Método de sanger

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MÉTODO DE SANGER
Julia Casteletti Ramiro RA:729.746
Para seqüenciar DNA pelo método de Sanger, o DNA deve primeiro ser obtido em forma de cadeia simples.
 Uma mistura contendo a fita simples de DNA, DNA polimerase, os 4 desoxirribonucleosídeos ( A,T,C,G) e um curto e único primer é preparada.
O primer contém uma sequência de nucleotídeo que é complementar ao final da região 3’ a ser copiada e é requerido para que o DNA polimerase possa iniciar a replicação do DNA.
Quantidades iguais dessa mistura de reação são colocadas em 4 tubos e um didesoxirribonucleosídeo é adicionado a cada tubo.
Quando um desoxirribonucleosídeo é inserido na cadeia de crescimento, a replicação continua. 
No entanto, quando um didesoxirribonucleosídeo é inserido, a síntese é terminada. 
Os produtos da reação em tubos são transferidos para 4 faixas de eletroforese gel e os oligonucleotídeos são separados por tamanho e por tipo de nucleotídeo.
Os oligonucleotídeos mais curtos movem-se mais para baixo no gel. A leitura de baixo para cima e de uma base por vez providencia o sequenciamento correto do dna.
Resumindo: O método de Sanger é um procedimento tradicional de sequenciamento de DNA e consiste na adição de nucleotídeos modificados, chamados didesoxiribonucleotídeos, que impedem o crescimento de um fragmento de DNA em replicação pela DNA polimerase após sua adição. 
Pelo Método de Sanger, uma fita simples de DNA que será sequenciada, é hibridizada com um Primer de desoxinucleotídeos marcado na extremidade 5´(cinco linha). Quatro misturas de reação são preparadas onde os Primer's utilizados serão elongados por uma DNA polimerase. Cada mistura contém os quatro desoxinucleosídeos trifosfato normais mais um dos quatro didesoxinucleosídeos trifosfato em uma razão de aproximadamente 1/100. Uma vez que um didesoxinucleotídeo não tem oxidrila ou hidroxila na extremidade 3´, não é possível haver extensão a partir do nucleotídeo adicionado, parando a reação. Desta forma, cada mistura de reação produzirá cadeias prematuramente terminadas de acordo com toda ocorrência de um didesoxinucleotídeo adicionado. Cada mistura é então separada em um gel (poliacrilamida desnaturante) de sequenciamento por eletroforese para se detectar cada um dos nucleotídeos presentes na sequência de DNA lida
Fontes : McGraw-Hill Online / Wikipedia / Molecular Cell Biology – Baltimore, D.