secreções das glândulas prepúciais podem atrapalhar a 
visualização de lesões durante o exame. O pênis deve ser examinado 
minuciosamente e toda lesão deve ser registrada. As lesões mais comuns no 
pênis incluem: lesões traumáticas, vesículas e pústulas do exantema coital 
eqüino, granulomas de habronema, carcinoma de células escamosas e 
papilomas. 
Durante a ereção peniana, o prepúcio também deve ser avaliado. A pele do 
prepúcio deve estar fina e flexível, sem evidência de processos inflamatórios e 
lesões proliferativas. 
Outra região a ser avaliada é o escroto. O escroto do garanhão deve ser 
fino e elástico, normalmente penduloso (exceto durante o frio, quando ocorre 
contração da túnica dartos), mas pode retrair durante a avaliação devido à 
contração do músculo cremáster. Toda lesão (bernes, traumas) deverá ser 
anotada. Tanto a cabeça quanto a cauda do epidídimo devem ser palpados em 
suas respectivas posições. Tamanho, consistência, textura e posição dos 
testículos devem ser avaliados durante o exame. A largura total do escroto 
(FIGURA 1) de um animal sexualmente maduro, geralmente, varia de 9 – 13 
cm, possuindo alta correlação com a produção diária de espermatozóides. O 
limite inferior para largura do escroto é de 7 cm em animais adultos (CBRA, 
1998). 
 
 
FIGURA 1: Mensuração do diâmetro escrotal com 
paquímetro. Os testículos são gentilmente tracionados 
para o fundo do escroto; a mensuração deve incluir o 
maior diâmetro entre os dois testículos. (In 
BLANCHARD, 2003). 
 
29 
 
Outra ferramenta na avaliação da genitália externa é o exame 
ultrassonográfico. Este exame permite avaliar possíveis massas testiculares, 
fluidos acumulados no escroto ou cordão espermático, varicocele, 
espessamento da túnica vaginal, cistos, vesiculite, tumor testicular e adenoma 
do epidídimo. 
- Genitália interna: os órgãos internos podem ser avaliados por palpação 
pelo reto. Boa contenção é fundamental para segurança do cavalo e do 
examinador. Em alguns casos o cavalo pode ser sedado. A mão do operador 
deve ser bem lubrificada. Os dois anéis inguinais podem ser palpados como 
duas aberturas ventro-laterais a borda da pelve (FIGURA 2). O ducto deferente 
e o pulso da artéria testicular, geralmente, podem ser sentidos nesta abertura. 
O diâmetro do anel normalmente varia de 2-3 cm. Uma abertura maior pode 
predispor o animal à hérnia inguinal e a hidrocele escrotal. Algumas glândulas 
acessórias (ex.: vesiculares, próstata) podem ser avaliadas apesar de lesões 
nas glândulas acessórias serem raras em cavalos. 
 
 
 
FIGURA 2: Palpação do anel inguinal esquerdo 
pelo reto. O reto foi removido para facilitar a 
visualização (In BLANCHARD, 2003). 
 
 Avaliação do comportamento sexual e libido: 
 
Excelente qualidade seminal pode não ter grande importância se o cavalo 
não possuir potencial para depositar o sêmen no trato reprodutivo da égua, ou, 
em vagina artificial. O comportamento sexual do cavalo pode ser avaliado 
 
30 
 
através do contato do cavalo com uma égua em cio. Geralmente, o garanhão 
com boa libido demonstra imediatamente interesse pela égua, manifestado por 
vocalização, farejar, morder, tentar montar, realização do reflexo de Flehmen e 
a ereção do pênis. O inicio, intensidade e duração desta fase de excitação são 
afetadas por características genéticas dos animais, experiências anteriores 
(positivas ou negativas), variação sazonal e por doenças. Causas comuns de 
redução na libido são: animais jovens, manejo incorreto (utilização do animal 
acima de seu limite) e punições constantes quando o animal expressa 
interesse sexual. 
 No caso de jumentos tal comportamento pode ser mais discreto, nestes 
animais o tempo necessário para realizar ereção pode ultrapassar duas horas, 
sendo muitas vezes necessária maior paciência na realização do exame. 
 Para avaliar a libido é importante fornecer um ambiente limpo, 
confortável, sem perturbações e com piso em condições adequadas. 
 A índole é o temperamento do animal na presença de outros animais da 
mesma espécie e seu relacionamento com o homem. Por ser classificado como 
linfático, dócil e violento. 
 
 Coleta de sêmen: 
 
Recomenda-se a realização de duas com intervalo de uma hora. No caso 
dos resultados entre as duas primeiras coletas ser divergente, novas coletas 
podem ser realizadas. Para uma avaliação acurada da qualidade do sêmen a 
coleta é uma etapa bastante importante. Cuidados com higiene e preparo 
adequado do material para avaliação do sêmen são imprescindíveis. 
 
 Análise do ejaculado: 
 
- Aspecto: a avaliação é visual e representa principalmente a cor e a 
aparência. Depende fundamentalmente da concentração de espermatozóides e 
eventualmente da presença de sangue, pus, urina, células epiteliais, detritos, 
etc. A cor geralmente é esbranquiçada, branca, marfim ou amarela. As 
colorações avermelhadas, marrom e cinza escuro são indicativas de, 
respectivamente, sangue vivo, sangue hemolisado e sujeira. A aparência 
 
31 
 
poderá ser denominada de cremosa, leitosa, opalescente, serosa ou aquosa 
(FIGURA 3). 
 
FIGURA 3: Aspectos de sêmen, 
respectivamente: opalescente, 
amarronzado, leitoso e cremoso. 
(Imagem cedida por Leonardo 
Franco Martins). 
 
- Volume: o volume total do ejaculado livre do gel deve ser anotado. Tal 
medida varia enormemente, entre 30 mL a 250 mL, dependendo de alguns 
fatores como: idade, freqüência de coletas, excitação do animal, da estação do 
ano, tamanho testicular, dentre outros. Em média, para animais púberes 
mantidos em ritmo de coleta adequado, este volume varia de 30-100 mL sem a 
fração gelatinosa, que pode chegar a 40 mL no ejaculado. 
 
- Motilidade e vigor espermático: a avaliação, da motilidade espermática 
é, freqüentemente, realizada por meio visual. Este método permite obter uma 
estimativa do percentual de espermatozóides commotilidade total e retilínea, e 
vigor dos movimentos. Na determinação do vigor estima-se a intensidade dos 
movimentos, ou seja, a velocidade, que varia de 1, sem movimentos, até 5, 
com movimento muito intenso (Ex. 75/70; 3; motilidade total 75%, motilidade 
retilínea 70% e vigor 3). As avaliações da motilidade e vigor por meio visual são 
consideradas subjetivas, mas são válidas quando realizadas por técnicos bem 
treinados. 
 
32 
 
 
- Concentração: representa o número de espermatozóides por mL. 
Determinar a concentração é de extrema importância para avaliar o número 
total de espermatozóides no ejaculado de um garanhão. Tal avaliação pode ser 
feita com auxílio da câmara Neubauer e microscópico óptico (diluição do 
sêmen 1:20) ou por aparelhos mais sofisticados como espectrofotômetros ou 
densímetros digitais. Assim como o volume, a concentração do sêmen é 
bastante variável nos cavalos (30-800 milhões de espermatozóides por mL). 
 
- pH: a avaliação do pH deve ser realizada preferencialmente até uma hora 
após a coleta. Mensurações obtidas na fita de pH de papel são menos 
precisas, mas podem ser utilizadas. O pH normal do sêmen varia de 7,0-7,8. 
Valores alterados de pH podem ser associados a contaminações do ejaculado 
por urina\sabão, ou, com um processo inflamatório do trato genital interno. 
 
- Morfologia espermática: os limites no parâmetro seminal indicados pelo 
Colégio Brasileiro de Reprodução Animal (1998) para garanhões são: para 
monta natural (motilidade progressiva 70%, vigor 3, total de espermatozóides 
anormais 30%), doadores de sêmen (sêmen congelado: motilidade progressiva 
30%, vigor 3, defeitos maiores 20% e totais 40%). Para o sêmen resfriado são 
exigidos os mesmos parâmetros que para o sêmen congelado, onde o tempo 
limite de resfriamento é aquele presente no laudo andrológico. 
No sistema de classificação americano (BSE) para serem considerados 
satisfatórios em um exame andrológico, os garanhões devem possuir um 
mínimo de dois bilhões de espermatozóides normais, com motilidade 
progressiva, não sendo indicados limites de alterações morfológicas. Para tal 
avaliação do número total de espermatozóides com motilidade progressiva e 
normais no ejaculado, basta multiplicar: volume x concentração x motilidade 
progressiva x espermatozóides normais. 
 
 Coleta de amostras de sangue para teste de Anemia infecciosa eqüina: 
 
A AIE é uma doença extremamente importante em todo Brasil devido 
aos graves prejuízos que gera ao setor eqüestre. Por ser de conhecimento a 
 
33 
 
alta prevalência em diversas regiões do Brasil se mostra extremamente 
importante o exame de animais para doença. Outro fato importante de ser 
ressaltado é que dentre as fontes de transmissão está o sêmen do cavalo. 
 
 Coleta de swabs: 
 
São realizadas na base do pênis, prepúcio e fossa uretral. Podem ser 
realizadas coletas da uretra antes e após a ejaculação. Todas as amostras são 
então submetidas a testes de cultura bacteriológica para visualizar a presença 
ou não de microorganismos potencialmente transmissíveis venereamente. 
O CBRA afirma ser indicado avaliar os seguintes patógenos em casos de 
problemas de fertilidade: Streptococcus zooepidemicus, Escherichia coli, 
Pseudomonas sp, Klebsiella sp, Taylorella equigenitalis (metrite contagiosa 
eqüina). 
 
 
FIGURA 4: coleta de swabs da fossa uretral, base do pênis e da uretra ( LU, 2007). 
 
 Testes de resfriamento e congelamento do sêmen: 
 
Um exame completo e que indica as possíveis formas de comercialização 
do sêmen de garanhões não pode deixar de analisar a susceptibilidade aos 
processos de resfriamento e congelamento do sêmen. 
Para os testes de resfriamento podem ser testados diferentes diluidores e 
containeres, sendo as avaliações de motilidade e vigor realizadas nos tempos: 
12, 24 e 48 horas de armazenamento. 
O sêmen congelado deve possuir motilidade total mínima de 30% e vigor 3 
após o descongelamento para que o sêmen do garanhão seja considerado 
apto a comercialização. 
 
 
34 
 
OUTROS EXAMES MAIS ESPECIALIZADOS: 
 
 Os exames indicados pelo o CBRA e The Society for Theriogenology 
são bastante acurados para determinar animais de boa fertilidade e de baixa 
fertilidade. No entanto, em alguns casos estes testes não diagnosticam a real 
causa de um desempenho reprodutivo diminuído. Nestas ocasiões, caso haja 
interesse de investimento dos proprietários, existem testes mais especializado. 
Alguns destes exames são: 
- análise da susceptibilidade in vitro a desnaturação da cromatina 
espermática quando exposta a um reagente ácido; 
- avaliação do teor de atividade da fosfatase alcalina no plasma seminal: 
normalmente os garanhões possuem um elevado nível de fosfatase alcalina 
no sêmen. A maior parte desta enzima tem origina do testículo e epidídimo. 
Este teste é importante para diferenciar uma azospermia primária (origem 
no testículo) de uma secundária (devido à falhas na ejaculação ou bloqueio 
dos ductos ejaculatórios); 
- microscopia eletrônica: visualizar lesões ultra-estruturais na cabeça ou 
cauda dos espermatozóides; 
- coloração supravital, hiposmótico, sondas fluorescentes, etc; 
- testes para avaliar a habilidade do espermatozóide em sofrer a 
capacitação espermática; 
- endoscopia uretral; 
- radiografia contrastada da uretra e ductos deferentes; 
- analises hormonal; 
- biópsia testicular. 
 
DIAGNÓSTICO E CONCLUSÃO: 
 
 A fim de finalizar o exame e emitir o laudo andrológico (anexo 1) é 
necessário que se chegue a uma conclusão e\ou diagnóstico tendo em vista o 
aproveitamento que se almeja do animal. Basicamente, os reprodutores podem 
ser classificados como: aptos, questionáveis ou inaptos para a reprodução. 
 É importante lembrar que muitas vezes a classificação de um animal não 
é permanente. Os reprodutores serão classificados como inaptos se através de 
 
35 
 
um ou mais exames, for caracterizada condições irreversíveis aos mesmos (ex. 
hipoplasia testicular bilateral, criptorquidismo bilateral, degeneração testicular 
grave). Os demais casos que não apresentarem condições desejáveis, quer 
seja do sistema genital, de comportamento sexual, de qualidade seminal e de 
capacidade de executar a monta, serão incluídos na categoria de 
questionáveis. Por sua vez, esta condição pode ser temporária ou permanente. 
A confirmação da condição deve ser feita através de reexames. É importante 
relembrar que para a espécie eqüina, a duração da espermatogênese e trânsito 
no epidídimo, é de 64-66 dias. Este é o intervalo recomendado como desejável 
entre exames andrológicos para emitir resultados conclusivos. 
 Caracterizada a estabilidade do quadro que levou o animal a ser 
classificado como questionável, os achados poderão ser suficientes para incluí-
lo no grupo dos inaptos ou em grupos específicos para reprodução (apto para 
inseminação artificial, apto para monta natural com número reduzido de éguas). 
Quanto ao inapto, deverá ser recomendado o afastamento do mesmo como 
reprodutor. 
 O nível de exigência para cada reprodutor varia de acordo com o 
número de éguas para o animal na estação, se será utilizado apenas o sêmen 
fresco, ou, resfriado, ou, congelado, etc. Tais aspectos devem ser 
considerados no momento da emissão do laudo. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
36 
 
4.2- Modelo de laudo andrológico 
CENTRO DE REPRODUÇÃO EQUINA 
Endereço, contatos 
 
A. IDENTIFICAÇÃO 
 Nome do reprodutor: Registro: 
 Espécie: Raça: Data do Nascimento: 
 Proprietário: 
 Endereço: 
B. EXAME CLÍNICO E EXAME DO SISTEMAGENITAL 
1- Histórico: 
2- Geral: 
 3- Sistema genital: Prepúcio: Pênis: 
Testísculos Esquerdo Direito 
Dimensões (comprimento, profundade e largura) 
Posição 
Consistência 
Sensibilidade dolorosa 
Mobilidade 
Epidídimo 
Genitália interna: 
4- Comportamento sexual (libido): 
C. ESPERMOGRAMA 
1. COLETA DE SÊMEN 
 Método: Data da Coleta: 
2. CARACTERÍSTICAS FÍSICAS: 
 Volume do ejaculado: mL Motilidade: / % 
 Vigor (O – 5): Concentração: mL (x 10
6
 / mm
3
) 
 Aspecto: Total de espermatozóides (x 10
9
): 
3. CARACTERÍSTICAS MORFOLÓGICAS 
Defeitos maiores Defeitos menores 
+ Patologia de cabeça: + Patologia de cabeça: 
Subdesenvolvida: Delgada: 
Isolada patológica: Gigante, curta, larga, peq. normal: 
Estreita na base: Isolada normal: 
Piriforme: + Patologia da cauda e implantação: 
Pequena anormal: Retroaxial, oblíquo: 
Contorno anormal: Dobrada ou enrolada: 
“Pounch formation”: + Gota citoplasmática distal: 
+ Acrossômo: Outros elementos 
+ Gota proximal: Medusa: 
+ Formas teratológicas: Células primordiais: 
+ Defeitos da peça intermediária: Células gigantes: 
+ Patologia de cauda: Leucócitos: 
Fortemente dobrada ou enrolada: Hemácias: 
Dobrada com gota: Células epiteliais: 
Enrolada na cabeça: Bactérias: 
+Formas duplas: Cristais: 
 TOTAL DEFEITOS MAIORES: % TOTAL DEFEITOS MENORES: % 
 Observações: 
D. Teste de resfriamento: Tempo máximo: Mot: / % Vigor: Diluidor: Container: 
 Tempo máximo: Mot: / % Vigor: Diluidor: Container: 
E. Testes de congelamento: Mot.: / % Vigor: Diluidor: 
F. TESTES COMPLEMENTARES: 
TTR, espermocultura, outros: 
G. CONCLUSÃO: 
 
___________________, ______de______________de_______ 
 
 
___________________________________________ 
Carimbo e Assinatura do Responsável Técnico 
 
 
 
37 
 
5- PRINCIPIOS DA CRIOPRESERVAÇÃO E TÉCNICAS DE 
CONGELAMENTO DO SÊMEN DE GARANHÕES 
 
5.1- Histórico da técnica: 
 
 A inseminação artificial dos animais domésticos supostamente iniciou-se 
com os eqüinos, quando em 1322 um chefe árabe roubou sêmen de um valioso 
garanhão pertencente a tribo rival e inseminou uma égua. Posteriormente em 
1776, Spallanzani, passou e estudar o efeito do frio sobre os espermatozóides. 
A possibilidade de manter o sêmen por longos períodos foi o principal 
incentivo para o desenvolvimento das técnicas de congelamento de sêmen. 
Uma vez que o uso do sêmen resfriado limita em média o tempo de 
armazenamento a 48 horas, novos métodos tiveram de ser desenvolvidos 
buscando maximizar as vantagens do uso da inseminação artificial. A 
possibilidade de estocar o sêmen por longos períodos só pode ser conseguida 
através da paralisação dos processos metabólicos do espermatozóide, fato que 
pode ser realizado com o congelamento do sêmen. 
Estudos relevantes para criopreservação do sêmen nas mais diversas 
espécies foram desenvolvidos em meados do século XX. Naquela época os 
congelamentos eram realizados em gelo seco (-79ºC) e a taxa de 
sobrevivência espermática era relativamente baixa. 
 No ano de 1957 foi registrada a primeira prenhez utilizando sêmen 
congelado de garanhões, sendo este obtido da cauda do epidídimo. Uma de 
sete éguas inseminadas com sêmen criopreservado em meio contendo leite 
integral acrescido de 10% de glicerol ficou gestante. 
 Apesar das limitações, após a liberação de diversas associações nas 
ultimas décadas, o sêmen congelado passou a ser utilizado na rotina de 
diversas centrais de reprodução e haras, sendo importante o conhecimento da 
técnica e suas novidades. 
A criopreservação de sêmen se destaca por suas inúmeras vantagens: 
diminuição de custos com aquisição de animais geneticamente superiores; 
armazenamento por tempo indeterminado; utilização do sêmen de animais 
excepcionais mesmo após a perda da capacidade reprodutiva ou morte; 
 
38 
 
racionalização do uso do reprodutor com aumento da relação macho/fêmea; 
controle de doenças venéreas e facilidade no transporte a longas distâncias. 
 
5.2- Princípios da criopreservação 
 
O processo de criopreservação de sêmen inclui todas as etapas – desde 
a coleta de sêmen, diluição, centrifugação, resfriamento e congelamento – até 
a manutenção da capacidade funcional do espermatozóide por determinado 
período após o descongelamento. O sucesso no resultado final do processo de 
criopreservação depende de interações entre meios diluidores, crioprotetores, 
curva de resfriamento e descongelamento. Agindo em conjunto estas etapas 
são responsáveis por reduzir os danos causados pelo choque térmico, 
reduzindo a formação de cristais de gelo intercelulares e propiciando uma 
adequada desidratação celular. 
Existem pelo menos dois pontos de estresse pelos quais as células 
espermáticas passam durante o congelamento e descongelamento. O primeiro 
está relacionado aos efeitos das mudanças na temperatura e o segundo 
aparece por causa da formação e dissolução do gelo. 
Um fenômeno lesivo ao espermatozóide ocorre durante o resfriamento. 
À medida que a temperatura é reduzida abaixo de 0ºC, começa a ocorrer 
cristalização do gelo no meio extracelular. Se há um congelamento muito lento, 
as células são expostas por muito tempo aos chamados “efeitos de solução”. 
Este efeito inclui todas as características de mudanças da solução extracelular 
como: a cristalização do gelo, a concentração de sal com elevação da 
osmolaridade, a alteração do pH, as alterações na composição das soluções 
em conseqüência dos sais atingirem seu ponto de saturação e cristalização, 
além de todas as implicações celulares desses eventos. 
Outro fenômeno observado é a formação de cristais de gelo no interior 
das células espermáticas que ocorre principalmente quando são usadas taxas 
de resfriamento excessivamente rápidas. Em taxas mais altas que as ideais, 
não há tempo suficiente para que a água saia das células, levando a um super-
resfriamento e a uma crescente probabilidade da nucleação do gelo 
intracelular, que pode ser letal. 
 
39 
 
A curva de descongelamento ideal depende da curva de congelamento 
utilizada. Espermatozóides congelados numa curva lenta requerem uma curva 
lenta de descongelamento, para permitir o descongelamento dos cristais de 
gelo extracelulares. O descongelamento desses cristais provoca a diluição dos 
solutos ocorrendo lentamente a rehidratação das células. Caso os 
espermatozóides sejam descongelados rapidamente, os cristais extracelulares 
descongelam mais rápidos e a água penetra nas células de forma brusca, 
causando ingurgitamento e danos à membrana plasmática. As células 
congeladas numa curva rápida necessitam de uma curva rápida de 
descongelamento, de modo que o gelo intracelular que se formou durante o 
congelamento não tenha tempo para se recristalizar. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Quando a temperatura do meio atinge entre –5 ºC e –10 ºC, cristais de 
gelo se formam, a partir da água pura no meio extracelular, porém protegido 
pela membrana plasmática, o meio intracelular não se congela, (super 
refrigerado). O ponto de congelamento de uma solução é determinado pela 
concentração de solutos que dela participam. Em decorrência,a água do 
interior da célula flui por osmose para o meio externo e também se congela. Os 
Figura 1: Representação esquemática das mudanças físicas sofridas pelo espermatozóide 
equino durante o congelamento e descongelamento (AMANN & PICKETT, 1987). 
 
 
40 
 
outros elementos do meio extracelular (sais, proteínas e gorduras), 
permanecem na porção não congelada. Com a temperatura diminuindo, mais 
moléculas de água se cristalizam, resultando em uma concentração maior de 
solutos na fração não congelada, que formarão os “canais não congelados”. Ao 
congelar os espermatozóides em nitrogênio líquido (-196ºC), os 
espermatozóides residem em canais de solução não congelados. Somente as 
células localizadas neste local sobreviverão ao processo da criopreservação. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Após atingir a temperatura de –196 ºC as células cessam suas reações 
e atividades metabólicas, tornam-se dormentes. Nesta faixa de temperatura a 
viabilidade não é mais alterada, independente do tempo de armazenamento. 
Diferentes teorias da crioinjúria divergem em apontar se a injúria ocorre 
durante o resfriamento ou o aquecimento do espermatozóide. Há alguma 
evidência para sugerir que células congeladas sejam danificadas pelo 
reaquecimento, o que tem sido considerado devido ao fenômeno chamado de 
recristalização de cristais. Este fenômeno consiste na transformação de vários 
cristais microscópicos de gelo em cristais de gelo maiores, que são 
reconhecidos como prejudiciais. Lesões de membrana causadas por transições 
da fase lipídica talvez possam também ser responsáveis por este efeito 
negativo do aquecimento, uma vez que passar pelo processo de resfriamento e 
reaquecimento significa atravessar pontos de transição de fase por duas vezes. 
 
 
 
 
Figura 2: Canais não congelados (SQUIRES, 1999). 
 
 
41 
 
5.3- Meios diluidores utilizados para criopreservação de sêmen eqüino: 
 
Para que a criopreservação tenha sucesso, é necessário que o 
espermatozóide seja colocado em um ambiente apropriado (diluidor), que 
minimize os danos às membranas, e não acione prematuramente os 
mecanismos de capacitação espermática e reação acrossômica. Com esse 
intuito têm se produzido meios diluidores adicionados de uma série de 
crioprotetores. 
Um bom crioprotetor deve possuir baixo peso molecular, com alta 
solubilidade em água e baixa toxicidade celular. Observando a literatura é 
possível encontrar uma divisão básica que agrega os crioprotetores em 
penetrantes e não penetrantes. 
Os compostos penetrantes podem ser subdividos: na família dos álcoois 
(etanol, etilenoglicol, glicerol, metanol, polietilenoglicol, e propilenoglicol), das 
amidas (acetamida, formamida, lactamida entre outras) e o dimetil sulfóxido 
(DMSO) com características crioprotetoras. O glicerol é atualmente o principal 
crioprotetor penetrante utilizado. Apesar de seus efeitos deletérios, como: 
estresse osmótico, mudanças na organização, fluidez e permeabilidade da 
membrana, e na sua composição lipídica. 
Ainda hoje, o mecanismo de ação dos crioprotetores penetrantes não 
está bem compreendido, sugere-se que estas substâncias atuem por meio de 
propriedade coligativa com a água reduzindo o ponto de congelação da 
solução. Estes compostos modificam as características da molécula de água, 
reduzindo a formação de cristais de gelo, atuando como solvente e diminuindo 
a concentração de solutos no meio externo. A presença do glicerol em uma 
solução irá propiciar uma maior quantidade de água não congelada do que 
outra sem o glicerol, aumentando o volume dos canais de solventes não 
congelados e reduzindo a concentração de sais das porções não congeladas. 
Além disto, estas substâncias atuam na membrana celular estabilizando o 
complexo: água, lipídeo e proteína. 
Entre os crioproterores não penetrantes estão os açúcares (lactose, 
frutose, rafinose e threalose), os polímeros sintéticos (metil celulose), a gema 
de ovo, o leite e alguns aminoácidos (glutamina, treonina, glicina, dentre 
outros). Esta categoria protege as células basicamente por meio de efeitos 
 
42 
 
osmóticos. As células em suspensão em um meio hipertônico perdem seu 
conteúdo de água. Desta forma, diminuem a possibilidade de formação de 
cristais dentro da célula. Estes componentes agem como solutos ou colóides, 
não servindo como solventes. 
 
Figura 1: Meios diluidores para 
congelamento de sêmen eqüino. 
Botu-crio
®
 e FR-5
®
. 
 
5.4- Etapas do congelamento do sêmen eqüino 
 
5.4.1- Coleta de sêmen: 
 
 A coleta de sêmen para congelamento não se diferencia das coletas 
realizadas para outros procedimentos, como a IA com sêmen fresco ou 
resfriamento. Para melhores resultados no congelamento de espermatozóides 
são indispensáveis os cuidados com a contaminação durante a coleta e todas 
as etapas de manipulação do sêmen. 
 
5.4.2- Centrifugação: 
 
 A centrifugação é uma etapa indispensável ao processo de 
criopreservação espermática. Esta etapa visa concentrar os espermatozóides, 
eliminando o plasma seminal, para maximizar o armazenamento das doses em 
palhetas de 0,5 mL ou em macrotubos. 
 Para centrifugação o sêmen deve ser diluído em proporções que variam 
de 1:1 a 4:1, ou, em concentrações que variam de 50 a 80 x 106 
espermatozóides por mL. Os principais diluidores utilizados nesta etapa são 
 
43 
 
aqueles a base de leite em pó, o ringer com lactato de sódio ou outros meios a 
base de glicose-EDTA. 
 Bastante atenção deve ser dada a força e ao tempo de centrifugação. 
Este deve ser realizado de forma a maximizar a recuperação celular sem 
causar danos a estas células. Para maior parte dos animais tem se 
preconizado a centrifugação a 600 x g por 10 minutos. As perdas têm variado 
de 10-25% das células espermáticas, valor que deve ser considerado no 
momento de calcular as doses a ser condicionadas nas palhetas. 
 Após a centrifugação o sobrenadante é eliminado e o pellet de sêmen 
que é formado no fundo do tubo de centrífuga é ressuspendido com diluidor de 
congelamento ajustando a concentração desejada. 
 
 
Figura 2: Centrífuga com tubos 
dispostos de forma equilibrada. 
 
 
 
 
44 
 
 
Figura 3: Aspecto do sêmen após 
centrifugação (pellet de 
espermatozóides nos fundo e 
sobrenadante sendo aspirado). 
 
5.4.3- Resfriamento 
 
O resfriamento do sêmen antes da criopreservação visa recuperar as 
células espermáticas dos efeitos da centrifugação e diminuir as injúrias que 
possam vir a ser causadas devido ao choque pelo frio. 
A velocidade de redução da temperatura durante o congelamento tem 
sido um dos fatores mais importantes no processo de criopreservação, visto 
que, o grau de lesões celulares depende da curva de resfriamento. O choque 
térmico pelo frio, nas membranas espermáticas, é mais pronunciado quando o 
resfriamento ocorre rapidamente na faixa de temperatura entre 20 e 0oC. A 
ocorrência do choque pelo frio pode ser evitada ou amenizada refrigerando-se 
lentamente o sêmen eqüino diluído até 4ºC, a taxas iguais ou inferiores a 
0,5ºC/min. 
O termo choque frio define algumas modificações que ocorrem no 
espermatozóide quando submetido a uma curva de refrigeração rápida. Esse 
processo se caracteriza por padrão anormal de movimento espermático, perda 
rápida de motilidade, danos no acrossoma e membrana plasmática, redução do 
metabolismo e perda dos componentes intracelulares. 
 
45 
 
 Na rotina de congelamento tem-se utilizado geladeiras com temperatura 
estabilizada a 5ºC para resfriar o sêmen eqüino. Os tempos de resfriamento 
têm variado de 10 a 60 minutos, em função