ARTIGO FOSFODIESTERASE 5 -QUÍMICA FARMACÊUTICA

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ESTUDOS DE MODELAGEM MOLECULAR PARA PREVISÃO IN SILICO DE 
POTENCIAIS INIBIDORES DE FOSFODIESTERASE 5 HUMANA. 
Carol Anne Pereira Silva1 
1. Acadêmica do curso de Farmácia, Universidade Estadual de Feira de Santana, Feira de Santana, Bahia, 
Avenida Transnordestina, S/N, Novo Horizonte, Feira de Santana, Bahia, CEP 44.036-900, Brasil. 
 
Resumo 
 A Disfunção Erétil é a incapacidade de manter o pênis ereto para uma 
satisfatória relação sexual. A DE pode atingir os homens de qualquer idade, tornando-se 
mais frequente em homens com o avançar da idade.Fosfodiesterase (PDE) é uma super 
família de enzimas responsáveis pela degradação dos segundos mensageiros 
intracelulares adenosina monofosfato cíclico (AMPc) e guanosinamonofosfato cíclico 
(GMPc). Como reguladoras essenciais na sinalização de segundos mensageiros cíclicos 
com diversas funções fisiológicas as PDEs são alvo de drogas para o tratamento de 
diversas doenças. Dentre estas estão insuficiência cardíaca, depressão, asma, inflamação 
e disfunção erétil. Dentre as 11 famílias de genes de PDE, a fosfodiesterase5 (PDE5) é 
específica para GMPc, sendo responsável pela atividade de hidrólise que sofre o GMPc 
dentro dos tecidos dos corpos cavernosos penianos. A PDE5 é amplamente conhecida 
por ser alvo de diversas drogas utilizadas no tratamento da disfunção erétil, como por 
exemplo, o sildenafil (Viagra®). Este trabalho objetiva identificar moléculas com 
potencial inibitório frente a PDE5, construindo um banco de estruturas químicas 
selecionadas a partir de descritores químicos e realizar o acoplamento molecular com o 
banco de estruturas frente à fosfodiesterase5 humana e assim serem utilizados no 
tratamento da disfunção erétil. 
Palavras-chave: fosfodiesterase5, disfunção erétil, modelagem molecular. 
Abstract 
Erectiledysfunctionistheinabilitytomaintainanerectpenis for satisfactory sexual 
intercourse. ED canreachmenofany age, becoming more frequent in menwithadvancing 
age. Phosphodiesterase (PDE) is a superfamilyofenzymesresponsible for 
thedegradationofintracellularsecondmessengerscyclicadenosinemonophosphate (cAMP) 
andcyclicguanosinemonophosphate (cGMP). As 
thekeyregulatorysignalingmessengerscyclicsecondswithvariousphysiologicalfunctionsP
DEs are drugtarget for treatmentofvariousdiseases. Amongthese are heartfailure, 
depression, asthma, inflammationanderectiledysfunction. Amongthe 11 familiesof PDE 
gene, phosphodiesterase5 (PDE5) isspecifictocGMP, responsible for 
hydrolyzingactivitysufferingcGMPwithinthetissuesofthe corpora cavernosa penisofmen. 
PDE5 iswidelyknowntobethetargetofvariousdrugsused in 
thetreatmentoferectiledysfunctionsuch as sildenafil (Viagra). 
Thisstudyaimstoidentifymoleculeswithinhibitorypotentialagainst PDE5, building a 
databaseofchemicalstructuresselectedfromchemicaldescriptorsandperformthe molecular 
couplingwiththeseatfacingthestructuresphosphodiesterase5humanandthusbeusedtotreate
rectiledysfunction. 
Keywords: phosphodiesterase, erectiledysfunction, molecular modeling. 
 
Introdução 
 A disfunção erétil (DE) é a incapacidade recorrente de obter e manter uma 
ereção que permita atividade sexual satisfatóriasegundo definição proposta pelo 
NationalInstitutesof Health Consensus DevelopmentPanel, no ano de 1993. A DE não 
constitui uma doença, mas sim, uma manifestação sintomatológica de patologias 
isoladas ou associadas (MOURA; CERESÉR, 2002). Uma ereção normal depende do 
relaxamento do músculo liso do corpo cavernoso, do aumento do fluxo arterial peniano 
e da restrição do fluxo venoso de saída (GARRAFFA, et al, 2010).A DE é a mais 
comum disfunção sexual que acomete homens após os 40 anos (WYLLIE, 2004), 
estima-se que mais de 100 milhões de homens no mundo tenham algum grau de DE. O 
estudo de maior relevância epidemiológica sobre o assunto, devido a sua rigorosa 
metodologia, foi o Massachusetts Male AgingStudy (MMAS), entre 1987 e 1989 
(RIEDNER, 2010). Utilizou-se uma amostra aleatória de 1290 homens, de 40 a 70 anos, 
em 11 cidades randomizadas do estado de Massachusetts, EUA. Os resultados 
apontaram uma prevalência global deDEde 52%, sendo que 17% foram classificados 
como de grau leve, 25% de grau moderado e 10% de grau severo1. O trabalho também 
apontou um aumento da incidência de DE conforme o aumento da idade: 12,4 
casos/1000 homens aos 40 anos, 29,8 casos/1000 homens aos 50 anos de idade e 
46,4/1000 homens aos 60 anos (RIEDNER, 2010). Embora seja evidente o aumento dos 
casoscom a idade, a DE não é uma consequência inevitável do envelhecimento 
(SCHIAVINI, 2010). 
 A ereção é um fenômeno hemodinâmico, dependente do relaxamento do 
músculo liso cavernoso e das arteríolas do corpo cavernoso, levando a um aumento do 
fluxo sanguíneo para o espaço sinusoidal. O aumento do fluxo arterial distende o espaço 
lacunar dos sinusóides, comprimindo, passivamente, as vênulas entre os sinusóides e a 
túnica albugínea dos corpos cavernosos. A relativa ausência de distensão da túnica 
albugínea resulta na veno-oclusão, que eleva a pressão intracavernosa até valores 
próximos à pressão arterial média, gerando uma ereção plena (CORBIN, et al, 2002). 
Após o estímulo sexual, o óxido nítrico (NO) é liberado por terminações nervosas 
parasimpáticas e pelas células endoteliais que possui as isoformas neuronal (nNOS) e 
endotelial (eNOS) da óxido nítrico sintase (CORBIN, et al, 2004). O óxido nítrico por 
ser gasoso se difunde nas células da musculatura lisa vascular no corpo cavernoso do 
pênis, interfere na conformação da guanililciclase solúvel tornando-a ativa e 
aumentando os níveis de guanosinamonofosfato cíclica (GMPc) nessas células 
(LOUGHNEY, et al, 1998). Esse processo leva à ativação da proteína quinase 
dependente de GMPc (PKG), à fosforilação de outras proteínas e à diminuição do cálcio 
por sequestro intracelular ou á redução da sensibilidade por cálcio via ativação de canais 
de potássio, o que resulta em um relaxamento da musculatura lisa (CORBIN, et al, 
2004). Sabe-se que os níveis intracelulares de GMPc são regulados pelo equilíbrio entre 
a guanililciclase, que sintetiza GMPc e a fosfodiesterase 5 (PDE5), responsável pela 
degradação desse segundo mensageiro (STACEY, et al, 1998). Este processo pode ser 
visualizado na figura 1. 
 
 
 
 
 As fosfosdiesterases (PDE) compreendem 11 famílias distintas de enzimas 
(PDE1-PDE11) que inibem a atividade dos segundos mensageiros nas células por 
hidrolisarem a ligação fosfodiéster do monofosfato de adenosina cíclico (AMPc) e do 
monofosfato de guanosina cíclico (GMPc). Estes são importantes reguladores 
intracelulares de diversos processos, tais como motilidade do músculo liso, homeostase 
de eletrólitos, sinais neuroendócrinos e fototransduçãoretinal. Os inibidores de PDEs 
Figura 1:Rota de sinalização NO/GMPc. A figura mostra o estímulo promovendo a síntese 
de GMPc, seguido da sinalização intracelular dos alvos modulados por GMPc e o papel das 
fosfodiesterases no consumo de GMPc. Essa rota mostra o relaxamento da musculatura lisa 
vascular e ereção peniana através do estímulo sexual. Imagem adaptada (Selbach, B.P., 2008) 
podem elevar os níveis intracelulares do AMPc e GMPc, de acordo com a 
especificidade do substrato da PDE em particular que é bloqueada. Estes inibidores são 
referidos como agentes competitivos por assemelharem-se às estruturas moleculares dos 
nucleotídeos cíclicos, que são os substratos naturais das PDEs. As PDE5 são 
relativamente abundantes na musculatura lisa, incluindo vasculatura pulmonar e corpos 
cavernosos penianos, onde aparentemente regulam a hidrólise de GMPc que modula a 
vasodilatação. Além disso, sabe-se que a PDE5 possui papel importante em funções 
cognitivas como aprendizadoe memória (PRICKAERTS, 2004). 
 A PDE5 é um homodímero onde cada monômero contém um domínio 
regulatório (R) e um domínio catalítico (C) que cataliza a quebra de GMPc para 5´GMP 
(CORBIN, 1999). O domínio R possui diversos subdomínios funcionais, que inclui um 
sítio de fosforilação (Ser-92), sítios alostéricos de ligação de GMPc (GAFs a e b), assim 
como contatos de dimerização. Este sítio de fosforilação da Ser-92 parece ser 
responsável pelo aumento na atividade de hidrólise do GMPc (RYBALKIN, 2003). A 
ligação alostérica de GMPc ao domínio regulatório da PDE5 aumenta a afinidade de seu 
sítio catalítico pelo seu substrato GMPc, estimulando a hidrólise de GMPc (BLOUNT, 
et al, 2004). Isso ocorre por uma mudança conformacionalcausada pela ligação de 
GMPc ao sítio regulatório da enzima, tendo como consequência a exposição do sítio de 
fosforilação da Ser-92, aumentando a atividade enzimática em decorrência do aumento 
de afinidade da enzima pelo seu substrato. Essa fosforilação estabiliza a atividade 
catalítica aumentada promovendo uma maior afinidade de ligação de GMPc ao domínio 
GAF-A. Este mecanismo permite que a célula prolongue a ativação de PDE5 por 
feedback na síntese de GMPc (CORBIN, et al, 2000). 
 
 
 Diversos compostos que inibem a PDE5 foram sintetizados, dentre estes, sendo 
atualmente cinco fármacos comercializados no mercado. Após o estímulo sexual, essas 
Figura 2:Reação de hidrólise catalisada pela PDE5 que converte cGMP em 5’GMP. Imagem 
adaptada (Selbach, B.P., 2008) 
drogas inibem a PDE5 gerando um acúmulo de GMPc nas células dos tecidos penianos, 
desencadeando uma cascata que leva à ativação da PKG, a fosforilação de outras 
proteínas e a diminuição de cálcio celular ou à redução da sensibilidade ao cálcio, o que 
resulta em relaxamento da musculatura lisa. O Sildenafil foi um clássico exemplo de 
serendipidade. Químicos da Pfizer trabalhavam em uma nova molécula para distúrbios 
cardiovasculares (tratamento de angina). Durante os testes da droga, em 1994, os 
pesquisadores Nicholas Terrett e Peter Ellis, funcionários da Pfizer, descobriam que um 
de seus efeitos colaterais era o aumento da irrigação sanguínea no pênis, a partir da 
potencialização do óxido nítrico. Os ingleses Peter Dunn e Albert Wood conseguiram 
sintetizar o composto numa pílula, aprovada pelo FDA (o órgão que regulamenta 
medicação nos EUA), em 1998, como o primeiro remédio contra a impotência. O 
Sildenafil (Viagra®) foi o pioneiro dessa classe de medicamentos para o tratamento da 
DE que apresenta como mecanismo principal de ação a inibição da PDE5 e representou 
90% das vendas como medicamento para tratar a DE. As vendas mundiais do 
Sildenafilexcederam US$1,5 bilhões em 2001(ROTELLA, 2002). 
 Atualmente cinco fármacos dessa classe estão disponíveis no mercado, sendo 
eles, sildenafil, verdanafil, tadanafil, lodenafil e udenafil e representam única terapia 
medicamentosa para o tratamento de DE. Apesar de serem medicamentos que 
apresentam eficácia quanto à inibição da PDE5 e serem, portanto, facilitadores do 
mecanismo fisiológico da ereção, surge a necessidade de inibidores com perfis 
farmacocinéticos (melhorias relacionadas à início de ação, tempo de meia-vida, 
biodisponibilidade, etc) e com maior seletividade para a isoforma 5 das PDEs. 
 Em nossos dias, diversas estratégias e táticas modernas estão disponíveis para o 
desenho molecular de novos fármacos. A abordagem fisiológica se baseia no 
mecanismo de ação farmacológico pretendido, o que fundamentalmente depende da 
eleição do alvo terapêutico. Essa abordagem de desenho ou planejamento da arquitetura 
molecular de novas moléculas candidatas a novos fármacos, baseada no mecanismo de 
ação, fundamenta-se no prévio conhecimento no processo fisiopatológico envolvido e 
na escolha correta do melhor alvo terapêutico. O composto descoberto pode ter a sua 
eficácia otimizada por modificações moleculares subsequentes, introduzidas de forma 
planejada e capazes de preservar as propriedades farmacocinéticas identificadas nos 
bioensaiosin vivo. Para tanto, diferentes táticas são possíveis, especialmente a avaliação 
da série congênere, que consiste em uma família de compostos estruturalmente 
semelhantes ao protótipo, permitindo, inclusive, a validação do(s) grupo(s) 
farmacofórico(s) (BARREIRO, 2009). 
 O desenvolvimento de técnicas de triagem virtual representa um dos maiores 
avanços na atualidade de planejamento de fármacos. A triagem virtual, através de 
inúmeras estratégias distintas, é capaz de direcionar a seleção de moléculas com as 
características químicas desejadas para modular a atividade biológica dos mais diversos 
e atrativos alvos moleculares conhecidos na atualidade. O principal objetivo deste 
procedimento é aperfeiçoar o processo de investigação de novos candidatos a fármacos 
e abreviar o processo contínuo do seu planejamento (RODRIGUES, et al., 2012). 
 O presente trabalho tem, portanto, o objetivo de identificar moléculas com 
potencial inibitório frente a PDE5, construindo um banco de estruturas químicas 
selecionadas a partir de descritores químicos e realizar o acoplamento molecular com o 
banco de estruturas frente à fosfodiesterase5 humana. 
Metodologia 
Seleção da doença 
 A disfunção erétil (DE) é a incapacidade recorrente de obter e manter uma 
ereção que permita atividade sexual satisfatória, sendo a disfunção sexual que mais 
afeta os homens no envelhecimento. Estima-se que 50% dos homens acima de 40 anos 
apresentem essa disfunção. Inibidores seletivos para diferentes famílias de PDEs estão 
em desenvolvimento para diversas indicações.A DE traz diversos transtornos 
psicossociais para o indivíduo como problemas no convívio familiar, social, no 
ambiente de trabalho, levando a um quadro depressivo severo, e surgimento, 
posteriormente, de outras patologias. Inibidores de PDE5 estão sendo amplamente 
utilizados com sucesso para o tratamento de disfunção erétil em homens.Contudo, não 
sendo satisfatória a terapia medicamentosa disponível no mercado, as únicas terapias 
possíveis são a injeção intracavernosa de substâncias vasoativas (o que gera um 
desconforto muito grande para o paciente) ou o procedimento cirúrgico com o uso da 
prótese peniana.Como a prevalência de DEé expressiva, torna-se necessária a realização 
de estudos de planejamento de novas entidades químicas candidatas à inibidores de 
PDE5 e que apresentem melhores perfis farmacológicos. 
Seleção do alvo biológico 
 Estabelecido à patologia a ser estuda e após o estudo do mecanismo molecular 
envolvido no desencadeamento da mesma foi possível determinar a enzima 
fosfodiesterase5 humana como sendo o alvo biológico a ser selecionado. Sendo assim, o 
site Protein Data Bank (PDB) (http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do) foi escolhido 
como o banco de dados para coletar as melhores estruturas do alvo biológico visto 
possuir um grande número de estruturas macromoleculares 3D (120.642 estruturas, data 
de acesso 21/07/2016). Ao entrar no site PDB clicou-se na opção Advancedserach, em 
seguida em Chemical componentes selecionando a opção hasligand seguido da opção 
Yes.Adcionou-se a seção ChemicalMethod, seguindo as seguintes opções: Experimental 
Method, X-RAY, Has Experimental Data, Yes. Dando seguimento a busca, digitou-se o 
nome da enzima na seção MacromoleculeName: phosphodiesterase5. A pesquisa gerou 
uma série de estruturas cristalográficas diferentes para a PDE5, onde selecionou-se as 
três melhores moléculas com os menores valores de resolução Ǻ e valores R para homo 
sapiens, o que proporciona maior confiabilidade, sendo possível verificar com maior 
riqueza de detalhes as interações interatômicas presentes na estrutura cristalográfica.,sendo estas salva no formato pdb(tabela 3). 
Preparo de alvo biológico 
 Dentre as três melhores estruturas no processo de seleção do alvo biológico, a 
que apresentou melhor perfil para o estudo (menor valor de Resolução Ǻ e valor R) foi a 
que possuía código do 1TBF (complexo alvo+ligante). Algumas características do alvo 
escolhido foram analisadas, como sendo um monômero, a quantidade de resíduos de 
aminoácidos que a mesma possuía, os componentes químicos presentes e composição 
de estruturas secundárias α-hélices e folhas β da enzima. Feito o download da estrutura, 
salvo-a (em formato pdb) a qual foi aberta no Programa PyMOL™ 1.7.4 para que desse 
início o preparo do alvo para as futuras etapas de acoplamento. No processo de 
preparação do alvo no PyMOL™ foi retirada as moléculas de água da estrutura, bem 
como os artefatos presentes, preservando os cofatores (Mg+3 e Zn+2). Ainda na 
preparação do alvo, seleciou-se o ligante retirando-o do alvo biológico seguindo os 
passos: file,savemolecule e salvou o ligante (sele) em formato pdb. Em seguida salvou-
se o alvo sem o ligante no formato pdb. 
Desenho Estrutural e Minimização Energética de Moléculas 
 Para a realização desta etapa, foi feita uma pesquisa no Portal de Periódicos da 
CAPES (http://www.periodicos.capes.gov.br/, data de acesso 04/08/2016) com as 
seguintes palavras-chave: QSAR, inhibitors, phosphodiesterase V, com um filtro 
incluindo os artigos completos publicados nos últimos dez anos. Selecionou-se então o 
artigo intitulado 3D QSAR, pharmacophoreindentificationstudieson series of 1-(2-
ethoxyethyl)-1H-pyrazolo [4,3-d]pyrimidines as phosphodiesterase V inhibitors 
(Choudhari, Bhatia, 2015), que possuía 33 estruturas candidatas a inibidoras da PDE5 e 
que possuíam atividade biológica testadas (tabela 1). As 33 estruturas presentes neste 
artigo foram reproduzidas no programa Marvin Sketch 6.1.0, sendo salvas em estruturas 
3D nos formatos: PDB FILE, SD FILE, MRV, cada uma das delas. 
 
Figura 3: Esqueleto básico das moléculas 1-9. 
 
Figura 4: Esqueleto básico das moléculas 10-33. 
Tabela 1: Moléculas adaptadas do artigo 3D QSAR, pharmacophoreindentificationstudieson series of 1-
(2-ethoxyethyl)-1H-pyrazolo [4,3-d]pyrimidines as phosphodiesterase V inhibitors (Choudhari, Bhatia, 
2015). 
Molécula 3D QSAR MLR 3D QSAR bykNN-MFA 
Obs. Act. PreAtc. Res Obs. Act. PreAtc. Res 
1 1.154902 0.976007 0.178895 1.154902 1.23208 -0.07718 
2 0.39794 0.335082 0.062858 0.39794 0.463477 -0.06554 
3 1.154902 1.091625 0.063277 1.154902 1.22774 -0.07284 
4 0.187087 0.427347 -0.24026 0.187087 0.564074 -0.37699 
5 0.180456 0.329883 -0.14943 0.180456 -0.63399 0.814449 
6 -0.14613 -0.42503 0.278901 -0.14613 -0.35629 0.210165 
7 0.420216 0.315386 0.10483 0.420216 0.102351 0.317865 
8 -0.51851 0.630618 -1.14913 -0.51851 -0.27698 -0.24153 
9 -0.74036 0.204248 -0.94461 -0.74036 -0.15243 -0.58793 
10 -0.41497 -0.50069 0.085718 -0.41497 -0.34802 -0.06696 
11 0.05061 0.043787 0.006823 0.05061 -0.07732 0.127927 
12 -0.39794 -0.12422 -0.27373 -0.39794 -0.35668 -0.04126 
13 -0.07918 -0.03801 -0.04117 -0.07918 -0.2384 0.159214 
14 0.119186 0.098904 0.020282 0.119186 -0.08439 0.203571 
15 -0.36173 -0.27329 -0.08844 -0.36173 0.039018 -0.40075 
16 0.69897 0.87657 -0.1776 0.69897 0.4781461 0.220824 
17 0.142668 -0.04478 0.187449 0.142668 0.206722 -0.06405 
18 -0.30103 -0.26987 -0.03116 -0.30103 -0.40652 0.105488 
19 1.060481 0.885741 0.17474 1.060481 0.1778 0.882681 
20 0.376751 0.61674 -0.23999 0.376751 0.220577 0.156174 
21 -0.36173 -0.45437 0.09264 -0.36173 0.054078 -0.41581 
22 0.107905 0.496674 -0.38877 0.107905 0.41973 -0.31183 
23 0.455932 0.496674 -0.04074 0.455932 0.836395 -0.38046 
24 1.958607 1.263955 0.694652 1.958607 1.65955 0.299057 
25 1.154902 0.942938 0.211964 1.154902 1.27769 -0.12279 
26 2.154902 2.102652 0.05225 2.154902 1.55393 0.600972 
27 -0.07918 0.011897 -0.09108 -0.07918 0.058994 -0.13818 
28 1.154902 1.066985 0.087917 1.154902 0.74195 0.412952 
29 0.721246 0.824059 -0.10281 0.721246 0.835285 -0.11404 
30 1.09691 0.756023 0.340887 1.09691 1.18131 -0.0844 
31 1.09691 0.756023 0.340887 1.09691 1.18131 -0.0844 
32 1.30103 1.426039 -0.12501 1.30103 1.1549 0.14613 
33 1.39794 0.771842 0.626098 1.39794 -0.06902 1.466957 
Fonte: Choudhari, Bhatia, 2015 
 
Cálculo dos descritores físico-químicos e topológicos 
 Os cálculos dos descritores físico-químicos e topológicos influenciam de forma 
direta nos aspectos farmacodinâmicos e farmacocinéticos, sendo assim, a utilização de 
filtros moleculares é essencial para guiar a seleção de moléculas promissoras. Foram 
utilizados dois filtros moleculares abrangentes: Regra de Lipinski (conhecida como a 
regra dos cinco) e a Regra de Veber (conhecida como a regra dos três). Utilizou-se para 
cálculo os descritores físico-químicos (CLogP) e topológicos (número de ligações 
rotacionáveis e área de superfície polar), além de peso molecular (PM), aceptor de 
ligação de hidrogênio (ALH) e doador de ligação de hidrogênio (LDH) (tabela 2). 
Moléculas que sofressem a partir de duas penalidades nos filtros acima foram 
automaticamente excluídas para as próximas etapas do estudo. 
Tabela 2:Critérios de exclusão para moléculas bioativas analisando os 
descritores físico-químicos e topológicos. 
Regra de Lipinski Regra de Veber 
 
1Os valores de IC50 da atividade inibidora foram convertidos para os correspondentes pIC50 (log 1 / 
IC50) e usado como dependente variáveis no 3D-QSAR. 
Log P < 5 < 10 ligações rotacionáveis 
HBA < 10 PSA < 140 Å2 
HBD < 5 < 12 HBA + HBD 
PM < 500 da ---- 
Fonte: Autor, 2016. 
 
Predição de toxicidade e inibição de enzimas do CYP450 utilizando a plataforma 
OCHEM 
 A realização desta etapa é para avaliar o potencial mutagênico das moléculas do 
banco de dados (Teste de Ames), bem como a inibição dessas moléculas frente ao 
conjunto de enzimas do CYP450. Para isto, foi utilizado a plataforma Online 
ChemicalDatabase (OCHEM) (v.2.4.54). No OCHEM foram determinadas as predições 
desejadas contendo o teste de Ames e a inibição frente às famílias do CYP 450 
(CYP3A4, CYP2D6, CYP2C19, CYP2C9, CYP1A2). Os resultados estão expressos na 
tabela Y juntamente com os resultados dos cálculos dos descritores físico-químicos e 
topológicos. As moléculas que apresentaram resultado “ativo” para o Teste de Ames 
foram excluídas das etapas seguintes. 
Acoplamento molecular de moléculas bioativas e Interações intermoleculares 
 Para a realização desta etapa foram utilizados os programas Autodook Tools 
v.1.5.6, AutodookVina v.1.5.6 e o Pymol v.1.7.4., e a plataforma Protein-
LigandInteraction Profiler (PLIP). Inicialmente o receptor previamente preparado (sem 
moléculas de água, sem ligante e sem artefatos) foi utilizado para definição do espaço 
de procura Grid Box utilizando o programa Autodock Tools, onde foi adicionado o 
ligante para que se pudesse definir o sítio ativo do receptor, deslocando o centro do 
espaço de procura para o centro da massa da estrutura do ligante cristalográfico. 
Definido o espaço de interação do ligante com o receptor foi criado um bloco de notas 
com as coordenadas definidas da Grind Box, para que se possa fazer o cálculo de 
energia entre as moléculas aprovadas nos filtros das etapas anteriores com o receptor no 
programa AutodockVina. Cada cálculo produziu um arquivo 1.txt (valores de energia) e 
um arquivo 1_out.pdpqt (geometria de ligação). Em seguida, as moléculas salvas em 
formato _out.pdbqt foi abertas no programa Pymol afim que se analisasse os modos de 
ligação produzidos. 
 Com os valores de energia obtidos pelo AutodockVina foram selecionadastrês 
moléculas que apresentaram melhor energia de afinidade (menores valores), que em 
seguidas foram submetidas à plataforma PLIP, que gera os resíduos que participam das 
interações das moléculas com o receptor bem como a natureza dessas interações. 
Resultados e Discussão 
 Esta pesquisa foi realizada no intuito de apurar se moléculas que possuíam 
atividade inibitória frente à fosfodiesterase5 humana bem como o estudo do 
comportamento dessas moléculasao interagir com a PDE5 que hidrolisa o GMPc e 
assim diminui o relaxamento da musculatura lisa peniana dificultando o processo de 
ereção masculina. 
 A procura pelas melhores estruturas cristalográficas da PDE5 humana foi através 
da plataforma PDB, onde foi selecionado três estruturas com melhores resoluções e que 
o domínio catalítico estivesse complexado com o ligante, apresentadas na tabela abaixo. 
Tabela 3: Três melhores estruturas de fosfodiesterase5 humana 
de acordo com resolução cristalográfica conforme dados do 
Protein Data Bank (PDB). 
Código PDB Resolução Ǻ Valor R 
1TBF 1,30 0,185 
1XOZ 1,37 0,152 
1XPO 1,79 0,193 
Fonte: Autor, 2016 
 
 A estrutura cristalográfica do PDB que apresentou melhor resolução foi a com 
código 1TBF, sendo esta, portanto, escolhida como objeto de estudo para o acoplamento 
molecular estudado. 
 
Figura 5: Domínio catalítico do alvo biológico 1TBF preparado em 3D. 
Composições de estruturas: primárias – alças (verde); secundárias: α-hélices (vermelho). 
 
 
Figura 6:Superfície de interação do ligante com o receptor. 
 As 33 moléculas desenhadas no programa MarvinSketch 6.1.0. e retiradas do 
artigo intitulado 3D QSAR, pharmacophoreindentificationstudieson series of 1-(2-
ethoxyethyl)-1H-pyrazolo [4,3-d]pyrimidines as phosphodiesterase V inhibitors 
(Choudhari, Bhatia, 2015) foram submetidas aos filtros dos cálculos de descritores 
físico-químicos e topológicos de Lipinski e Veber, com os resultados descritos na tabela 
4. 
 
 
Tabela 4: Parâmetros físico-químicos e topológicos das moléculas em estudo 
Composto HBA HBD HBA 
+ 
BHD 
Lig_Rotac. PSA(Ų) PM(g/mol) LogP Filtro 
 
1 7 2 9 8 84,71 395,511 3,31 Aprovada 
2 7 2 9 7 97,60 368,445 1,85 Aprovada 
3 7 2 9 8 97,60 396,499 2,69 Aprovada 
4 7 2 9 7 97,60 396,499 2,12 Aprovada 
5 7 2 9 8 97,60 410,526 2,82 Aprovada 
6 7 2 9 8 97,60 410,526 3,20 Aprovada 
7 7 2 9 7 97,60 396,499 2,50 Aprovada 
8 7 2 9 8 97,60 410,526 3,20 Aprovada 
9 7 2 9 8 97,60 410,526 3,20 Aprovada 
10 9 2 11 8 96,26 425,541 2,33 Aprovada 
11 9 2 11 9 96,26 439,568 3,03 Aprovada 
12 8 3 11 9 109,63 439,568 3,07 Aprovada 
13 8 3 11 9 109,63 439,568 3,07 Aprovada 
14 8 3 11 9 109,63 439,568 2,71 Aprovada 
15 8 4 12 9 118,42 425,541 2,19 Aprovada 
16 8 4 12 10 118,42 439,568 2,89 Aprovada 
17 8 4 12 10 106,25 453,595 3,27 Aprovada 
18 8 4 12 11 106,25 467,622 3,63 Penalidade 
Veber 
19 8 3 11 10 97,46 467,622 3,21 Aprovada 
20 7 3 10 10 106,39 438,580 3,22 Aprovada 
21 8 3 11 8 120,66 425,541 1,70 Aprovada 
22 8 4 12 10 118,42 439,568 2,65 Aporvada 
23 8 4 12 10 118,42 439,568 2,65 Aprovada 
24 8 4 12 11 118,42 453,595 3,35 Penalidade 
Veber 
25 8 3 11 9 120,66 439,568 2,16 Aprovada 
26 8 3 11 10 120,66 453,595 2,86 Aprovada 
27 9 3 12 9 111,04 426,525 2,50 Aprovada 
28 9 3 12 10 113,25 454,579 2,96 Aprovada 
29 9 3 12 9 136,11 453,551 1,75 Aprovada 
30 9 3 12 10 136,11 467,578 2,45 Aprovada 
31 9 3 12 10 136,11 467,578 2,61 Aprovada 
32 10 2 12 9 133,15 454,535 2,56 Aprovada 
33 10 2 12 10 133,15 468,562 3,26 Aprovada 
Azul:Penalidade Regra de VeberFonte: Autor: 2016 
 Nenhuma molécula foi reprovada pelos filtros, apenas as moléculas 18 e 24 
sofreram uma penalidade na Regra de Veber, ambas possuem acima de 10 ligações 
rotacionáveis, porém essa penalidade não é suficiente para a eliminação das mesmas, 
pois o critério de exclusão prever o mínimo duas penalidades para um mesmo 
composto. 
 A etapa seguinte do estudo é referente ao teste de Ames e a inibição enzimas do 
Citocromo P450. O teste de Ames detecta mutações gênicas e é comumente utilizado na 
determinação da capacidade mutagênica de grande variedade de substâncias químicas e 
misturas complexas.Este ensaio biológico faz utilização de cepas bacterianas, a exemplo 
da Salmonellatyphimurium, que são dependentes da histidina. A mutagenicidade é 
avaliada de acordo com a quantidade de colônias de bactérias que cresceram na placa 
contendo um meio deficiente de histidina e tendo a adição da molécula de interesse.Em 
relação aos Citocromos P450, é conhecido que são uma família de enzimas que 
participam de forma ativa da catálise de metabolização tanto de substâncias endógenas 
quanto exógenas (SUSHKO, 2010). 
 Foram utilizadas todas as moléculas do estudo inicial, visto que nenhuma delas 
foram eliminadas nos filtros de parâmetros físico-químicos e topológicos e para a 
realização desse teste foi utilizada a plataforma OCHEM como fonte de dados. Com os 
resultados obtidos foi possível analisar quais moléculas foram ativas para o teste de 
Ames, ou seja, tem capacidade de sofrer mutagenicidade, e fazer a eliminação das 
mesmas, preservando as moléculas inativas que serão utilizadas para a continuidade do 
estudo (tabela 5). 
Tabela 5: Resultado de estudo de mutagenicidade por meio do teste de Ames e inibição de CYP450 
Composto Teste de Ames Inibição CYP450 
1* Ativo CYP3A4,CYP2D6,CYP2C9 
2* Ativo CYP2D6 
3 Inativo CYP3A4,CYP2D6,CYP2C9 
4 Inativo CYP3A4,CYP2D6 
5 Inativo CYP3A4,CYP2D6,CYP2C19 
6 Inativo CYP3A4,CYP2D6,CYP2C19 
7 Inativo CYP3A4,CYP2D6 
8 Inativo CYP3A4,CYP2D6,CYP2C19 
9 Inativo CYPP3A4,CYP2D6,CYP2C19 
10* Ativo CYP2D6 
11* Ativo CYP3A4,CYP2D6 
12* Ativo CYP2D6 
13* Ativo CYP2D6 
14* Ativo CYP3A4,CYP2D6 
15* Ativo CYP2D6 
16 Inativo CYP2D6 
17* Ativo CYP3A4,CYP2D6 
18* Ativo CYP3A4,CYP2D6 
19* Ativo CYP3A4,CYP2D6 
20* Ativo CYP2D6 
21* Ativo CYP2D6 
22* Ativo CYP3A4,CYP2D6 
23* Ativo CYP3A4,CYP2D6 
24* Ativo CYP3A4,CYP2D6 
25* Ativo CYP3A4,CYP2D6 
26* Ativo CYP3A4,CYP2D6 
27* Ativo CYP3A4,CYP2D6 
28* Ativo CYP3A4,CYP2D6 
29* Ativo Não inibe 
30* Ativo CYP3A4,CYP2C19,CYP2C9 
31* Ativo CYP3A4,CYP2C19,CYP2C9 
32* Ativo Não inibe 
33* Ativo Não inibe 
“*”Composto eliminado 
Vermelho: composto mutagênico 
Fonte: Autor, 2016. 
 
 Com base nos resultados da tabela 5 foi possível a eliminação de um grande 
número de moléculas que apresentaram mutagenicidade por meio do teste de Ames, 
sendo apenas os compostos 3-9 e o composto 16 que passarem pelo teste, sendo assim, 
portanto, essas moléculas candidatas para o prosseguimento do estudo seguindo para a 
fase de acoplamento molecular. Contudo, essas moléculas candidatas para a próxima 
fase de estudo apresentaram todas elas inibição de algumas isoformas do CYP450, 
sendo um dado importante para a análise de interações medicamentosas com outros 
fármacos em estudos futuros. 
 O acoplamento molecular é um método que prevê a orientação preferencial de 
uma molécula a uma segunda, quando ligados entre si para formar um complexo estável 
(LENGAUER; RAREY,1996).O conhecimento da orientação preferida por sua vez 
pode ser utilizado para prever a força de associação ou a afinidade de ligação entre duas 
moléculas, por exemplo, utilizando funções de scoring. Na aplicação da técnica de 
acoplamento molecular tem como objetivo alcançar duas finalidades distintas: 
primeiramente, prever a melhor orientação estrutural do ligante em relação ao 
receptor(tabela 6), e posteriormente, obter uma precisa previsão e pontuação da 
afinidade de ligação (KITCHEN, et al., 2004) (tabela 7). 
 No estudo deacoplamento foram gerados valores para o Grid Box direcionado o 
sítio de ancoragem molecular para identificação das dimensões do local onde o ligante 
cristalográfico está ligado. 
Tabela 6: Dados gerados no Grind Box 
 
 
Size 
Coordenadas 
X Y Z 
16 14 12 
Center 29.169 30.409 64.925 
Fonte: Autor, 2016. 
 
Tabela 7: Valores de energia de afinidade dos compostos 
estudados 
Composto Afinidade (kcal/mol) 
3 -7,8 
4* -8,3 
5 -8,1 
6 -7,7 
7* -8,5 
8* -8,2 
9 -8,0 
16 -8,2 
“*” moléculas com menores valores de energia. 
Fonte: Autor, 2016 
 
 Sendo assim, analisando a tabela 7 foi possível identificar que os compostos 4 
(figura 7) ,7(figura 8) e 8 (figura 9) apresentaram melhores valores de energia (valores 
mais baixos). O AutodockVina calcula nove possíveis interações entre o ligante e o 
alvo. O composto 8 e o composto 16 apresentaram a primeira energia de afinidade com 
o receptor iguais, contudo, o critério para a escolha foi analisar o segundo valor de 
energia entre elas, onde o composto 8 apresentou uma segunda energia de afinidade 
menor do que o composto 16, sendo então o composto escolhido para a fase de 
desenvolvimento do mapa de interações. 
 
 
 
 
 Ao final de todo o processo de escolha do alvo biológico, preparação do 
receptor, aplicação de filtros para o critério de escolha das moléculas mais promissoras 
e por fim, a obtenção dos valores de energia de afinidade das três melhores moléculas 
que foram aprovadas em todas as fases desse estudo (valores de IC50 descritos na tabela 
1), seguiu-se então para a parte final do estudo, que é o desenvolvimento do mapa de 
interações dos compostos escolhidos com o alvo biológico através do acoplamento 
molecular. 
 Assim, com os resultados das interações moleculares destes compostos é 
possível identificar quais ligações são relevantes para que haja atividade inibitória frente 
a PDE5. A caracterização dessas interações pode fornecer informações úteis para o 
entendimento do modo de inibição e modulação de novas entidades químicas, 
desenvolvimento de novas moléculas bioativas e otimização de moléculas lideres 
(SALENTIN et al., 2015). Os mapas de interações dos compostos 4, 7 e 8gerados na 
plataformaPLIP foram salvam no Pymol e podem ser visualizadas nas figuras 10, 11 e 
12. 
 Os mapas de interação do domínio catalítico da PDE5 com as moléculas do 
estudo revelaram que os compostos interagem com a enzima tanto através de ligação de 
hidrogênio com resíduos envolvidos na ligação de nucleotídeos, através de resíduos 
hidrofóbicos alinhados no canal do sítio ativo ou com íons metálicos mediados por 
moléculas de água. Esses mecanismos de ligação têm despertado a curiosidade de 
pesquisadores a buscarem novos possíveis inibidores para as fosfosdiesterases. 
Figura 1: Estrutura 
química molécula 4. 
Figura 8:Estrutura 
química molécula 7. 
Figura 9: Estrutura 
química molécula 8. 
 Para a facilidade do entendimento das interações dos mapas gerados no PLIP, foi 
criada uma tabela (tabela 8) dos resíduos que participam das interações ligante-receptor, 
onde estão dispostos a estrutura química de cada um deles, a fim de melhorar a 
compreensão das ligações intermoleculares dispostas nos mapas de interações para cada 
composto. 
Tabela 8: Lista de siglas de aminoácidos e suas respectivas estruturas químicas. 
Sigla Aminoácido Estrutura Química Sigla Aminoácido Estrutura Química 
Phe Fenilalanina 
 
 Tyr Tirosina 
 
Val Valina 
 
 Ala Alanina 
 
Ile Isoleucina 
 
 Gln Glutamina 
 
Legenda: vermelho: cadeia lateral apolar; azul: cadeia lateral polar não carregada (tendem a formar ligação de 
hidrogênio). 
Fonte: Autor, 2016. 
 
 O primeiro mapa a ser analisado será o mapa de interação do composto 4 com o 
domínio catalítico da PDE5. Os resíduos que participam da interação do ligante com o 
receptor são: Phe-786, Phe-820, Val-782, Thy-612, Ile-768, Ile-778 e Ala-767. Como 
observado na tabela 8, a Phe é um aminoácido apolar, que possui um anel aromático na 
sua cadeia lateral e por esse motivo, faz ligações do tipo hidrofóbica com o ligante em 
questão. A Phe-820 faz uma ligação π-stacking paralela a uma distância 4,48Åcom o 
anelpiridina, que devido à orientação (paralela) e uma menor distância, acaba sendo 
uma ligação mais forte comparada com a Phe-786, que também faz uma ligação com o 
mesmo anel, porém do tipo π-stacking perpendicular (interação mais fraca) a uma 
distância 4,97Å. Os aminoácidos Val-782, Ile-778 e Ala-767, também são resíduos que 
possuem a sua cadeia lateral hidrofóbica e, portanto, fazem interações do tipo 
hidrofóbicas com o grupamento metila da cadeia ramifica do ligante, nas distâncias 
3,74Å, 3,91Å e 3,97Å respectivamente. A Tyr-612, devido a sua estrutura química, faz 
dois tipos de interações com o ligante: ligação do tipo π-stacking perpendicular com o 
anel pirazolopirimidina, a uma distância de 5,03Å, e uma vez que possui uma cadeia 
lateral polar, faz ligação de hidrogênio do tipo doador, entre da hidroxila presente em 
sua estrutura e o nitrogênio do anel pirazolopirimida do ligante, que possui 3 pares de 
elétrons livres, a uma distância de 3,04Å. A última interação presente neste mapa é do 
resíduo Ile-768 que na sua estrutura possui um grupamento amina fazendo 4 ligações e 
adquirindo carga parcial positiva (-NH3
+), e sendo assim, faz ligação de hidrogênio com 
o Oxigênio da cadeira ramificada do ligante que possui 2 pares de elétron livres. 
 
 
 
 O próximo mapa a ser analisado é o mapa de interação do composto 7 com o 
receptor. Os aminoácidos envolvidos nas interações são: Ala-767, Ile-778, Val-982, 
Tyr-612, Gln-775, Phe-786. Os resíduos Ala-767, Ile-778 e Val-982 devido as cadeias 
laterais apolares fazem ligações do tipo hidrofóbica com a metila da cadeira ramificada 
do ligante 7 nas respectivas distâncias 3,95Å, 3,74Å e 3,72Å. A Gln-775 e a Tyr-612, 
ambos são resíduos que fazem ligações de hidrogênio com o ligante. A Gln-775 na sua 
cadeia lateral polar possui uma amina carregada positivamente (-NH3
+) que participa 
como grupo aceptor na ligação com o oxigênio da cadeia ramificada do ligante 
(oxigênio=grupo aceptor) que possui distância de 4,08Å. A Tyr-612 possui na estrutura 
polar uma hidroxila (grupo doador) que se liga com o nitrogênio do anel 
pirazolopirimidina (grupo aceptor) através de ligação de hidrogênio sob uma distância 
Figura 10: Mapa de interação da molécula 4 e receptor. 
Legenda: tracejado verde claro: ligação π-stackingparelela; tracejado verde escuro: ligação 
π stacking perpendicular; linha azul: ligação de hidrogênio; pontilhado: ligação hidrofóbica. 
 
de 3,03Å. O resíduo Phe-786 faz uma ligação π- stackingperpendicular com o anel 
piridina a uma distância de 5,20Å. 
 
 
 
 O mapa de interação do composto 8 mostra algumas diferenças de interação com 
os resíduos em comparação com os mapas gerados dos compostos 4 e 7. Neste mapa 
são visualizados apenas dois tipos de interações moleculares. Os aminoácios Ala-767, 
Ile-778 e Val-782 fazem interações do tipo hidrofóbicas com a metila da cadeia 
ramificada do ligante 7. A Tyr-612 faz ligação de hidrogênio com o anel 
pirazolopirimidina, de forma que atua como doador de elétrons e o nitrogênio do anel ao 
qual se liga atua como grupo aceptor de elétrons. 
 
 
 
Figura 12: Mapa de interação da molécula 8 e receptor. 
Legenda: tracejado verde claro: ligação π-stackingparelela; tracejado verde escuro: ligação 
π stacking perpendicular; linha azul: ligação de hidrogênio; pontilhado: ligação hidrofóbica. 
 
Figura 11: Mapa de interação da molécula 7 e receptor. 
Legenda:; tracejado verdeescuro: ligação π stacking perpendicular; linha azul: ligação de 
hidrogênio; pontilhado: ligação hidrofóbica. 
 
 Contudo, diferentemente dos compostos 4 e 7, o mapa de interação do composto 
8 mostrou que o mesmo não faz interação hidrofóbica do tipo π com nenhum resíduo do 
sítio ativo. Uma hipótese para essa questão é que no acoplamento molecular do 
composto 8 ele adote uma conformação diferente dos outros compostos do estudo e por 
isso não faça interação do tipo π com os resíduos do sítio ativo. 
 
Conclusão 
 A disfunção erétil é a incapacidade recorrente de obter e manter uma ereção que 
permita atividade sexual satisfatória, sendo a disfunção sexual que mais afeta os homens 
no envelhecimento. Os inibidores da PDE5 tem provado serem eficazes para o 
tratamento de DE, sendo também única terapia farmacológica disponível no mercado. A 
PDE5 é a principal enzima envolvida no mecanismo de ereção peniana, sendo o foco 
dos estudos para o desenvolvimento de novos inibidores da mesma. No entanto, um 
maior entendimento da topologia do bolsão catalítico da PDE5 será de extrema 
importância para o desenvolvimento de drogas mais seletivas. 
 A utilização de métodos computacionais tem função importante neste 
procedimento, pois consegue trazer detalhes dos compostos em estudo, bem como das 
interações e do acoplamento realizadas entre os ligantes e o alvo biológico. Contudo, 
deve-se levar em consideração que a biologia não é uma ciência exata, o que torna os 
experimentos computacionais e seus respectivos descritores susceptíveis a erros. A 
modelagem molecular consiste em um conjunto de ferramentas para a construção, 
edição e visualização, análise e armazenamento de sistemas moleculares complexos, 
sendo uma alternativa favorável para o desenvolvimento de novos fármacos, permitindo 
um ganho de custo e tempo nas etapas de planejamento. Através desse estudo foi 
possível visualizar o mapa de interação de moléculas candidatas a inibidores da PDE5 e 
seu comportamento frente ao alvo farmacológico, facilitando o entendimento dos 
resíduos importantes no sítio catalítico e que merecem atenção particular no 
desenvolvimento de novos inibidores. Como descrito anteriormente, o domínio 
catalítico da família das fosfosdiesterases é muito parecido entre as isoformas, apenas 
algumas sequências de aminoácidos diferem entre elas o que explica os efeitos adversos 
causados pelos inibidores da PDE5. Sugere-se, portanto, um estudo de alinhamento de 
sequências primárias entre as isoformas de fosfosdiesterases (em especial PDE5, PDE6 
e PDE9,isoformas que hidrolisam seletivamente o GMPc), a fim de identificar os 
resíduos que as diferem e com isso possibilitar o desenvolvimento de moléculas mais 
seletivas e com melhores perfis farmacológicos. 
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