Microbiologia Clínica: Diagnóstico de Infecções

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Profa. Cleide A F Rezende
Microbiologia Clínica
O diagnóstico etiológico das infecções é realizado 
basicamente por dois procedimentos laboratoriais:
Método direto – microscopia, cultura ou inoculação 
em animal susceptível;
Acs
Método indireto – técnicas sorológicas 
Ags
Principais fontes de material:
 Coprocultura – enteropatogênicos
 Cultura trato geniturinário – trato genital e urinário
 Garganta, escarro – faringite, bronquite, 
pneumonia, tuberculose
 Exudados – espaços peritoneal e pleural, lesões 
que se comunicam com a pele
 Hemocultura – bacteremias e septicemias
 LCR – meningites ou meningocefalites.
Técnicas bacteriológicas:
 Exame direto ao microscópio
O exame visual direto ao agente microbiano, 
subme-tido ou não a técnicas de coloração, 
representa um recurso diagnóstico de fácil e rápida 
execução e que, em certos casos, é capaz de 
orientar imedia-tamente o início do tratamento.
 A microscopia fornece informações morfológicas e 
tintoriais das células bacterianas, como: forma das 
células, arranjo apresentado, afinidade pelos 
corantes. Ao contrário dos fungos, cuja identificação 
se baseia, em grande parte, nos métodos 
microscópicos, as bactérias não podem ser 
identificadas em espécies com base no exame 
microscópico. Somente a cultura, seguida de 
identificação bioquímica e outras, tem valor para 
esse propósito. Não obstante a bacterioscopia direta 
não deve ser negligenciada como recurso 
diagnóstico, já que pode revelar-se valiosa fonte de 
informações, com a vantagem de estas serem 
imediatas e permitirem o início precoce da 
terapêutica específica.
 Material à fresco: consiste em examinar ao 
microscópio a preparação obtida, colocando-se 
sobre a lâmina uma gota do material que é 
recoberto com lamínula.
Estudo da forma e organização das bactérias
1. A maioria das bactérias tem de 0,2-2,0 m de 
diâmetro e de 2-8 m de comprimento.
2. As três formas bacterianas básicas são cocos 
(esferas), bacilos (bastões) e espirais.
3. As bactérias pleomórficas podem assumir várias 
formas.
Formas e Arranjo
 Cocos (esféricos):
Micrococos: cocos isolados
Diplococos: pares de cocos
 Cocos (esféricos):
◦Tétrades: grupo de 4 cocos
◦Sarcina: grupo de 8 cocos em forma cúbica
 Cocos (esféricos):
◦ Estreptococos: cadeias de cocos
◦ Estafilococos: cachos (irregulares) de cocos
Formas e Arranjo
Bacilos (bastonetes)
 Individualizados - únicos
Diplobacilos: pares de bacilos
 Bacilos (bastonetes)
◦ Paliçada: alinhamento lateral
Estreptobacilos: cadeias de bacilos
Formas e Arranjo
Hélices ou espirais
Espirilos: curto e flagelados
Espiroquetas: longas, flexíveis e contrácteis
 Formas de transição 
◦ Cocobacilos
◦ Vibriões
 Cultura em caldo
1. Transferir uma a duas gotas para uma lâmina limpa 
utilizando alça bacteriológica ou pipeta.
2. Espalhar suavemente o material a fim de obter um 
esfregaço delgado.
 Colônias obtidas de meio sólido
1. Utilizar uma gota de salina estéril em uma lâmina limpa.
2. Transferir uma pequena porção da colônia com alça 
bacteriológica.
3. Misturar suavemente para obter um esfregaço levemente 
turvo e homogêneo.
Nota: Para evitar a formação de aerossóis, nunca misturar o 
material vigorosamente.
 Calor
1. Todo o esfregaço, antes de ser submetido a coloração, 
deverá estar seco (exposto ao ar), sendo fixado com 
calor brando (50ºC). A fixação excessiva e o 
superaquecimento irão distorcer a morfologia celular e a 
fixação insuficiente permitirá a saída do material 
durante o processo de coloração. 
2. Deixar a lâmina esfriar antes de iniciar a coloração.
 Metanol ou Etanol
1. A fixação pelo metanol ou etanol também pode ser 
utilizada. Além de prevenir a lise das hemácias, evita 
que os esfregaços, principalmente os de urina, 
desprendam-se no momento da coloração.
Coloração de Gram
O método tintorial predominante utilizado em bacteriologia é o método de 
Gram. A bacterioscopia, após coloração pelo método de Gram com 
diagnóstico presuntivo, de triagem, ou até mesmo confirmatório em alguns 
casos, constitui peça importante e funda-mental no diagnóstico. 
A coloração de Gram recebeu este nome em homenagem a seu 
descobridor, o médico dinamarquês Hans Cristian Joaquim Gram. 
Em 1884, Gram observou que as bactérias adquiriram cores diferentes, 
quando tratadas com diferentes corantes. Isso permitiu classificá-las em 
dois grupos distintos: as que ficavam roxas, que foram chamadas de Gram 
positivas, e as que ficavam vermelhas, chamadas de Gram-negativas.
Após descrição do método, inúmeras propostas de modificações foram 
feitas. 
Gram positiva
Gram negativa
 Precipitação do corante: simula cocos Gram-positivos.
 Uso de lâminas que não tenham sido pré-limpas ou desengorduradas.
 Espessura do esfregaço: pode corar irregularmente.
 Superaquecimento na fixação pelo calor : destruição da morfologia.
 A descoloração insuficiente com álcool-acetona permite a retenção do
cristal-violeta, o que dificulta a observação de bactérias Gram-negativas.
Por outro lado, esfregaços obtidos de culturas velhas ou contendo
numerosas bactérias mortas ou expostas à ação de antibióticos
apresentam irregularidades na coloração. As bactérias Gram-positivas
perdem a capacidade de reter o cristal-violeta, apresentando-se Gram-
negativas; as Gram-negativas podem corar-se mais fracamente pela
safranina, podendo simular a ocorrência de infecções mistas (Gram-
positivas/ Gram-negativas).
Causas Comuns de Erro
 A discordância de resultado entre o esfregaço corado pelo Gram e a 
cultura pode estar relacionada com a coleta ou meios de transportes 
e conservantes inadequados.
 Um resultado positivo de Gram com cultura negativa pode sugerir 
contaminação do corante, presença de agentes antimicrobianos na 
amostra do paciente ou falha no crescimento de microrganismos 
devido às condições utilizadas (atmosfera, ação seletiva dos meios 
de cultura, etc.).
 Há bactérias que são resistentes à coloração, mas que uma vez coradas vão resistir fortemente à 
descoloração, mesmo por ácidos fortes diluídos e álcool absoluto. Às bactérias que possuem esta 
propriedade dizemos que são ácido-álcool resistentes (géneros Mycobacterium e Nocardia). Esta 
carcaterística é devida ao elevado teor de lípidos estruturais (ex. ácido micólico) na parede celular
destas bactérias, que provoca uma grande hidrofobicidade, dificultando a ação dos mordentes e 
diferenciadores de corantes aquosos. A técnica de Ziehl-Neelsen evidencia esta ácido-álcool 
resistência. Segue o seguinte protocolo:
 Confeccionar o esfregaço seguindo as técnicas atuais de biossegurança; 
 Cobrir a lâmina com fucsina fenicada (o mordente é o ácido fénico); 
 Aquecer a lâmina até à emissão de vapores (é importante não deixar ferver); 
 Aguardar 5 a 8 minutos; 
 Lavar com água corrente; 
 Cobrir a lâmina com álcool-ácido 3% até descorar totalmente o esfregaço; 
 Lavar com água corrente; 
 Cobrir a lâmina com azul de metileno durante 1 minuto; 
 Lavar com água corrente; 
 Secar; 
 Observar. 
A fucsina fenicada, atuando a quente, vai corar todas as células bacterianas e 
outras estruturas presentes no esfregaço de vermelho (o calor vai derreter os 
lípidos de membrana, tornando-a permeável). O ácido diluído em álcool aplicados 
vão descorar todas as bactérias exceto as ácido-álcool resistentes, que 
permanecem coradas de vermelho pela fucsina. Assim, ao serem observadas após 
coloração e contraste, com azul de metileno, encontraremos as bactérias:
Ácido-álcoolresistentes: coradas de vermelho. 
Não ácido-álcool resistentes: coradas de azul. 
MEIOS DE CULTURA
Os meios de cultura usados no laboratório de bacteriologia 
clínica destinam-se a produção e o estudo da bactéria de 
interesse médico.
São formulados para:
 Produção de antígenos específicos
 Permitir o crescimento seletivo
Demonstrar certas propriedades biológicas (hemólise)
 Formação de esporos 
 Produção de pigmentação
De enzimas
 Devem ser frescos
 Escolhidos de modo a permitir o crescimento dos 
mo. apropriados
 Sólidos para obtenção de culturas puras
Características dos meios de cultura
Classificação dos meios de cultura
Quanto a consistência
1. Líquido: Thioglycollate Medium (THIO),
Brain Heart Infusion (BHI)
2. Semi-sólido: Sulfeto Indol Motilidade (SIM)
3. Sólido: Manitol Salt Ágar (MSA), Ágar sangue
Quanto a função:
• Meios enriquecidos: ágar chocolate, ágar sangue, BHI
2. Meios seletivos: Manitol Salgado, Ágar MacConkey, 
Lowenstein-Jensen
3. Meios diferenciais: Ágar sangue, Ágar MacConkey
Meios de Cultura 
Meios destinados à preservação de microrganis-
mos presentes em materiais biológicos. Os meios 
são acompanhados de swabs bacteriológicos com 
algodão destituídos de propriedades bactericidas, 
tratados com soluções tamponantes visando a 
coleta, transporte e conservação de amostras bio-
lógicas.
Meios de transporte 
Cary Blair 
Finalidade: Meio de cultura destinado ao transporte 
dos mais variados materiais biológicos principal-
mente para amostras de fezes. Sendo muito impor-
tante pois permite a conservação do Vibrio cholerae. 
Os outros meios de transporte como a glicerina 
tamponada inviabilizam este patógeno.
Stuart
Finalidade: Meio de cultura com composição definida
de baixo potencial de oxiredução destinado a preser-
vação de bactérias, fungos ou parasitas, nos mais
variados materiais biológicos. É um dos meios de
transporte mais utilizados internacionalmente.
Meio Glicerinado
Finalidade: Solução salina glicerinada tamponada,
visando o transporte e conservação dos mais variados
patógenos intestinais. As fezes podem permanecer em
temperatura ambiente por até 24 horas. Não recomen-
dado para Vibrio cholerae. Ideal para Shigella.
Meios para Gram negativos
Ágar Entérico de Hektoen
Finalidade: Meio seletivo diferencial de média seleti-vidade,
sendo excelente para o isolamento de Salmonella e
Shigella. Além de permitir a leitura de fermentação de
açúcares como sacarose, lactose e salicina, também
fornece leitura de produção de H2S. As Salmonelas utilizam
este substrato, formando colônias com centro preto, sendo
esta uma conduta no procedimento de escolha das
colônias, visando o diagnóstico de Salmonella. A maioria
das colônias de E. coli, Enterobacter, Klebsiella, são
inibidas neste meio de cultura. As colônias de Shigella se
apresentam verde azuladas, e as de Salmonella, verde
azuladas com centro preto.
Ágar MacConkey
Finalidade: Ágar seletivo de escolha para o isolamento
de Gram negativos. Meio diferencial pois propicia a
visualização de colônias fermentadoras ou não da
lactose. As colônias vermelhas são consideradas
lactose positiva e as claras, lactose negativa. São
utilizados sais biliares com cristal violeta como
agentes inibidores e vermelho neutro em conjunto
como indicadores.
Ágar SS
Finalidade: Meio de alta seletividade destinado à
coprocultura, visando o isolamento de Salmonella e
Shigella. Possui as mesmas finalidades do meio de
Hektoen e XLD, propiciando também a leitura de
produção de H2S. Possui sais biliares como agente
inibidor. As colônias suspeitas de Shigella são
transparentes e as de Salmonella se apresentam
transparentes e geralmente com centro negro.
Ágar Teague ou BEM
Finalidade: Meio de cultura de baixa seletividade
destinado ao isolamento de Gram negativos como o
meio de MacConkey. As colônias fermentadoras de
lactose apresentam coloração preta, com ou sem
brilho metálico. As não fermentadoras de lactose,
como as Salmonella e Shigella, apresentam-se
incolores.
Ágar XLD
Finalidade: Meio de cultura de média seletividade
utilizado para coprocultura. Possui xilose, lactose,
sacarose e lisina, e propicia a visualização da
produção de H2S. As colônias de Salmonella se
apresentam vermelhas com o centro preto, as de
Shigella, vermelhas. Bactérias como E. coli
produzem colônias amarelas. O inibidor utilizado é o
desoxicolato de sódio.
Ágar Manitol
Finalidade: Meio seletivo para o isolamento de
estafilococos, como o ágar Chapman. Além da alta
concentração de cloreto de sódio, possui também
manitol, sendo este um substrato importante na
classificação de estafilococos. Colônias amarelas
indicam a utilização do manitol.
(Suspeita de S. aureus).
Meios para estafilococos
Ágar CLED
Finalidade Þ Meio não seletivo, apenas diferencial.
Contém lactose. Destinado ao isolamento de Gram
positivos e Gram negativos em urina. É um meio de
cultura eletrólito-deficiente, impedindo o "swarming"
do Proteus. Utilizando-se uma alça calibrada de 1m l
ou 10m l é possível realizar a contagem de colônias.
Meios para urocultura
Ágar Chocolate
Finalidade: Metade da placa contém Ágar Chocolate
adicionado de suplementos vitamínicos e minerais,
destinados ao isolamento de bactérias exigentes como
as do gênero Neisseria.
Meios para neisseria
Thayer Martin
Finalidade: Ágar Chocolate enriquecido de suplemento
VX, com adição de Colistin (inibição de Gram
negativos), Vancomicina (inibição de Gram positivos) e
Nistatina (inibidor de crescimento de fungos). Este
meio deve ser incubado com a tampa frouxa, na
vertical, em recipiente contendo 5 a 10% de CO2. Meio
destinado ao isolamento de bactérias do gênero
Neisseria. Possui durabilidade limitada devido à
presença de antibióticos.
Ágar Chocolate Suplementado
Finalidade: Ágar Chocolate com uma base rica,
acrescido de 7% de sangue de carneiro e suplemento
VX, destinado ao enriquecimento, visando o
isolamento de Neisseria, Haemophilus, Brucelas e
outros germes exigentes.
Meios para microrganismos fastidiosos
Mueller Hinton
Finalidade: Ágar internacional de escolha para a
realização do antibiograma (teste de susceptibilidade
a antimicrobianos). É um meio que possui eletrólitos
em concentrações padronizadas, de composição
química definida, não apresentando substâncias
antagônicas às sulfas e antibióticos, visando a
execução de testes de susceptibilidade a
antimicrobianos.
É o meio padrão recomendado pela Organização
Mundial de Saúde (OMS) e FDA.
Meios para antibiograma
Ágar Sangue de Carneiro
Finalidade: Meio de cultura de base rica. Geralmente
utiliza-se Ágar Mueller Hinton ou Ágar Columbia como
base deste meio, sem glicose, pois esta poderia
atrapalhar a visualização de hemólise. Acrescido de 7%
de sangue de carneiro desfibrinado. Excelente meio para
o isolamento de estreptococos beta-hemolíticos,
principalmente a nível de orofaringe. É um meio amplo,
pois praticamente todas as bactérias facultativas
conseguem se desenvolver neste meio.
Meios para estreptococos
Ágar Tríptico de Soja (TSA)
Finalidade: Meio de cultura de amplo crescimento, não
seletivo, não diferencial, servindo para o isolamento e
contagem dos mais variados microorganismos
facultativos.
Meios para uso geral
Bile Esculina – Ágar
Finalidade: Meio de cultura para enterococos,
destinado à verificação da tolerância a 40% de bile e
hidrólise da esculina. A reação positiva corresponde ao
enegrecimento do meio.
Meios para enterococos
M.T.S. (Meiode Tolerância ao Sal)
Finalidade: Caldo com 6,5% de cloreto de sódio e
indicador de pH, utilizado na identificação de
enterococos. O enterococo cresce neste meio,
turvando e acidificando. É utilizado a púrpura de
bromocresol como indicador. Apresenta-se amarelado
quando ocorre o crescimento. Este meio é utilizado
juntamente com o meio de bile esculina para
identificação presuntuiva de enterococo.
Condições de cultivo
Temperatura de incubação: A estufa de estar regulada para 
36oC, para evitar atingir os 37oC, pois algumas bactérias são 
sensíveis a esta temperatura.
Além da temperatura é importante que a atmosfera da estufa 
contenha umidade e se possível CO2. 
No entanto para microrganismo anaeróbios, é necessário que se 
crie um ambiente de anaerobiose, que pode ser conseguido 
utilizando as jarras de anaerobiose.
Coprocultura
Entre os agentes que podem causar gastroenterites (infecções 
gastrointestinais) estão as bactérias. O diagnóstico é feito pela 
cultura de fezes ou coprocultura. As diarréias infecciosas são, 
ainda, a maior causa de mortalidade no mundo atual. As fontes 
mais comuns de infecção são a contaminação do leite, águas não 
- tratadas, águas paradas, alimentos contaminados. Como é 
grande a variedade de microrganismos que podem causar 
diarréia, o laboratório costuma pesquisar os agentes mais 
comuns em nosso meio: Salmonella spp., Shigella spp., alguns 
sorotipos de E. coli e Campylobacter.
A pesquisa de outros agentes, normalmente é solicitado pelo 
médico quando existe suspeita clínica. 
O diagnóstico laboratorial dos bacilos Gram negativos 
fermentadores de glicose se baseia principalmente na 
identificação de enterobactérias. O isolamento de BGN que 
não reage à oxidase não oferece muita dificuldade quando 
estamos diante de cepas bioquimicamente típicas. O 
desenvolvimento da Bacteriologia Clínica tem forçado uma 
melhor identificação dos microrganismos que não possuem um 
perfil bioquímico clássico, ou seja, não apresentam reações 
típicas a várias provas em questão. Exemplos clássicos são as 
cepas de Escherichia coli produtoras de gás sulfídrico ou ainda 
as de Salmonella fermentadoras de lactose. Nestes casos 
recomenda-se o uso de sistemas de identificação bioquímica 
mais completo. 
Para trabalhos de rotina do laboratório clínico, utilizamos 
uma chamada “série bioquímica simplificada” , que é 
suficiente para o diagnóstico da maioria das amostras de 
fezes ou de outros materiais 
Prova do indol: distingue bactérias capazes de produzir indol 
a partir de triptofano.
Prova do Vermelho de metila (VM): indica a fermentação ácida
Prova de Voges-Proskauer (VP): para verificar se a bactéria é de 
fermentação tipo butilenoglicol. Em geral,
uma bactéria VM+ será VP-, e vice-versa.
Prova do Citrato: é para verificar se uma bactéria pode se 
desenvolvem em meio de cultura que tem apenas 
citrato como fonte de carboidrato.
Prova de motilidade: para verificar se a bactéria isolada é 
flagelada ou não
Produção de gás a partir de glicose: verifica a presença de gás 
no meio.
Lactose: verifica a fermentação da lactose
Urease: verifica a produção de urease
Lisina-descarboxilase: verifica sua produção
Os organismos positivos para a decarboxilação da lisina produzem um cor violeta 
sobre o meio de cultura. Os organismos negativos para lisina produzem uma cor 
amarelada (ácida) no meio de cultura.
Produção de H2S: verifica a produção de H2S no meio
tríplice-açúcar-ferro. 
Os principais gêneros da família Enterobacteriaceae são: 
Escherichia, Shigella, Salmonella, Citrobacter, Klebsiella, 
Enterobacter, Hafnia, Proteus, Yersinia entre outros.
Testes 
bioquimicos. 
Escherichia Shigella Salmonella Citrobacter Klebsiella Enterobacter Hafnia Proteus Yersinia 
Lactose + - - D + + - - - 
Gás 
(glicose) 
+ - + + + + + + - 
H2S - - + D - - - D - 
Uréase - - - D + D - + + 
L-TD - - - - - - - + - 
Motilidade D - + + - + + + D 
Indol + D - D - - - D D 
Lisina + - + - + D + - - 
Citrato de 
simmons 
- - + + + + - D D 
 
Testes de sensibilidade aos 
antimicrobianos
“Os médicos dependem das informações do
Laboratório de Microbiologia para o tratamento das
infecções em seus pacientes.
A importância clínica do teste de sensibilidade e de
seus resultados, exigem que eles sejam realizados sob
ótimas condições por esse laboratórios e que ainda
estejam aptos a fornecer resultados de novos agentes
antimicrobianos.”
Antibiograma
Um antibiograma é um ensaio que mede a 
susceptibilidade / resistência de uma bactéria a 
um ou mais agentes antimicrobianos. Seu 
objetivo é tanto a análise do espectro de 
sensibilidade/resistência a drogas de uma 
bactéria quanto a determinação da concentração 
mínima inibitória.
Antibiograma
O Ágar de Mueller Hinton é recomendado pelo U.S. Food
and Drug Administration (FDA) e pela Organização
Mundial da Saúde (OMS) para o teste de
sensibilidade/resistência a antibióticos de bactérias Gram
positivas e Gram negativas, aeróbicas ou anaeróbicas
facultativas, comumente encontradas em alimentos e
espécimes clínicos. O teste, denominado antibiograma, é
feito utilizando-se discos de difusão antibióticos
depositados sobre a superfície do meio onde se inoculou,
por espalhamento, uma amostra de uma cultura
bacteriana previamente crescida em meio líquido.
 Inóculo - cultura pura
Procedimento
1 2
Princípio do método
Discos de antimicrobianos
Etest®