Métodos de Estudo em Biologia Celular e Histologia

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MICROSCOPIA
-Microscópio óptico (MO) - luz 
-Microscópio eletrônico (ME) - um feixe de 
elétrons
Quais são os tipos de microscópios 
que você conhece?
MICROSCOPIA
MICROSCÓPIO ÓPTICO (DE LUZ)
-parte mecânica 
-parte óptica: lentes 
(condensador, objetivas e 
oculares)
Resolução: 0,2µm
Medidas usadas em microscopia:
MICROSCÓPIO ELETRÔNICO
-O microscópio eletrônico emprega feixes de elétrons em vez de luz 
para formar imagens.
-Resolução: 0,3nm 10nm
Microscópio Eletrônico 
de Transmissão
Microscópio Eletrônico 
de Varredura
O ME tem maior poder de 
resolução; portanto, possui 
maior capacidade de distinguir 
detalhes.
Macrófago – ME de Transmissão
Macrófago – ME de Varredura
Poder de Resolução
Macrófago – MO
Quanto MENOR o Limite de resolução, MAIOR 
o poder de resolução de um sistema óptico.
•Limite de Resolução = a menor distância que 
deve existir entre dois pontos para que apareçam 
individualizados. 
•O limite de resolução das melhores lentes 
utilizadas nos microscópios ópticos comuns é de 
0,2 micrômetros (µm). 
Poder de Resolução
é dado pelo Limite de Resolução.
-Olho humano: poder de resolução de cerca de 0,1 
mm (ou 100 µµµµm). 
-Isto significa que se você olhar dois pontos 
separados por uma distância menor que 100 µµµµm, 
esses pontos aparecerão como um ponto único. 
MICROSCOPIA 
Poder de Resolução
Medidas usadas em microscopia:
Níveis de resolução
MÉTODOS DE ESTUDO EM BIOLOGIA CELULAR E 
HISTOLOGIA
Como visualizar uma célula?
Como preparar as células para ser 
visualizadas no microscópio?
PROCESSAMENTO DE MATERIAL HISTOLÓGICO
www.icb.ufmg.br 
FIXAÇÃO
- Evita a autólise
-Impede o crescimento bacteriano
-Endurece as células
-Preservação da estrutura e composição molecular dos tecidos
Fixadores químicos :
• Formaldeído a 4%
• Glutaraldeído e tetróxido de ósmio
Fixação física:
• Congelamento – preparação rápida; estudo de enzimas e de
lipídeos
microtomia
põe o corte na lâmina
secagem 
em estufa
Inclusão
em parafina 
ou resina
•Proporciona contraste entre as estruturas celulares.
•Corantes: substâncias com cor própria e capacidade 
de ligação com grupos químicos específicos das células 
ou seus produtos.
•Cor: presença de grupos cromóforos do corante.
COLORAÇÃO
Corantes básicos: radicais ionizados catiônicos (cargas 
positivas livres).
Ex: azul-de-toluidina, azul-de-metileno, hematoxilina
Corantes ácidos: radicais ionizados aniônicos (cargas 
negativas livres).
Ex: orange G, fucsina ácida, eosina
COLORAÇÃO
Hematoxilina/Eosina (HE) 
Coloração mais utilizada
Corte de fígado – HE
Hepatócitos com núcleo basófilo e
citoplasma acidófilo
Pâncreas (porção exócrina - ácinos)
Hematoxilina/Eosina (HE) Coloração mais 
utilizada em Microscopia de Luz (óptica)
•A Hematoxilina (básico) cora componentes ácidos das 
células em tons de azul. 
•Ex: ácidos nucleicos (DNA e RNA). Esses componentes 
são chamados basófilos (têm basofilia).
•Substâncias basófilas possuem radicais ionizados 
negativos.
•A Eosina (ácido) cora as estruturas básicas da célula 
em tons que variam do rosa ao vermelho. 
•As proteínas no citoplasma da maioria das células são 
básicas. Então diz-se que o citoplasma é acidófilo
(acidofilia). 
•Substâncias acidófilas possuem radicais ionizados 
positivos.
COLORAÇÃO
São alterações, defeitos causados pelo processamento 
dos tecidos.
Exemplos de artefatos em Microscopia Óptica: 
-Retração causada pelo fixador (aparecimento de 
espaços)
-Dobras no corte
-Precipitação de corantes ou sujidade
-Ruptura do tecido
ARTEFATOS
Retração DobrasSujidade
INTERPRETAÇÃO DE CORTES HISTOLÓGICOS
MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE
MICROSCOPIA DE CONTRASTE DE FASE DIFERENCIAL (DIC)
- Utilizam índices de refração para formar uma imagem através 
de lentes objetivas especiais, com diferentes graus de obscuridade 
ou luminosidade.
-Exame da estrutura e de movimento de organelas de tecidos 
vivos, transparentes e não corados.
Iluminação direta 
Contraste de fase (refração da 
luz)
Contraste diferencial de 
interferência (refração da luz) 
MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA COMUM
-Utiliza luz com comprimentos de onda curtos e alta energia 
(luz UV).
-Permite localizar estruturas celulares cujos componentes 
químicos foram marcadas com fluorocromos.
-Fluorocromos: substâncias com propriedade de emitir luz 
quando excitadas por radiações como ultravioleta.
MICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE TRANSMISSÃO
-Componentes celulares são impregnados com metal 
pesado (Pb, Os)
-Eletrondensos: desviam os elétrons, aparecem escuros
-Eletronlúcidos: atravessados pelos elétrons, são claros 
-Poucos elétrons desviados: diversas tonalidades de 
cinza.
Mastócito apresenta grânulos eletrondensos
MICROSCÓPIO ELETRÔNICO DE VARREDURA
A micrografia obtida tem um aspecto tridimensional. 
Visualização de superfícies de espécimes não seccionados. 
• Lâminas Não-Permanentes
• Células em cultura
TÉCNICAS HISTOLÓGICAS
ESTUDO DE CÉLULAS VIVAS
HISTOQUÍMICA/CITOQUÍMICA
•São métodos que identificam e localizam
substâncias por meio de reações químicas
específicas ou interações de alta afinidade entre 
moléculas.
•As reações resultam em substâncias insolúveis
coloridas ou eletrondensas que permitem sua
localização por microscopia de luz ou eletrônica.
HISTOQUÍMICA/CITOQUÍMICA
•Ácido periódico: oxidação dos
radicais 1,2-glicol nos açúcares = 
radicais aldeído.
•Reagente de Schiff (solução de 
corantes) reage com os grupos 
aldeído = cor vermelha ou púrpura 
nos locais do corte onde há muitos 
polissacarídeos ou oligossacarídeos. 
Ex: Células caliciformes no epitélio do 
intestino; glicogênio no fígado. 
Células caliciformes no epitélio intestinal. 
Reação de P.A.S. associada com HE
POLISSACARÍDEOS E OLIGOSSACARÍDEOS: reação do 
ácido periódico-Schiff (P.A.S.)
H.E.
P.A.S.
POLISSACARÍDEOS: reação do ácido periódico-Schiff 
(P.A.S.)
HISTOQUÍMICA/CITOQUÍMICA
Hepatócitos de camundongo em 
jejum
Níveis muito baixos de glicogênio
Hepatócitos de camundongo duas 
horas após alimentação
Regiões P.A.S.-positivas
-Baseada na interação antígeno e anticorpo. 
-Altamente específica.
-Anticorpos com marcadores que determinam 
sua localização.
HISTOQUÍMICA/CITOQUÍMICA
IMUNOCITOQUÍMICA/IMUNO-HISTOQUÍMICA
IMUNOCITOQUÍMICA/IMUNO-HISTOQUÍMICA
O marcador para o anticorpo pode ser Fluorescente
(Imunofluorescência: uso de fluorocromos)
Imunofluorescência direta: núcleo em azul e os componentes do 
citoesqueleto (microtúbulos) em verde.
HISTOQUÍMICA/CITOQUÍMICA
Fim!