1 - Microscopia - CHG Medicina

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Princípios	Básicos	de	
Microscopia	Óptica	e	Eletrônica
Outras	informações
Avaliação Valor
1ª	Prova	Teórica/Pratica	 30	pts
2ª	Prova	Teórica/Pratica 30	pts
3ª	Prova	Teórica/Pratica 30	pts
Trabalho		 3	pts
Atividade	integradora 7	pts
Obtenção de pelo menos 60 pontos no semestre, a presença mínima em
75% do total de aulas. Será considerado reprovado o aluno que não
cumprir esses critérios.
BIBLIOGRAFIA
• ALBERTS, B.; BRAY, A.; JOHNSON, A.; LEWIS, J.; RAFF, M.; ROBERTS, K. & WALTER, P.
Fundamentos da Biologia Celular - 4ª edição. Artmed, 2017. 864p.
• GARTNER,L.P.; HIATT,J.L. Atlas colorido de Histologia - 6ª edição. Guanabara Koogan,
2014. 512p.
• GARTNER,L.P. Tratado de Histologia - 4ª edição. Elsevier, 2017. 664p.
• JUNQUEIRA, L.C.; CARNEIRO; J. Histologia básica - 13ª edição. Guanabara Koogan,
2017. 568p.
• JUNQUEIRA, L.C.; CARNEIRO; J. Biologia celular e molecular – 9ª edição. Guanabara
Koogan, 2012. 376p.
• ROSS, H.M.; PAWLINA, W. Histologia - Texto e Atlas - 7ª edição. Guanabara Koogan,
2016. 1000p.
Organização	das	células	e	tecidos
Biologia	celular	/Citologia Histologia
Estudando	células	e	tecidos
Biologia	Celular	/	Citologia Histologia
Unidade ESTRUTURAL e 
FUNCIONAL fundamental 
dos seres vivos
Conjunto de células
especializadas
Microscópio
Célula
Diferentes	tipos	de	células
Neurônio	cerebelar
Paramecium
(protozoario) Células	vegetais
Bdellovibrio
bacteriovorus
(bacteria)
Unidades	de	medida
m mm µm nm
Metro	(m) 1 1000	/	103 1.000.000	/	106 109
Milímetro (mm) 0,001	/	10-3 1 1.000	/	103 1.000.000	/	106
Micrômetro (µm) 0,000001	/	10-6 0,001	/	10-3 1 1.000	/	103
Nanômetro	(nm) 10-9 0,000001	/ 10-6 0,001	/	10-3 1
Picômetro (pm) 10-12 10-9 0,000001	/ 10-6 0,001	/	10-3
Um	sentido	de	escala	entre	células	vivas	e	átomos
Poder	de	resolução
Poder	de	resolução	x Aumento
Limite de resolução é diferente da capacidade de aumento
Poder de Resolução = menor distância entre dois objetos que permite que eles sejam 
vistos como dois objetos separados.
Abaixo do poder de resolução
Dentro do poder de resolução
Aumento
Poder	de	resolução
Melhor	resolução	=	menor	distância	entre	duas	partículas	que	
permite	que	elas	sejam	vistas	como	dois	objetos	separados.
Microscópio	óptico
Microscópio	óptico
Ampliação Total:
Aumento da ocular
x
Aumento da objetiva
Microscópio	óptico:	resolução	e	objetiva
N.A.
Espectro	eletromagnético
Tipos	de	microscopia	óptica
§ Microscopia de campo claro
§ Microscopia de contraste de fase
§ Microscopia de contraste de interferência diferencial (DIC)
§ Microscopia de campo escuro
§ Microscopia de fluorescência
Ø Epifluorescência
Ø Confocal
Ø Superresolução
Tipos	de	microscopia	óptica
Microscopia de campo escuro
Microscopia de contraste de fase
Microscopia de contraste de
interferência diferencial (DIC)
Muito	usado	para	visualizar	células	vivas	(cultura	de	células)
Microscopia de campo claro
Tipos	de	microscopia	óptica
Microscopia de campo claro
Pouco	contraste
Tecido	precisa	ser	corado
Técnica	histoquímicas	ou	histológicas
Microscopia	de	fluorescência
Microscopia	de	fluorescência
Proteína	nuclear
Proteína	citoplasmática
Proteína	de	membrana
Processamento	histológico	– Microscopia	Óptica
Perfusão	do	animal	com	fixador
Remoção	do	tecido	do	animal Pós-fixação	e	desidratação Inclusão
SecçãoPFA	/	MetanolSacarose	/	Etanol
OCT
Parafina
Criostato
Micrótomo
2-50	µm
Microscopia 3D	em tecido transparente - CLARITY
Chung et	al.,	2013	- Nature
Microscopia 3D	em tecido transparente - CLARITY
Chung et	al.,	2013	- Nature
3D	visualization	of	YFP-expressing	neuronal	circuit	elements in	the
ventral	half	of	the	intact	Thy-1:eYFP	mouse	brain	(16	weeks	old).
Microscopia	eletrônica
limite	de	resolução	e	o	comprimento	de	onda
Microscopia	Eletrônica	utiliza	feixes	de	elétrons	acelerados	como	fonte	de	luz.
Em um microscópio eletrônico com uma voltagem de aceleração 
de 100.000 V, o comprimento de onda de um elétron é de 0,004 nm.
Limite	de	Resolução	do	MO:	(530	nm)	0,2	μm =	200	nm
Limite	de	Resolução	do	ME:	0,1	nm (0,0001	μm = 2.000	vezes	melhor	que	MO)
para	materiais	biológicos:	1	nm (0,001	μm = 200	vezes	melhor	que	MO)
Microscopia	eletrônica
Transmissão	– MET Varredura	- MEV
Microscopia	eletrônica	de	transmissão	- MET
Processamento	para	MET
Perfusão	do	animal	com	fixador
Remoção	do	tecido	do	animal Pós-fixação	e	desidratação Inclusão
Secção
Plástico
Resina
Glutaraldeído /	Tetróxido de	ósmio
Acetona
Ultramicrótomo
60	nm
Citrato de chumbo
Microscopia	eletrônica	de	transmissão	- MET
Microscopia	eletrônica	de	varredura	- MEV
MET	utiliza	os	elétrons	que	atravessaram	a	
amostra	para	formar	uma	imagem.
MEV	utiliza	os	elétrons	que	são	espalhados	ou	emitidos	a	partir	
da	superfície	da	amostra	e	são	coletados	por	um	detector.
Ø Produz	imagens	em	3D.
Ø Resolução	alcançável	não	é	muito	alta	(cerca	de	10	nm)
Ø Utilizada	para	estudar	células	e	tecidos	intactos,	em	vez	de	organelas	subcelulares.
Processamento	para	MEV
Perfusão	do	animal	com	fixador
Remoção	do	tecido	do	animal Pós-fixação	e	desidratação
Glutaraldeído /	Tetróxido de	ósmio
Acetona
- coberta com uma camada
fina de metal pesado
- fratura
Microscopia	eletrônica	de	varredura	- MEV
Microscopia óptica Microscopia eletrônica
Fixação: 
-Paraformaldeído
-Formalina
Fixação: 
-Glutaraldeído
(proteínas) 
-Tetróxido de Ósmio 
(lipídios)
Inclusão:
-Parafina / OCT
Inclusão:
- Resina/plástico
Secção:
- Corte 2-50 µm 
- Navalha de aço
- Micrótomo / Criostato
Secção:
- Corte 60 nm
- Navalha de diamante
- Ultramicrótomo
Coloração:
- HE, fluorescência,...
Contrastação:
- Citrato de chumbo
Processamento	MO	x ME