Técnica de Coloração de Papanicolau para Espermograma WHO2010

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Técnica de Coloração de Papanicolaou para Espermograma 
(WHO, 2010) 
A técnica de coloração de Papanicolaou fornece uma boa coloração de 
espermatozoides e outras células. Essa coloração permite a observação de 
formas normais, defeitos de forma e tamanho da cabeça, defeitos da peça 
intermediária, defeitos de cauda e gotas citoplasmáticas, geralmente 
localizadas na região da peça intermediária e, ainda, é útil para visualização de 
células germinativas imaturas, como as espermátides, espermatócitos, 
espermatogônia, de células de Sertoli e de leucócitos. 
 
A técnica de coloração apresenta as seguintes fases: 
1. Hidratação; 
2. Coloração nuclear com Hematoxilina Harris; 
3. Desidratação; 
4. Coloração Citoplásmatica (Orange G e E50); 
5. Diafinização com Xilol (caso o meio de montagem usado for insolúvel em 
etanol); 
6. Montagem. 
 
*Esfregaços devem ser secos ao ar por pelo menos 4 horas, mas podem 
permanecer armazenados por uma semana, antes da sua fixação e coloração. 
� Fixação do esfregaço de sêmen seco ao ar 
1. Imersão da lâmina em etanol 95% por 15 minutos. 
� Coloração do esfregaço do sêmen 
1. Etanol 80% (30 segundos) 
2. Etanol 50% (30 segundos) 
3. Água destilada (30 segundos) 
4. Hematoxilina Harris (4 minutos) 
5. Água destilada (30 segundos) 
6. Etanol Acidificado – 1mL de HCl + 200mL de álcool etílico 70% v/v (4-8 
mergulhos) 
7. Água corrente (5 minutos) 
8. Etanol 50% (30 segundos) 
9. Etanol 80% (30 segundos) 
10. Etanol 95% (pelo menos 15 minutos) 
11. Orange G (1 minuto) 
12. Etanol 95% (30 segundos) 
13. Etanol 95% (30 segundos) 
14. Etanol 95% (30 segundos) 
15. EA 50 (1 minuto) 
16. Etanol 95% (30 segundos) 
17. Etanol 95% (30 segundos) 
18. Etanol 100% (30 segundos) 
19. Etanol 100% (30 segundos) 
Existem dois tipos de preparo da montagem da lâmina após a coloração, 
isso dependerá se o fluido para montagem é solúvel ou não em etanol. 
• Se solúvel em etanol, montagem dos esfregaços acontecerá diretamente 
após a passagem em etanol 100%, (passo 19), ainda úmidos; 
• Se insolúveis, levar as lâminas diretamente após o passo 19 para os 
seguintes passos: 
20. Xilol: etanol (1:1) por 1 minuto; 
21. Xilol 100% por 1 minuto. 
Remova uma lâmina de cada vez do recipiente com xilol e permita que ele 
escorra por cerca 1-2 segundos, para que as lâminas permaneçam molhadas 
com xilol durante a montagem. Durante a coloração o xilol não pode sofrer 
hidratação. Caso isso ocorra o xilol hidratado deve ser desprezado e 
substituído por outro. 
 
 
� Montagem das lâminas após a coloração 
1. Adicionar duas ou três gotas pequenas de meio de montagem, sob o 
esfregaço; 
2. Coloque uma lamínula mais adequada sob a lâmina que contém o 
esfregaço; 
3. Posicione a lamínula de modo que o contato com o meio de montagem 
comece de um lado seguindo para o outro, evitando que bolhas de ar fiquem 
aprisionadas entre lâmina-lâminula; 
4. Se necessário pressione suavemente em cima da lamínula para ajudar a 
mover as bolhas até a borda da lâmina do esfregaço; 
5. Limpe o excesso de xilol (se usado) presente abaixo da lâmina; 
6. Permita que o esfregaço montado seque horizontalmente em um cavalete de 
esfregaço ou em papel absorvente por 24 horas.