Genética Bacteriana

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Genética Bacteriana
o genoma bacteriano consiste no conjunto total de gen~s
transportados pelas bactérias quer em seu cromossomo ou
em seus elementos genéticos extracromossômicos, uan-
do presentes. O cromos somo bacteriano difere do cromos-
somo humano em vários aspectos. O cromos somo de uma
bactéria típica como aEscherichia caliconsiste em uma única
molécula de DNA circular, de filamrnto duplo, ~ontendo
aproximadamente 5 milhões de pares de bases (ou 5.000
quilobase pares [kb]) medindo aproximadamente 1,3 mm
(isto é, cerca de 1.000 vezes o diâmetro da célula). Os me-
nores cromos somos bacterianos (encontrados nos mico-
plasmas) possuem cerca de um quarto desse tamanho. Em
comparação, os seres humanos apresentam duas cópias de
23 cromossomos, que representam 2,9 X 109 pares de ba-
ses com 990 mm de comprimento. Cada genoma contém
muitos o érons, ue são constituídos or enes. Os eu-
cariontes geralmente apresentam uas cópias distintas de
cada cromos somo (eles são, por conseguinte, diplóides).
As bactérias apresentam somente uma cópia de seus cro-
mossomos elas são ha lóides). Considerando que as bac-
térias ossuem apenas um único cromossomo, a a teraçao
do ene (mutação) Irá exercer um efeito mais óbvio sobre
a cél a. ém isso, a estrutura do cromossomo bacteriano
é mantidã referentemente por oliaminas, como a es er-
mina e a es ermidina, o ue or histonas.
s actérias tam em contêm e ementos enéticos
extracromossômicos como os plasmídios ou bacterió-
faB:Js (vírus bacterianos). Esses elementos são independen-
tes o cromossomo bacteriano e, em muitos casos, podem
ser transmitidos de uma célula para outra.
Os genes são seqüências de nucleotídios com determi-
nada função biológica; como exemplos temos os genes das
proteínas estruturais (cístrons, que são genes codificado-
res), genes do RNA ribossomal e sítios de reconhecimento
e ligação para outras moléculas (promotores e operadores).
Os promotores e operadores são seqüências de nucleotí-
dios que controlam a expressão de um determinado ~e
ao influencIar as sequencIas a serem transcntas emA
mensageiro (RNAm) (ver discussão mais adiante).
Os opérons são grupos de um ou mais genes estrutu-
rais ex ressos a artir de um determinado romotor ue
izam em um elemento ara o término da transcri ão.
Por conseguinte, todos os genes que codificam as enzimas
de uma determinadil via podem ser coordenadamente re-
gulados. Os opérons com muitos genes estruturais são
policistrônicos. O opéron lac da E. cali inclui todos os
genes necessários para o metabolismo da lactose, assim
como os mecanismos de controle para desativar (na pre-
. sença de glicose) ou ativar (na presença de galactose ou
de indutor) esses genes somente quando necessários. O
opéron lac inclui uma seqüência repressora, uma seqüên-
cia promotora e genes estruturais para a enzima 13-
galactosidase, uma permease, e uma acetilase (Fig. 5.1). O
opéron lac será discutido posteriormente neste capítulo.
Repressor Beta-galactosidase Permease Aeetilase
A0tl~1 z I~
RNAm I I ~Repressor
B o_, _l~--z--I~
Nenhum RNAm lae
RNAm.~
~ c
~~~~essor ~
Repressor
C [!:]I l~ _
RNAm t ~ RNAm1
Repressor ~ T
Indutor d ~9'
alolactose Repressor
t matlvoTransgalaetosldação
Lactose W T 111 ...••1--_'\-- ATP
CAP AMPe Adenilato
Repressor ciclase
D [~].J;":·J~====z====~
RNAm ~ RNAm I I I ~
R,p"=' ~ + ~tc7o.~:~
J
000 ~ ~
>-- ....•~~~ 00 O O ~Q)O
~ 000 e
IndutorO Repressor o oW inativo
CAP TAMPe ..•••••I--A-d-e~~-i1a-to-ATP
Repressor eiclase[~]··...·.·.·!>j~====Z===~
RNAm ~- t Nenhum RNAm lae
Repressor ~ ~
ativo _
z I~'
~
~ ~ ~
000 @G Eil
00
nos cromossomos filhos, cada um com seu par de forquilhas de
crescimento para a síntese de novo DNA. A polimerase deslo-
ca-se ao longo do filamento do DNA, incorporando o nucleo-
tídio apropriado (complementar) em cada posição. Areplicação
se completa quando as duas forquilhas de replicação fazem um
ângulo de 180 graus a partir da origem. O 'processo de replicação
do DNA exerce uma forte tensão de torcão sobre Q UNe cir-
~ular cromossomial; essa tensão é aliviada elas to oisomera-
~ por exemp o, girase).1 topoisomerase é essencial para as
,bactérias, constituindo o aJvo dos antibióticos quinolônicos:.
z:::t:::::;::±: ---
Regulação da Expressão Gênica
As bactérias desenvolveram mecanismos para se adaptar rá-
pida e eficientemente às mudanças de concentração de nutri-
entes em seu ambiente. Quando necessário, as bactérias ati-
vam um conjunto completo de enzimas e evitam sintetizar a
Fig. 5.1A, O opéron da lactose é transcrito como RNAmensa-
geiro (RNAm) policistrônico a partir de um promotor (P) e tra-
duzido em três proteínas: ~-galactosidase (Z), permease (Y) e
acetilase (A). O gene lac 1 codifica a proteína repressora. B, O
opéron da lactose não é transcrito na ausência de um indutor
alolactose, uma vez que o repressor compete com a RNA poli-
merase no sítio operador (O). C, O repressor, complexado com
o indutor, não reconhece o operador devido a uma alteração de
conformação no repressor. O opéron lac é então transcrito em
um nível baixo. D, Escherichia coli crescendo em meio de cultura
pobre, na presença de lactose como fonte de carbono. Tanto o
indutor quanto o complexo CAP-AMPc estão ligados ao pro-
motor, que está totalmente "ativado", e verifica-se um alto nível
de transcrição e tradução do RNAm lac. E, O crescimento de E.
coli em meio de cultura pobre sem lactose resulta na ligação do
complexo CAP-AMPc à região promotora e na ligação do
repressor ativo à seqüência do operador, uma vez que não há
qualquer indutor disponível. O resultado será a ausência de trans-
crição do opéron lac. CAP = proteína ativadora do gene
catabólito; AMPc = adenosina monofosfato cíclico;ATP = ade-
nosina trifosfato.
~nzima ou enzimas de determinada via quando o substrato está
ausente.
~ primeiro lugar, a organização dos genes de uma via
bioquímica em um opéron, com mecanismos de controle
g,enético apropriados, permite a produção coordenada das
t;,nzimas necessárias em resposta a um estímulo nutricional.
:gm segundo lugar, a transcrição do gene é regulada direta-
mente pelas proteínas repressoras (que se ligam aos operado-
resfem resposta a sinais nutricionais no interior da célula ...Em
terceiro lugar. a velocidade de síntese de proteína pelo ribos-
somo pode regular a transcricãg QQ§ rrg,carionJ:,es. A ausência
Qe uma membrana nuclear nos procariontes para separar os
Q.ois processos permite ao ribossomo se ligar ao RNAm à
medida que ele está sendo transcrito a partir do DNA.*
Regulação Transcricional
O início da transcrição pode estar sob controle positivo ou
negativo. Os genes sob controle negativo são expressos"a
Múltiplas Forquilhas de Crescimento
{!)
_;Filamento seguidor
~5'
11'
Filamento líder
Fig. 5.2 Admitindo-se um tempo de 40 minutos para completar um
ciclo de replicação e considerando-se um novo início a cada 20 mi-
nutos, o início da síntese do DNA precede a divisão celular. Múlti-
plas forquilhas de crescimento podem ser iniciadas na célula antes
da completa formação do septo e divisão celular. As células filhas
"nascem grávidas".
um aumento na freqüência de iniciação da transcrição. O com-
plexo CAP-AMPc pode aumentar a transcrição do opéron
através da interação proteína-proteína com a RNA polime-
rase ou através de uma interação proteína-DNA.
O o éron tri tofano (o éron contém os enes estru-
mrais necessários à iossíntese o triptofano e possui meça-
nismos de controle duplos transcricionais (Fig. 5.3). Embora
o triptofano seja essencial para a síntese de proteínas, um ex-
cesso de triptofano na célula pode ser tóxico; conseqüente-
mente, ~ua síntese deve ser regulada. No nível de DNA, a
roteína re ressora é ativada or um aumento da concentra-
~o intracelular do triptofano,.Jlara impedir a transcrição:l:i9
nível de síntese de roteína, a rá ida traduão de um" e tí-
qio teste' no início do RNAm, na presença de triptofano,
promove a formação de uma alça de filamento duplo no RNA,
Que finaliza o processo de transcricão. A mesma alça é forma-
da se não houver nenhuma síntese de proteína, uma situação
em que não há necessidade de síntese de triptofano. Esse
mecanismo re Ia a síntese do tri tofano no nível de RNAm
em um processo enominado atenuação, no gual a síntese do
RNAm é prematuramente finalizada.
Regulação Pós-transcricional ou Pós-tradução
A velocidade e a eficiência da síntese de proteínas podem ser
controladas por outros fatores. Estes podem incluir a estru-
tura do RNAm ou as concentrações do RNA transportador
(RNAt) e de aminoácidos na célula. Com o RNAm policis-
trônico, o controle da tradução pode resultar em diferenças
na quantidade de cada proteína expressa a partir de cada gene.
Por exemplo, para o opéron lac, a l3-galactosidase, a galacto-
sídio permease e a acetilase são produzidas à razão de 10:5 :2.
O DNA transmite a informação genética; conseqüentemen-
te, as células devem ser capazes de replicar o DNA com pre-
cisão. Além disso, lesões adicionais ao DNA devem ser
minimizadas através da elabora ão de eficientes sistemas de
reparo do DNA. fuses sistemas de contenção de esão são tão
importantes para a vida de uma célula que uma bactéria deve
edicar uma rande uantidade de seu enoma ara especifi-
c-ª!:e controlar as enzimas envo vi as nesse sistema.
Mutações que Afetam o DNA
Uma mutação se refere a qualql}er mudança na seqüência de
bases do DNA. A alteração de uma única base pode resultar
em uma transição, na qual uma purina é substituída por ou-
tra urina ou na ual uma irimidina é substituída or outra
eirimidina. Po e também ocorrer uma transversão, niLqual,
por'exemplo, uma purina é substituída por uma pirimidina e
yice-versa. Uma mutação silenciosa é uma alteração no ní-
vel de DNA que não resulta em qualquer mudança de ami-
noácido na proteína codificada. Esse tipo de mutação ocorre
porque mais de um códon pode codificar um aminoácido.
Uma mutàção de sentido equívoco resulta na inserção de
um aminoácido diferente na proteína, mas essa pode ser ~a
muta ão conservativa se o novo aminoácido a resenta ro-
12..riedadessemelhantes (por exemp o, va ina substituindo a
Fosforribosil
ontroniloto
isomerose/indol
3-glicerol-fosfato
sintetase
Triptofono
sintetase
alfa
Fosforribosil
antronilato
tronsferase
Triptofano
sintetase
beta
Repressor
~--
CQ--~ __D_~C_~
RNAm Nenhum RNAm trp
! Repressor 1
~inativo
r · 8. Repressor
. ativo
OCo-repressor(triptofano)
1-0:------
ATG Peptídia TGA.---.--.--b líder d-.
L::EW W__ 2_~~~ __ E_~
BBaixa
concentração
de Trp
A Alta
concentração
de Trp
VJ...AAJJJJ
Nenhum RNAm
trp policistrônico
RNAm
trp policistrônico
C Ausência
de síntese
de proteína
Nenhum RNAm
VJ...AAJJJJ trp policistrônico
alanina). Fina mente uma muta ão sem sen .do modifica o
,çódon gue codifica um aminoácido em um có on je
terminalização (por exemplo, TAG [timidina-adenina-guani-
na]), &zendo com que o ribossolllQ se desprenda do RNAm e
Ill\ralise prematuramente a síntese da proteína.
Podem ocorrer alterações mais drásticas nas proteínas
quando estão envolvidas várias bases. Por exemplo, uma pe-
quena depleção ou inserção que não é em múltiplos de três pro-
duz uma mutação por deslocamento do quadro de leitu-
ra. Em conseqüência, ocorre uma alteração na estrutura de
leitura, resultando geralmente em um peptídio sem sentido e
Fig. 5.3 Regulação do opéron do triptofano (trp). A, O opéron trp
codifica as cinco enzimas necessárias para a biossíntese do triptofano.
Esse opéron trp se encontra sob duplo controle. B, A conformação
da proteína repressora inativa é alterada após a sua ligação pelo
triptofano co-repressor. O repressor ativo (R) resultante se liga ao
operador (O), bloqueando qualquer transcrição do RNAm do trp pela
RNA polimerase. C, O opéron trp também está sob o controle de
um mecanismo de atenuação-antiterminação. Acima dos genes es-
truturais estão o promotor (P), o operador e um líder (L), que pode
ser transcrito em um pequeno peptídio contendo dois triptofanos (IV)
próximo à extremidade distal. O RNAm líder possui quatro repeti-
ções (1, 2,3 e 4) que podem formar pares diferentes de acordo com
a disponibilidade do triptofano, resultando em terminação precoce
da transcrição do opéron trp ou em sua transcrição completa. Na
presença de alta concentração de triptofano, as regiões 3 e 4 do
RNAm líder podem formar pares, originando um grampo de termi-
nação, não ocorrendo nenhuma transcrição do opéron trp. Entre-
tanto, na presença de pouco ou nenhum triptofano, os ribossomos
permanecem na região 1 durante a tradução do peptídio líder, devi-
do à seqüência dos códons do triptofano. Em seguida, as regiões 2 e
3 podem parear, formando o grampo de antiterminação e levando à
transcrição dos genes trp. Finalmente, as regiões 1:2 e 3:4 do RNAm
líder podem parear, acarretando também a paralisação da transcri-
ção antes do primeiro gene estrutural trpE. A= adenina; G = gua-
nina; T = timina.
em truncamento prematuro da proteína. As mutações nu-
las, que destroem completamente a função gênica, surgem
uando ocorrem extensa inser ão deleção ou rearran'o pro-
nunciado na estrutura do cromossomo. A inserção de longas
seqüências e N muitos milhares de pares de bases) por.
recombinação, transposição ou durante a engenharia genéti-
ca pode produzir mutações nulas ao separar as partes de um
gene, inativando-o.
Muitas mutações ocorrem espontaneamente na natureza
(por exemplo, por erros da polimerase); entretanto, as muta-
ções podem também ser induzi das por agentes físicos ou
químicos. Entre os agentes físicos utilizados para induzir mu-
tações em bactérias temos o calor, que resulta na desamina-
ção dos nucleotídios; a luz ultravioleta, que induz a formação
de dímeros de pirimidina; e a radiação ionizante, como os raios
X, que originam radicais hidroxila muito reativos que podem
ser responsáveis pela abertura de um anel de uma base ou por
quebras de filamentos simples ou duplos no DNA.
Os agentes químicos mutagênicos podem ser agrupados em
três classes. A primeira classe é constituída pelos análogos de
bases nucleotídicas; eles são incorporados ao DNA durante
a replicação e acarretam pareamento equívoco e freqüentes
erros durante a replicação do DNA. A semelhança entre 05-
bromouracil e a timidina permite a sua incorporação ao DNA.
Entretanto, um rearranjo estrutural da molécula permite a
ligação do 5-bromouracil à guanina em vez da adenina, alte-
rando o par de bases T-A para G-c.
A segunda classe é constituída por moléculas planas poli-
cíclicas, como o brometo de etídio ou os derivados da acridina;
constituem exemplos de substâncias que induzem mutação por
deslocamento do quadro de leitura. Inserem-se (ou inter-
calam-se) entre as bases à medida que elas se empilham na
dupla hélice, causando a adição ou a deleção de uma única ba-
se. Esses agentes de intercalação aumentam o espaçamento
entre sucessivos pares de bases destruindo o esqueleto regu-
lar de açúcar-fosfato e diminuindo o espaço entre as voltas da
hélice. Essas alterações levam a erros freqüentes durante a
replicação do DNA.
A terceira classe é constituída por substâncias químicas
capazes de reagir com o DNA; elas atuam diretamente so-
bre o DNA, resultando na modificação da base normal em
outra estrutura quimicamente diferente. As bases modifica-
das podem fazer pareamentos anormais ou não fazer qualquer
pareamento. O dano pode causar a remoção da base do arca-
bouço do DNA. Essa classe inclui o ácido nitroso (HNO) e
agentes alquilantes, como a nitroso guanidina e o sulfonato
de etilmetano que são conhecidos por adicionarem grupos
meti! ou etil aos anéis das bases do DNA.
5',llllllli3' •• 5"1'1 iiii3'
3" I , I , , , , I 5' A base lesada éreconhecida 3" I , I I , , , '5'
A base lesada é reconheci- pelo glicosilase, que diva a li· Uma endonudease AP rec~
da pela endonuclease, que gação entre o açúcar do nhece o sítio AP e c1iva o
c1ivao arcabouço fosfodiés- nucleotídio e o arcabouço fos- arcabouço fosfodiéster pró-
ter em ambos os lodos fodiéster ximo ao local da base au·
da lesão sente
(l t .l
5'T0 : , : : : T~ • 5';-r-r-r--' -,--,3'
3'------5 Provavelmenteocorreumaou_3' ' . , " , 5'
As exonucleases transportam Ira fenda no outro lado do sí- B
o fragmento do DNA que foi tio AP
cortado e que apresentava a
base lesadol
5'T'"TõOH T 3'
3" , , , !, I '5' A
A DNA palimerase I preen-
che o lacuna da 3'OH livre
A DNA ligose sela a fendo
entre o fragmento recém-sin-
tetizado e o Fjlomento origi-
nal do DNA
5' T""T""T"!T,- r'"r 3'
Fig. 5.4 A, Mecanismos de reparo por excisão generalizada. B,Me-
canismo de reparo por excisão especializada. AP = apurínica (endo-
nuclease).
Inúmeras bactérias, especialmente muitas espécies bacteria-
nas patogênicas, são promíscuas com o seu DNA. A troca de
DNA entre células permite o intercâmbio de genes e carac-
terísticas entre essas células, produzindo assim novas cepas
bacterianas. Essa troca pode ser vantajosa para o receptor,
especialmente se o DNA alterado codifica resistência a anti-
bióticos. O DNA transferido pode ser integrado no cromos-
soma do receptor ou mantido de modo estável como elemen-
to extracromossômico (plasmídio) ou em um vírus bacteria-
no (bacteriófago) e transferido para as bactérias filhas como
unidade de replicação autônoma.
Os plasmídios são pequenos elementos genéticos que se
replicam independentemente do cromos soma bacteriano. Os
plasmídios são, em sua maioria, moléculas de DNA de fila-
mento duplo, circulares, que variam de 1.500 a 400.000 pa-
res de bases. Entretanto, a Borrelia burgdorferi, o agente eti-
ológico da doença de Lyrne, e a Borrelia hermsii, são singula-
res entre todas as eubactérias, uma vez que possuem plasmí-
dios lineares. De maneira semelhante ao DNA cromossômi-
co bacteriano, têm a capacidade de replicação autônoma e,
em conseqüência, são considerados réplicons. Alguns plas-
mídios, como o plasmídio F de Escherichia coli,são epissomas,
o que significa que eles podem se integrar ao cromossoma
do hospedeiro.
Os plasmídios transportam informação genética, que pode
não ser essencial mas pode fornecer uma vantagem seletiva à
bactéria. Por exemplo, os plasmídios podem conferir altos
níveis de resistência antibiótica, podem codificar a produção
de bacteriocinas ou toxinas e podem conter genes capazes de
conferir uma vantagem peculiar no metabolismo de alguns
Vetor
pBR322
(4.363 pb)
1 início
14
20
26
37
~
51
55
62
73
75
82
94
103
112
126
Fig. 5.5 Plasmídios. O plasmídio pBR322 é um dos plasmídios uti-
lizados para a donagem do DNA. Esse plasmídio codifica resistên-
cia à ampicilina (Amp) e à tetraciclina (Tet) e uma origem de repli-
cação (ori). O sítio de donagem múltipla no plasmídio pGEM for-
nece diferentes pontos de divagem de enzimas de restrição para a
inserção de DNA dentro do gene da l3-galactosidase (lacZ). Ele é
flanqueado por promotores de bacteriófagos para permitir a expres-
são direcional do RNA mensageiro da seqüência donada.
substratos (Fig. 5.5). O número de cópias de plasmídio pro-
duzido pela célula é determinado pelo plasmídio particular.
O número de cópias é a relação entre as cópias do plasmídio
e o número de cópias do cromossoma. Essa relação pode ser
tão pequena quanto 1, no caso dos grandes plasmídios, ou de
até 50, nos pequenos plasmídios.
Os grandes plasmídios (20 a 120 kb), como o fator de fer-
tilidade F encontrado em E. cali,ou o fator de transferência de
resistência (80 kb), podem, com freqüência, mediar sua própria
transferência de uma célula para outra por um processo deno-
minado conjugação (ver adiante seção sobre conjugação). Es-
ses plasmídios conjugativos codificam todos os fatores neces-
sários para a sua transferência. Outros plasmídios podem ser
transferidos para uma célula bacteriana por um mecanismo
diferente da conjugação, como a transformação ou transdução.
Esses termos serão discutidos posteriormente neste capítulo.
Os bacteriófagos são vírus bacterianos. Esses elementos
genéticos extracromossômicos podem sobreviver fora de uma
célula hospedeira uma vez que o genoma de ácido nucléico
(que pode ser DNA ou RNA) é protegido por uma capa de
proteína (Fig. 5.6).
Os bacteriófagos infectam as células bacterianas e ou se
replicam em grandes números causando a lise celular (infec-
ção lírica) ou, em alguns casos, integram-se ao genoma do
hospedeiro sem causar a sua morte (estado lisogênico), como
o bacteriófago À de E. cali (Fig. 5.7). Alguns bacteriófagos
lisogênicos transportam genes de toxinas (por exemplo, o
corinefago 13transporta o gene da toxina diftérica). O bacte-
riófago À permanece lisogênico enquanto houver síntese de
uma proteína repressora que impede a desintegração do fago
e sua replicação independentemente do cromossoma do hos-
pedeiro. Essa reação pode ser deflagrada se o DNA da célula
hospedeira sofrer lesão por irradiação ou por qualquer outro
mecanismo ou se a célula não puder mais produzir a proteína
repressora, um sinal de que a célula hospedeira não está mais
saudável e não constitui mais um local adequado para "carre-
gamento livre".
Os transposons são elementos genéticos móveis (Fig. 5.8)
que podem passar de uma posição para outra no genoma ou
entre diferentes moléculas de DNA. Os transposons mais sim-
ples são denominados seqüências de inserção. Os transposons
complexos transportam outros genes, como os genes que con-
ferem resistência aos antibióticos. Algumas vezes os transpo-
sons se inserem nos genes, inativando-os. Se a inserção e a
inativação ocorrerem em um gene que codifica uma proteína
essencial, a célula morrerá.
Algumas bactérias patogênicas utilizam um mecanismo
semelhante para coordenar a expressão de um sistema de fa-
tores de virulência. Os genes para a atividade podem ser agru-
pados em uma ilha de virulência ou de patogenicidade, que
é circundada por elementos móveis semelhantes aos transpo-
sons, o que permite aos genes se moverem dentro dos cro-
mossomas e para outra bactéria. A unidade genética total pode
ser desencadeada por um estímulo ambiental (por exemplo,
pH, calor, contato com a superfície da célula hospedeira) como
meio de coordenar a expressão de um processo complexo. Por
exemplo, a ilha SPI-l de Salmanella codifica 25 genes que
permitem à bactéria penetrar em células não-fagocíticas.
A troca de material genético entre células bacterianas pode
ocorrer por um de três mecanismos: (1) conjugação, que é o .
acasalamento ou troca quase sexual de informação genética
de uma bactéria (o doador) para outra bactéria (o receptor);
(2) transformação, que resulta na aquisição de novos marca-
dores genéticos por incorporação de DNA estranho ou exó-
geno; ou (3) transdução, que é a transferência de informa-
ção genética de uma bactéria para outra através de um bacte-
riófago. A conjugação ocorre na maioria das eubactérias, se-
não em todas. Em geral, a conjugação ocorre entre membros
C~J
(~)
(~)
(~)
(~)
Fig. 5.7 Infecção lisogênica de bactéria por bacteriófago tempera-
do.A, O fago infecta uma bactéria sensível, e o DNA do fago é inje-
tado. B,O DNA do fago torna-se integrado no cromossoma bacte-
riano. C, A bactéria se multiplica, aparentemente não-afetada pela
infecção. Ela foi lisogenizada. D, Ocasionalmente o DNA do fago
sofre excisão do cromossoma bacteriano, adquire o controle da cé-
lula e se replica. E, Uma célula individual (ou, por indução, todas as
células) produz componentes do fago. F, Os componentes são pos-
teriormente organizados em partículas de fagos. G, Finalmente, a
célula sofre lise e libera partículas maduras de fagos.
de uma mesma espécie, mas foitambém demonstrada a sua
ocorrência entre procariontes e células vegetais, animais e
fungos.
A transformação é o processo pelo qual as bactérias cap-
tam fragmentos de DNA desnudo e o incorporam em seus
genomas. A transformação foi o primeiro mecanismo de trans-
ferência genética descoberto em bactérias. Em 1928, Griffith
observou que a virulência dos pneumococos estava relacionada
com a presença de uma cápsula polissacarídica que circunda-
va a célula e que extratos de células portadoras de cápsulas
produziam colônias lisas que podiam transferir essa caracte-
____________ 1 FÉÓC'B'Á
____ ~ ~Beta-Iactamase~
t-- ·
Sítio
res
DNAde
E. col;
~2.icab
Segmento G DNA de
passível E. col;
de inversão ~
~~~+ +
~enes para a cabeça e a
uda
Repetição
invertida da
esquerda
Repetição
invertida do
direita
Fig. 5.8 Transposons. A, As seqüências de inserção codificam ape-
nas uma transposase (tnp) e possuem repetições invertidas (15 a 40
pares de bases) em cada extremidade. B,Os transposons compostos
contêm uma região central que codifica a resistência aos antibióti-
cos, ou toxinas, flanqueadas por duas seqüências de inserção (1S),que
podem ser diretamente repetidas ou invertidas. C, Tn3, um mem-
bro da família do transposon TnA. A região central codifica três genes
- uma transposase (mpA), uma resolvase (mpR) e uma l3-lactamase
- conferindo resistência à ampicilina. Um sítio de resolução (sítio
Res) é utilizado durante o processo replicativo de transposição. Essa
região central é flanqueada, em ambas as extremidades, por trechos
repetidos diretos de 38 pares de bases. D, O transposon associado
ao fago é exemplificado por um bacteriófago p.
rística para bactérias não-capsuladas, geralmente aparecendo
com bordas rugosas. Os estudos de Griffith levaram Avery,
MacLeod e McCarty a identificar o DNA como o princípio
transformador, cerca de 15 anos mais tarde.
As bactérias gram-positivas e gram-negativas são capazes
de capturar e manter o DNA exógeno de maneira estável (Fig.
5.9). Certas espécies são naturalmente capazes de capturar
DNA exógeno (essas espécies são denominadas competen-
tes), e incluem Haemophilus influ-enzae, Streptococcus pneumo-
niae, espécies de Bacillus e espécies de Neisseria. A competên-
cia se desenvolve no final da fase do crescimento logarítmico,
algumas vezes antes de uma população entrar na fase estaci-
onária. A maioria das bactérias não exibe uma capacidade na-
tural de captação de DNA. São utilizados métodos químicos
ou de eletroporação (uso de pulsos de alta voltagem) para in-
duzir a entrada de plasmídios e outros DNA em E. coli e ou-
tras bactérias.
Conjugação
A transferência genética em E. coli foi descrita pela primeira
vez por Lederberg e Taturn em 1946, quando eles observa-
cromossoma~
bactenano . ~~.
-----
• Captação
+de DNA
~)
Integração por ,
recombinação .J[ID0U "" Degradação
Transformação com plasmídio
Plasmídio de DNA O O
(~:~~:o
• Captação
+do plasmídio
~
Fig. 5.9 Transformação bacteriana. O DNA estranho pode ser cap-
tado ou forçado a penetrar em bactérias e a se incorporar em seu
genoma ou se manter como um plasmídio. Esse processo "transfor-
ma" a bactéria em um novo microrganismo.
ram troca semelhante a uma troca sexual entre duas cepas
mutantes de E. coliK12. A conjugação é o processo pelo qual
o DNA é transferido diretamente por contato entre duas cé-
lulas, durante o acasalamento das bactérias. A conjugação re-
sulta na transferência unidirecional do DNA de uma célula
doadora (ou macho) para uma célula receptora (ou fêmea)
através do pilus sexual. O tipo de união (sexo) da célula de-
pende da presença (masculino) ou ausência (feminino) de um
plasmídio conjugativo, como o plasmídio F de E. coli. O
plasmídio F é definido como conjugativo porque ele transpor-
ta todos os genes necessários para a sua própria transferên-
cia, incluindo a capacidade de produzir os pili sexuais e inici-
ar a síntese do DNA na origem de transferência (OriT) do
plasmídio. Além de E. coli, a transferência ocorre em bacte-
róides, estreptococos, streptomyces e clostrídios. Muitos dos
grandes plasmídios de conjugação especificam colicinas ou
resistência a antibióticos.
O plasmídio F se auto transfere convertendo as células re-
ceptaras em células masculinas F+ (Fig. 5.10). Se um fragmen-
to do DNA cromossâmico for incorporado ao plasmídio, ele
passa a ser designado plasmídio F primo (F'). Quando ele se
transfere em uma célula receptora, transporta esse fragmen-
to consigo e também a converte em células masculina F'. Se
a seqüência do plasmídio F for integrada ao cromossoma bac-
teriano, a célula é denominada célula Hfr. Hfr significa alta
freqüência de combinação (high frequency of recombination).
O DNA transferido por conjugação não é constituído por
uma dupla hélice, mas por uma molécula de filamento sim-
ples. A mobilização se inicia quando uma proteína codificada
pelo plasmídio efetua uma clivagem sítio-específica de fila-
As células entram em contato, e
o processo de conjugação se
inicia
Fenda no filamento único em
OriT e ligação de proteína na
extremidade 5', iniciando a
replicação em circulo
o DNA de filamento único é
transferido, e ocorre síntese do
filamento complementar
As células se separam
no final da transferência
mento único na OriT. A "marca" inicia a replicação do círcu-
lo, e o filamento linear deslocado é direcionado para a célula
receptora. O DNA de filamento único transferido adquire
uma nova estrutura circular e seu filamento complementar é
sintetizado.
Uma importante propriedade do plasmídio F é a sua capa-
cidade de integração ao cromossoma bacteriano, gerando uma
célula Hfr. Essa integraçao do plasmídio F envolve a quebra
e a religação de ambas as moléculas de DNA. Nas células Hfr,
os genes envolvidos na mobilização e transferência ainda são
expressos. Assim, a conjugação pode ainda ser iniciada por uma
marca no sítio OriT no cromossoma para transferir uma par-
te da seqüência do plasmídio seguida por DNA cromossômi-
co e, às vezes, embora raramente, pelo restante do plasmídio
F na outra extremidade do cromossoma. Seriam necessários
100 minutos a 37°C para transferir o genoma masculino com-
pleto para o receptor feminino. Entretanto, a frágil conexão
entre os pares de bactérias é geralmente quebrada e a trans-
ferência interrompida antes de ser completada, o que explica
por que apenas as seqüências cromossômicas adjacentes ao F
integrado são habitualmente transferidas. Interrupções arti-
ficiais de um cruzamento entre um par Hfr e F- foram de
utilidade para a construção de um mapa coerente do DNA
cromossômico de E. cali.Nesses mapas, a posição de cada gene
é fomecida em minutos de acordo com o seu momento de
entrada em uma célula receptora em relação a uma origem fixa
(Fig.5.11).
Os plasmídios conjugativos R (resistência a antibiótico)
foram encontrados em bactérias gram-positivas como estrep-
tococos, streptamyces e clostrídios. Em vez de utilizar pili, o par
é mantido junto por uma molécula de adesina presente na
superfície da célula doadora.
PVrc
mli
J<yl
pisB
'\'~
.f~,~
O"
($O/>.
pvrO
pvrC
porB
Fig. 5.11 Mapa cromossômico dos genes de Escherichia coli.Os nú-
meros representam o tempo (em minutos) necessário para transfe-
rir segmentos de DNA da origem da primeira cepa Hfr. (Modifica-
do de Bachmann BJ, Low KB, Taylor AL: BaeteriolRev 40:116-167,
1976.)
Transdução
A transferência genética por transdução é mediada por vírus
bacterianos (bacteriófagos) (Fig. 5.12), os quais apanham frag-
mentos de DNA e os empacotam dentro de partículas do
bacteriófago. O DNA é liberado nas células infectadas e tor-
na-se incorporado ao genoma bacteriano. A transdução pode
ser classificada como especializada se os fagos em questão
transferem determinados genes (geralmente aqueles adjacen-
tes aos seus sítios de integraçãono genoma) ou generalizada
Infecção por fogo,
degradação do DNA
do hospedeiro
Replicoção
do fogo
Organização do DNA
viral e bacteriano
pelo fogo
Fogo de
transdução
A célula sofre lise, o fogo infectaoutra célula e libera O DNA dacélula doadora
Integração doI
DNA do doador.
se a seleção das seqüências for aleatória devido a reunião aci-
dental do DNA do hospedeiro no capsídio do fago.
As partículas de transdução generalizada devem conter
principalmente DNA bacteriano e pouco ou nenhum DNA
do fago. Por exemplo, o fago Pl de E. coli codifica uma
nuclease que degrada o DNA cromossômico do hospedeiro
E. coli. Uma pequena percentagem das partículas resultantes
do fago acondiciona os fragmentos de DNA em seus capsídios.
O DNA encapsulado, em lugar do DNA do fago, é injetado
em uma nova célula hospedeira, onde pode se recombinar com
o DNA homólogo do hospedeiro. As partículas transdutoras
generalizadas são importantes no mapeamento genético dos
cromossomas bacterianos. Quanto mais próximos dois genes
estiverem no cromossoma bacteriano, maior a probabilidade
de co-transdução.
Transposons Conjugativos
Os transposons podem transferir DNA no interior de uma
célula de uma posição para outra no genoma ou do DNA cro-
mossômico para um plasmídio ou vice-versa. Os transposons
encontrados em bactérias podem ser divididos em três clas-
ses: seqüência de inserção, transposons cófiíPÍexos e transpo-
sons fago-associados. Os elementos de seqüência de inser-
ção são os transposons mais simples; variam em comprimen-
to de 150 a 1.500 pares de bases e possuem repetições inver-
tidas de 15 a 40 pares de bases em suas extremidades (ver Fig.
5.8). As seqüências de inserção transportam apenas a infor-
mação genética necessária para a sua própria transferência (isto
é, o gene que codifica a transposase). As seqüências de inser-
ção podem ser detectadas quando se inserem em um gene e
interrompem ou inativam o gene ou liberam a expressão do
gene adjacente.
Recombinação
A incorporação do DNA em um cromossoma ocorre por re
combinação. Existem dois tipos de recombinação: homólog
e não-homóloga. A recombinação homóloga (legítima
ocorre entre seqüências de DNA estreitamente relacionada
e geralmente substitui uma seqüência por outra. O processl
requer um conjunto de enzimas produzidas (em E. colz) pelo
genes rec. A recombinação não-homóloga (ilegítima) ocorr
entre seqüências de DNA diferentes e, em geral, produz in
serções, deleções ou ambas. Esse processo, em geral, reque
enzimas especializadas de recombinação (algumas vezes sítio
específicas), como as produzidas por muitos transposons
bacteriófagos lisogênicos.
Engenharia Genética
A engenharia genética, também conhecida como tecnologi
do DNA recombinante, utiliza as técnicas e ferramentas d{
senvolvidas pelos geneticistas bacterianos para purificar, am
plificar, modificar e expressar seqüências gênicas específic
A utilização da engenharia genética e da "clonagem" revoh:
cionou a biologia e a medicina. As ferramentas básicas da er
genharia genética são (1) vetores de clonagem, que podeI
ser utilizados para liberar as seqüências de DNA nas bactér
as receptivas e amplificar a seqüência desejada; (2) enzim~
de restrição, que são utilizadas para clivar o DNA reprod~
tível em seqüências definidas (Quadro 5.1); e (3) DNA ligasl
a enzima que une o fragmento ao vetor de clonagem.
Os vetores de clonagem devem permitir a inserção d
DNA estranho, mas ainda devem ser capazes de se replic:
normalmente na bactéria hospedeira. Muitos tipos de vet<
res são utilizados. Os plasmídios vetores, como pue, pBR32:
Microrganismo Enzima Sítio de Reconhecimento
Acinetobaeter calcoaceticus AccI 5' GTI@ CB1AC
CA CD (X) TG
Bacillus amyloliquefaciens H BarnHI 5' GIGATC C
C CTAGIG
Escherichia coliRY13 EcoRI 5'GIAATTC
C TTAAIG
Haemophilus influenzae Rd HindIII 5'AIAGCT T
T TCGAIA
H. influenzae sorotipo c, 1160 HincII 5' G T (1) I (X) A C
C A (X) Ct) T G
Providencia stuartii 164 PstI 5' CiGCAIG
GACGTC
Serratia marcescens SmaI 5' C C C IGGG
GGG CCC
S~aphylococcusaureus 3A Sau3AI 5' IGA T C
CTAGI
Xanthomonas malvacearum XmaI 5' CICCGG G
G GGCCIC