5.Núcleo Cromatina Cromossomo

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Núcleo, Cromatina e Cromossomo Adrianne Christine Palanch
UNIMEP
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Núcleo Celular - Organização
Envoltório Nuclear
Nucléolo
Matriz nuclear 
Nucleoplasma
Cromatina
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1. Envoltório Nuclear
Dupla membrana
Cisterna perinuclear
Poros 
Lâmina nuclear
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Poro nuclear - complexo do poro
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2. Nucléolo
 Responsáveis pela síntese de RNA ribossômico
DNA organizador do nucléolo Região granular
Região fibrilar
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3. Matriz Nuclear
 Estrutura fibrilar isolada após retirada de componentes solúveis do núcleo
4. Nucleoplasma
 Constituído por água, íons, aa, metabólitos, enzimas (RNA e DNA), receptores e moléculas de RNA
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O Material genético está organizado como uma massa compacta ocupando um volume limitado:
atividades devem ser realizadas dentro desses limites;
deve acomodar transições entre estados inativos e ativos. 
Compactação  interação do DNA com proteínas (histonas e não-histonas).
DNA encontra-se também associado a uma pequena quantidade de RNA.
Cargas positivas das histonas neutralizam a carga negativa do DNA.
5. Cromatina
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CROMATINA E CROMOSSOMOS
Representam 2 aspectos morfológicos e fisiológicos
 da mesma estrutura  DNA complexado com proteínas.
Cromatina (Kroma = cor)  designa, com exceção do nucléolo, toda a porção do núcleo que se cora e é visível ao microscópio óptico: 
núcleo interfásico  apresenta-se compactada e/ou descompactada;
núcleo em divisão  encontra-se altamente compactada, constituindo os cromossomos.
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NÚCLEO INTERFÁSICO CROMATINA
Eucromatina  encontra-se frouxa, dispersa pelo núcleo e difusamente corada:
genes podem se expressar ou não.
Heterocromatina  altamente condensada ao longo de todo o ciclo celular (regiões de coloração escura):
constitutiva  sempre inativa e condensada:
DNA repetitivo (maior parte).
facultativa  pode existir tanto na forma geneticamente ativa (descondensada) quanto na forma inativa (condensada):
não é transcrita e replica-se tardiamente na fase S da intérfase.
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Cromatina
Compactação do DNA 1,8 m de DNA em 6 mm de núcleo.
Mudanças no estado de compactação têm influência na atividade dos genes.
Complexo DNA + Proteínas = cromatina
Proteínas que participam da cromatina - Histonas
Proteínas com carga + presentes em altas quantidades.
H1 - H2A - H2B - H3 - H4
Nucleosomo 200 pb + histonas
Proteínas não histonas
Regulatórias, polimerases, etc.
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HISTONAS
Forte caráter básico  ricas em arginina e lisina.
5 tipos  H1, H2A, H2B, H3 e H4: 
classificadas de acordo com o teor de lisina e/ou arginina.
H2A, H2B, H3 e H4  menores (de 102 a 135 aminoácidos)  evolutivamente muito conservadas.
H1  ~220 aminoácidos  menor grau de conservação evolutiva:
mostram  variações entre as diferentes espécies e em diferentes tecidos de uma mesma espécie.
Apresentam uma região globular localizada entre duas regiões filamentosas:
aminoácidos básicos  região N-terminal
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Nucleossomo
Unidade estrutural básica da cromatina:
DNA de ligação.
Fibra de 300Å.
Histona H1 é importante.
Cromatina é compactada em uma solenóide contendo 6 nucleossomos.
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Nucleossomo: primeiro nível de compactação
Composto de histonas e DNA
Duas voltas de DNA ao redor das histonas
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NÚCLEO INTERFÁSICO
NÍVEIS DE COMPACTAÇÃO DA CROMATINA
Dois tipos de fibras:
nucleofilamento  fibra de 10 nm;
1° nível de compactação da cromatina;
10% da cromatina que contém genes ativamente transcritos.
solenóide  fibra de 30 nm:
2° nível de compactação da cromatina;
maioria da cromatina que contém genes ativamente transcritos.
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CROMATINA
NÍVEIS DE COMPACTAÇÃO
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PROTEÍNAS NÃO-HISTÔNICAS
Grupo muito heterogêneo  inclui todas as proteínas nucleares não-histônicas.
Podem encontra-se ligadas ao DNA ou dispersas no nucleoplasma:
muitas são ácidas.
	Atividades funcionais:
proteínas que participam da estrutura do cromossomo:
mais de 30 proteínas que colaboram na disposição e compactação do DNA nos cromossomos;
proteínas relacionadas com os processos de transcrição, replicação e reparo do DNA:
RNA-polimerase, DNA-polimerases, helicase, topoisomerases;
proteínas que participam do processo de ativação repressão gênica.
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COMPACTAÇÃO E DESCOMPACTAÇÃO DA CROMATINA
Cromatina flexível  compactação ou descompactação:
modificação das histonas; 
metilação do DNA.
Modificação das Histonas:
conduz a uma modificação da carga eletrostática das histonas:
influi na conformação da cromatina
alteração da interação com o DNA.
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MODIFICAÇÃO DAS HISTONAS
Metilação/desacetilação/fosforilação: 
inibição da transcrição
Desmetilação/acetilação e ubiquitinação:
ativação da transcrição
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ACETILAÇÃO/DESACETILAÇÃO DE HISTONAS
Adição/remoção de radicais acetila (COCH3) nas histonas H2A, H2B, H3 e H4:
adição: reduz a carga positiva das histonas, reduzindo a interação eletrostática com o DNA:
favorece a transcrição.
remoção: aumenta a carga positiva das histonas, aumentando a interação eletrostática com o DNA:
inibe a transcrição.
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METILAÇÃO DE HISTONAS	
Adição de radical metil (CH3) nos resíduos de lisina e/ou arginina das histonas H3 e H4:
realizada por metiltransferases;
media o silenciamento da transcrição em locais de heterocromatina;
afeta a regulação da transcrição em loci de eucromatina.
 
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UBIQUITINAÇÃO DE HISTONAS
Envolve a adição da proteína ubiquitina às histonas H2A e H2B.
Ubiquitina  proteína não-histônica ácida:
reduz o caráter básico das histonas H2A e H2B, levando a alterações estruturais nos nucleossomos;
DNA que envolve o octâmero fica mais acessível à RNA-polimerase.
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FOSFORILAÇÃO DE HISTONAS
Adição de grupamentos fosfato
( PO4) a resíduos de serina, treonina ou tirosina: 
realizada por enzimas quinases.
Aumento da fosforilação de H1 durante a prófase:
condensação cromossômica.
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METILAÇÃO DO DNA
Processo epigenético muito abordado. 
Ocorre somente na base citosina  ilhas CpG (dinucleotídeos CG).
Journal of Molecular Cell Biology (2011), 3, 51–58 |
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A METILAÇÃO DO DNA INATIVA OS GENES
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Histórico
1879 – primeiras observações de cromossomos mitóticos
1923 – pensava-se que os seres humanos possuíam 48 cromossomos
1955 – técnica do choque hipotônico:  46 cromossomos
Cromossomos
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Cromossomos
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CROMOSSOMOS
Estrutura funcional:
centrômero;
telômeros;
origens de replicação.
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Visualização dos cromossomos na metáfase
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Áreas de Atuação
Saúde – Monitoramento clínico, genética de populações, polimorfismos, diagnóstico de síndromes e outras alterações
Ambiente – Monitoramento ambiental (fatores poluentes), genética de populações, polimorfismos, biomarcadores
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Citogenética 
Molecular
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NÍVEL DE RESOLUÇÃO
p q
Cromossomo 1					3,0X109pb
		
Cromossomo X					2,5X108bp
Cromossomo 21					1,5X108bp
Uma banda					1 a 2X107bp
Fragmento clonado				5X104bp
em cosmídio
Gene						2X104bp
Exon						0,05 a 1X103bp
Nucleotídeo					1bp
cos
...AG GT....
G
Citogenética X molecular
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Núcleo
	Interfase também é organizada
	Nucléolo - rDNA
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Heterocromatina condensada fica presa por uma matriz proteica ao redor da parte interna da membrana
	Base proteica: filamentos intermediários, lamina tipo A 		(nucleoplasma) e tipo B (membrana nuclear)
	Fosforilação da lamina inicia uma reorganização nuclear com a 	sua quebra em vesículas (apoptose)
Cromatina está ausente das regiões ao redor dos poros
Há ainda uma organização na eucromatina. Aparentemente genes ativos estão mais associados à base proteica. A idéia é de que nesta base proteica estão proteínas envolvidas no processo de transcrição. Os promotores parecem estar presos à matriz.
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Poro
	Diâmetro de 10 nm
	Transporte:	5000 kDa - difusão
		17000 kDa - 2 min. p/ equilíbrio
		44000 kDa - 30 min. p/ equilíbrio
		60000
kDa - não entra por difusão
	Transporte ativo
		Dilatação do poro em até 26 nm
		Sinalizado por sequências de peptídeo
		Controla a direção do transporte
		A alteração do final 5’ou 3’do RNA altera o seu 		transporte
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Cromossomo Eucariótico: Estrutura e Função
Ana Luisa Miranda Vilela - www.Bioloja.com
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* As histonas se ligam ao DNA graças à interação de seus radicais amino com os radicais fosfato do DNA. Nem todos os radicais fosfato estão neutralizados pelas histonas, o que confere à cromatina um caráter ácido (afinidade por corantes básicos).
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Cromossomo Eucariótico: Estrutura e Função
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Cada cromossomo contém um único duplex de DNA, compactado em uma fibra que se estende continuamente ao longo de todo o cromossomo. Assim, no que diz respeito à cromatina interfásica e ao cromossomo mitótico, podemos explicar a compactação de uma molécula de DNA única e extremamente longa, em uma forma na qual pode ser transcrita e replicada e também ser ciclicamente mais ou menos comprimida.
A disposição da cromatina dentro do núcleo e o seu grau de condensação variam de um tipo celular para outro (são característicos de cada tipo celular). Além disso, a mesma célula pode apresentar a cromatina com vários graus de condensação, de acordo com o estágio funcional e com o estado de diferenciação em que se encontra.
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Cromossomo Eucariótico: Estrutura e Função
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Os genes localizados na eucromatina podem se expressar ou não, dependendo do tipo celular e de suas necessidades metabólicas. Existem pelo menos duas formas de eucromatina: cerca de 10% na forma de cromatina ativa, que é menos condensada, e o restante na forma de cromatina inativa, que é mais condensada. A heterocromatina constitutiva está sempre condensada. Consiste, na maior parte, de DNA repetitivo e é encontrada nos centrômeros e ao redor deles e em algumas outras regiões. Ela passa pelo ciclo celular com poucas mudanças no seu grau de condensação. Forma uma série de massas discretas, mas, freqüentemente, as diversas regiões de cromatina agregam-se em um cromocentro densamente corado.
A heterocromatina facultativa pode existir tanto na forma geneticamente ativa (descondensada) quanto na forma inativa (condensada), como no caso da inativação do cromossomo X em mamíferos.
A mesma fibra cromatínica pode apresentar regiões eucromáticas contínuas com regiões heterocromáticas. Assim, o material genético é organizado de modo que diferentes estados de compactação sejam mantidos lado a lado, possibilitando a ocorrência de alterações cíclicas no nível de compactação da cromatina entre a intérfase e a divisão, e entre as diferentes fases da vida da célula.
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Cromatina - complexo formado pelo DNA e proteínas que auxiliam a sua compactação. Proteínas - histonas
Histonas
Proteínas não histonas
	não participam da estrutura da cromatina
	o enovelamento ao redor das histonas facilita o acesso de outras 	proteínas ao DNA, mas apenas 1 lado do DNA fica disponível
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Cromossomo Eucariótico: Estrutura e Função
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As histonas H3 e H4 apresentam seqüências idênticas em organismos tão distintos quanto a ervilha e o boi, sugerindo que elas desempenham funções idênticas em todos os eucariontes. Os tipos H2A e H2B possuem também seqüências idênticas, com algumas variações espécie-específicas.
Em alguns tecidos, a H1 é substituída por histonas especiais. Por exemplo, em eritrócitos nucleados de aves, a histona H5 é encontrada em substituição à H1.
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Próxima ordem de grandeza na organização - Fibra de 300A
	
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Nucleosomo - Participam histonas H2A, H2B, H3 e H4, 2 mol de cada
Proteínas não histonas
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Cromossomo Eucariótico: Estrutura e Função
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Dois tipos de fibras cromatínicas são encontradas no núcleo interfásico: a fibra de 10 nm de diâmetro ou nucleofilamento e a fibra de 30 nm ou solenóide.
A fibra de 10 nm constitui o primeiro nível de compactação da cromatina e é formada pela associação de nucleossomos adjacentes. A organização dessa fibra depende da interação entre as histonas H1 de nucleossomos vizinhos. A histona H1 de um nucleossomo liga-se através de sua extremidade amino-terminal, à extremidade carboxi-terminal da H1 do nucleossomo adjacente, em um arranjo “cabeça-cauda”. Com essa organização, o DNA de ligação não é mais observado na fibra de 10 nm.
A fibra de 30 nm constitui o segundo nível de organização da cromatina e é formada pelo enovelamento da fibra de 10 nm em uma estrutura helicoidal. Cada volta da espiral contém 6 nucleossomos organizados radialmente, ficando a histona H1 localizada no interior da fibra. A histona H1, juntamente com íons Mg2+ em concentração adequada, tem papel preponderante na formação e estabilização dessa fibra.
Durante a intérfase, a cromatina que contém os genes ativamente transcritos é formada, em sua maioria, por fibras de 30 nm, enquanto cerca de 10% estão na forma de fibras de 10 nm, permitindo o acesso às enzimas envolvidas na transcrição.
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Cromossomo Eucariótico: Estrutura e Função
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Ainda no núcleo interfásico, as fibras de 30 nm podem se organizar em grandes alças que se prendem ao envoltório nuclear através da lâmina nuclear. Cerca de 10% da cromatina interfásica também se encontra em um estado altamente condensado – a heterocromatina.
Níveis superiores de compactação da cromatina parecem envolver, principalmente, as proteínas não-histônicas. A histona H1 parece, no máximo, participar também do processo de compactação, uma vez que a sua fosforilação, durante a prófase, determina a condensação dos cromossomos.
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Cromossomo Eucariótico: Estrutura e Função
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As histonas são suscetíveis a uma grande variedade de modificações pós-traducionais, tais como acetilação, fosforilação, metilação e ubiquitinação. A maioria dessas modificações acontece no domínio N-terminal das histonas, que é rico nos aminoácidos básicos lisina e arginina (mas também podem ocorrer nos domínios globulares). 
Enzimas como a acetiltransferase, as quinases e as metiltransferases, que depositam marcadores químicos nas histonas (acetil, fosfato e metil, respectivamente), são reguladores importantes da atividade gênica, da dinâmica dos cromossomos, da regulação do ciclo celular e da organização do genoma. 
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Cromossomo Eucariótico: Estrutura e Função
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Em 1993, Alan Wolffe mostrou que acetilases/desacetilases formam complexos com fatores de transcrição que ligam/desligam os genes.
Em 1998 Adrian Bird et al. mostraram que as desacetilases podem funcionar em conjunto com metilases: se a desacetilase for inibida, a metilação não inativa os genes.
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Cromossomo Eucariótico: Estrutura e Função
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In vivo, os resíduos de lisina podem ser mono, di ou trimetilados, enquanto os de arginina, mono ou bimetilados.
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Cromossomo Eucariótico: Estrutura e Função
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Cromossomo Eucariótico: Estrutura e Função
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O grupo fosfato é fortemente negativo, então sua adição induz forças na cadeia protéica que podem levar a uma radical alteração em sua conformação. Desse modo, uma proteína pode expor os aminoácidos antes escondidos em seu centro e mudar muito suas característica. Por exemplo, uma proteína apolar e hidrofóbica pode se tornar polar e hidrofílica.
A desfosforilação é realizada pelas fosfatases. 
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Cromossomo Eucariótico: Estrutura e Função
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Cromossomo Eucariótico: Estrutura e Função
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Cromossomo Eucariótico: Estrutura e Função
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Os cromossomos normais têm um só centrômero, o qual é visto ao miscroscópio como uma constrição primária, a região em que as cromátides-irmãs estão unidas. O centrômero é essencial para a segregação durante a divisão celular. 
Funções:
ponto de ligação das fibras de microtúbulos durante a divisão celular;
ponto de reunião de cromátides-irmãs;
motor mecano-químico responsável pelo movimento dos cromossomos para os pólos da célula e conclusão da divisão celular.
Durante a prófase tardia, um par de cinetócoros forma-se em cada centrômero, cada um ligado a uma das cromátides-irmãs. Múltiplos microtúbulos ligam-se a cada cinetócoro, ligando o centrômero de um cromossomo aos dois pólos do fuso. Os cinetócoros desempenham um papel fundamental nesse processo, controlando a reunião e a separação dos microtúbulos acoplados e, por meio da presença de moléculas motoras, dirigindo o movimento cromossômico.
Os telômeros são estruturas especializadas, constituídas por DNA repetitivo (repetições em tandem ou agrupadas) e proteína, que cobrem as extremidades dos cromossomos eucarióticos. 
Funções prováveis: 
manter a integridade estrutural do cromossomo: se um telômero for perdido, a extremidade cromossômica resultante fica instável, tendendo a fundir-se com as extremidades de outros cromossomos quebrados ou envolver-se em eventos de recombinação ou ser degradada.
garantir a replicação completa das extremidades codificadoras dos cromossomos: durante a replicação do DNA, a síntese da fita atrasada é descontínua e requer a presença de algum DNA à frente para um primer de RNA.
auxiliar o estabelecimento da arquitetura tridimencional do núcleo e/ou do pareamento cromossômico: as extremidades dos cromossomos parecem estar ligadas à membrana nuclear, sugerindo que os telômeros auxiliam no posicionamento dos cromossomos.
auxiliar no reconhecimento entre cromossomos homólogos para pareamento na meiose.
Origens de replicação: necessárias para que ocorra a replicação do DNA na fase S da intérfase. São seqüências de DNA cis-ativas, situadas próximas aos pontos onde a síntese de DNA é iniciada, que controlam o início da replicação. Nos eucariotos existem várias origens da replicação (replicadores) autônomas (ARS – autonomously replicating sequences) ao longo de uma única molécula (para cada origem, duas forquilhas de replicação bidirecionais).