Estudo das Células

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Métodos de Estudo das Células 
Aula 2 
Citologia e Histologia 
Bárbara Loureiro 
MV1V 
2017/1 
Comparação do poder de resolução de diferentes microscópios e do olho humano. 
(Adaptado de Alberts y col., Molecular Biology of the Cell, 2004) 
 
• TIPOS DE MICROSCÓPIOS: 
• Microscópio óptico: 
– Parte Mecânica 
– Parte Óptica: - Condensador 
 - Objetiva 
 - Ocular 
 
 Microscópio 
 Função: -  imagem 
 - Fornecer riqueza de detalhes  Limite de Resolução 
 
 
Limite de Resolução = menor distância que deve existir entre dois pontos para 
que eles apareçam individualizados 
 
LR = K .  K =constante experimental estimada em 0,61 
 AN  = comprimento de onda da energia (Luz) – 0,55 
 AN = abertura numérica da lente objetiva 
 
 
 
 
  AN  LR   Poder de Resolução e  Riqueza de Detalhes 
Abertura Numérica 
AN = Abertura numérica 
n = Índice de refração do meio de montagem 
sen = Fornecido pelo fabricante da lente 
A = Ângulo de abertura da objetiva 
α = Ângulo correspondente à metade de A 
* AN Objetiva 4 X (vermelha) = 0,1 
 Objetiva 10 X (amarela) = 0,25 
 Objetiva 40 X (azul) = 0,65 
 Objetiva 100 X (branca) = 1,3 
AN = n.senα 
Microscópio Eletrônico de transmissão e de 
varredura 
 
Permitiu o conhecimento de estruturas celulares não 
visíveis no microscópio óptico por possuir maior poder 
resolutivo. 
• O avanço da microscopia eletrônica se deu a 
partir da descoberta de que os elétrons 
tinham comportamento ondulatório 
semelhante aos fótons de luz 
 
 
Imagem Final ao MET 
• Eletrodensa (escura) → os elétrons encontram 
elementos como: ferro, ósmio, chumbo, ouro 
etc 
• Eletrolúcida (clara) → os elétrons encontram 
elementos como: hidrogênio, carbono, 
oxigênio, nitrogênio etc 
Observação: Contrastação do material biológico 
(maioria eletrolúcidos): metais pesados 
MET 
Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) 
• Revela feições topográficas da superfície (detalhes) 
• Imagens tridimensionais: 
- Vermes 
- Insetos 
- Células livres (animais/vegetais) 
- Embriões 
- Fragmentos geológicos 
• Elétrons secundários / refletidos na superfície da amostra 
 
 
Microscópio Eletrônico x Microscópio Óptico 
 
Microscópio Óptico X Microscópio Eletrônico 
 
 Objetiva 100 a 120 X Objetiva 20.000X 
 Ocular 5 a 15 X Lentes Intermediárias 
   
 500 a 1500 X 1.000.000X 
  
 Negativos podem ser 
 ampliados até 10.000.000X 
OS MATERIAIS A SEREM ESTUDADOS ATRAVÉS DA 
MICROSCOPIA DEVEM SER PROCESSADOS (PREPARADOS): 
 
– Autólise e Proliferação de Microrganismos; 
– Pequena dimensão das células; 
– Falta de contraste entre as células; 
– Tamanho dos tecidos, órgãos a serem 
examinados. 
PROCESSAMENTO DOS TECIDOS 
Etapas EtapasMicroscópio 
Óptico 
Microscópio 
Eletrônico 
Fixação Álcool, Ac. 
Cítrico,Formol 
Glutaraldeído, 
Tetróxido de ósmio 
Inclusão Parafina Resinas Tipo Epon 
Ex: epon, araldite 
Microtomia Micrótomo: -
Navalhas de aço – 
Cortes: 5 a 10 m 
Ultramicrótomo: 
-Navalhas de vidro 
ou diamante 
-Cortes: 0,1 a 0,05 
m 
Coloração Interação Ácido -
Base 
Sais de metal 
pesado 
Montagem Lâmina e Lamínula Grades ou telas 
metálicas 
Coloração para microscopia 
Coloração para microscopia 
OUTROS MÉTODOS DE ESTUDO DAS CÉLULAS: 
 
• 1 - CITOQUÍMICA: 
 
 Consiste na identificação e na localização de diversos 
compostos químicos dentro da célula 
 
– Microscopia Óptica: Corado 
– Microscopia Eletrônica: Dispersar elétrons 
 
-Quantitativos ou Qualitativos 
 
Intensidade de cor proporcional à [ ] da substância - 
Citofotômetro 
CITOQUÍMICA: 
ex: Sudan – Lipídeos 
 PAS (periodic acid schiff) – Polissacarídeos 
 Feulgen - DNA 
Glomérulo renal - PAS Fungo - PAS 
CITOQUÍMICA: 
 
DNA Célula Vegetal - Feulgen Lipídeos Célula Vegetal – Sudan 
• 2- MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA: 
 
Baseia-se na capacidade que certas substâncias apresentam 
de emitir luz visível quando iluminada por luz ultravioleta 
 
- Constituintes celulares fluorescentes: - Vit A, Vit B2, 
Porfirinas 
 - Corantes Fluorescentes: - Alaranjado de Acridina (Ac. 
Nucléico) 
Célula em mitose 
Ptn Fluorescente verde – Microtúbulos 
Ptn Fluorescente roxa – Centrômeros 
Ptn Fluorescente azul - DNA 
Microscopia Confocal 
• 1987 - Disponível mundialmente 
• O microscópio confocal tem seu 
funcionamento baseado nos 
princípios da microscopia de 
fluorescência → Utiliza laser 
como fonte de luz 
• Permite a visualização: 
materiais espessos; corpos 
inteiros sem coloração prévia 
(vivos ou pré-fixados) 
• Reconstrução do objeto 
tridimensionalmente → Vários 
planos focais ou cortes ópticos 
(programas computacionais) 
Aplicações da Microscopia confocal a laser 
1. Todas as possibilidades já descritas para a 
microscopia de fluorescência convencional 
 2. Reconstrução 3-D de organismos microscópicos 
3. Aumento de sinais de fluorescência de estruturas 
subcelulares. Exs: microtúbulos, miofilamentos, 
filamentos intermediários e elementos finos da 
matriz extracelular 
Microscopia Confocal 
Microscopia Confocal 
 3- IMUNO-CITO/HISTOQUÍMICA 
ICC/IHC 
 
Possibilita o estudo da localização intracelular de proteínas 
específicas 
 
 
 Reação Antígeno-Anticorpo (Ag-Ac) 
 2 Tipos: 
 
A - Imunocitoquímica Direta 
 
B - Imunocitoquímica Indireta 
ICC/IHC Direta 
 
ICC/IHC Indireta 
 
Imunocitoquímica 
 
Adenocarcinoma de padrão 
de disseminação bronquíolo-
alveolar (HE). 
TTF1 positivo; CK7 positivo; CK20 
negativo; PSA negativo; 
Tireoglobulina negativo. Perfil 
Imunohistoquímico Compatível com 
adenocarcinoma primário de 
pulmão. 
 
Imunocitoquímica 
 
Reação imuno-histoquímica positiva para o vírus da dengue 
 
A ICC/IHC é mais específica que a técnicas CITOQUÍMICAS 
pois estas (as citoquímicas) se baseiam na identificação 
apenas de aminoácidos, podendo marcar desta forma 
diferentes tipos de proteínas. 
 
 
A ICC/IHC IDENTIFICA UM TIPO ESPECÍFICO DE PROTEÍNA . 
Microscópio composto utilizado por 
Robert Hooke (1635 – 1703). 
Em detalhe no circulo estão os desenho 
de cortiça vista ao microscópio ótico. 
 Microscópio Eletrônico 
DÚVIDAS?