Cromatografia

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UESC- UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ 
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLÓGICAS 
 
 
 
 
 
 
CROMATOGRAFIA 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
ILHÉUS-BAHIA 
2015 
 
 
 
 
 
UESC- UNIVERSIDADE ESTADUAL DE SANTA CRUZ 
DEPARTAMENTO DE CIÊNCIAS EXATAS E TECNOLÓGICAS 
QUÍMICA BACHARELADO 
 
 
 
 
 
 
CROMATOGRAFIA 
 
 
 
Relatório apresentado como parte dos critérios 
de avaliação da disciplina de Química Orgânica II, 
realizado pelas discentes Ellen Reis Silva e 
Talyta Silva Prado. Professor: Reinaldo Gramacho. 
 
 
 
 
ILHÉUS-BAHIA 
2015 
 
 
 
 
 
1.RESUMO 
 A cromatografia é uma técnica de separação baseada na distribuição dos 
componentes de uma mistura entre um fluido (fase móvel ou eluente) e um adsorvente 
(fase estacionária). A fase estacionária pode ser um sólido ou um líquido depositado 
num sólido inerte, empacotado numa coluna ou espalhado por uma superfície 
formando uma camada fina. Nesse processo a fase móvel induz a mistura através de 
uma fase estacionária, onde solventes polares atraem componentes polares, e 
solventes apolares atraem componentes apolares. Esta técnica é muito útil no mundo 
científico, ela pode ser realizada mediante vários processos, dentre eles: a 
cromatografia em papel, em coluna e também em camada delgada (CCD). 
 
 
 
 
 
 
 
 
2. INTRODUÇÃO 
 Até meados do século XX, as separações analíticas eram, em grande parte, 
realizadas usando métodos clássicos como a precipitação, destilação e extração. Hoje, 
contudo, as separações analíticas são mais comumente feitas por cromatografia e 
eletroforese, particularmente em amostras complexas e que contenham muitos 
componentes. 
Segundo Vogel, a cromatografia é uma técnica de separação especialmente 
adequada para ilustrar conceitos de interações intermoleculares, polaridade e 
propriedades de funções orgânicas com uma abordagem ilustrativa e relevante. É por 
este motivo, que a mesma permite também a determinação e identificação de diversos 
componentes muito semelhantes de misturas complexas, as quais se realizadas 
utilizando-se de outros métodos, muitas dessas separações seriam impossíveis. 
 A técnica foi descoberta pelo botânico italiano Mikahail Tswettn em 1906. 
Tswettn desenvolveu vários trabalhos experimentais no domínio da separação de 
extratos de plantas por adsorção diferencial em colunas, usando carbonato de cálcio 
como fase estacionária e di-sulfureto de carbono como eluente. Nestas experiências, 
verificou-se a formação de bandas de cores diferentes nas colunas utilizadas devido à 
adsorção diferencial dos pigmentos corados, que percolavam com velocidades 
diferentes e emergiam separadamente da coluna, assim, a esse gradiente deu-se o 
nome de cromatograma. (STROBEL, 1973) 
Uma das técnicas mais sensíveis de separação de misturas, a cromatografia se 
destaca entre as demais técnicas por ser muito barata e por fornecer informações 
qualitativas e quantitativas, sendo amplamente utilizada em laboratórios forenses, ou 
para comparar amostras de fluidos, por produtores de alimentos que necessitam testar 
a qualidade dos produtos ou até em Marte, para buscar evidências de vida. (HARRIS, 
2002) 
 A cromatografia pode ser realizada por diversos processos, dentre eles 
destacam-se: a técnica em papel, em coluna e em camada delgada. 
 
 
 
 
Segundo Strobel, a cromatografia em papel (CP) é uma técnica de partição líquido–
líquido, estando um deles fixado a um suporte sólido (figura 1). Baseia-se na diferença 
de solubilidade das substâncias em questão entre duas fases imiscíveis, sendo 
geralmente a água um dos líquidos. O solvente é saturado em água e a partição se dá 
devido à presença de água em celulose (papel de filtro). Este método, embora menos 
eficiente que a CCD, é muito útil para a separação de compostos polares, sendo 
largamente usado em bioquímica. A cromatografia em camada delgada (CCD) é uma 
técnica de adsorção líquido–sólido. Nesse caso, a separação se dá pela diferença de 
afinidade dos componentes de uma mistura pela fase estacionária. Por ser um método 
simples, rápido, visual e econômico, a CCD é a técnica predominantemente escolhida 
para o acompanhamento de reações orgânicas, sendo também muito utilizada para a 
purificação de substâncias e para a identificação de frações coletadas em 
cromatografia líquida clássica. 
 
 
 
 
 
 
O parâmetro mais importante a ser considerado em CCD é o fator de retenção 
(Rf), o qual é a razão entre a distância percorrida pela substância em questão e a 
distância percorrida pela fase móvel (figura 2). A sílica gel é a fase estacionária mais 
utilizada, sendo seguida pela alumina, pela terra diatomácea e pela celulose. Para a 
preparação das placas, faz-se uma suspensão do adsorvente em água, sendo a 
mesma depositada sobre a placa manualmente ou com o auxílio de um espalhador. 
Após a deposição, deixa-se a placa secar ao ar. A etapa final da preparação da placa é 
sua ativação, a sílica, por exemplo, é ativada a 105-110 °C por 30 a 60 minutos. 
(CHAVES, 1997) 
Figura 1: Fases da cromatografia em papel 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
A cromatografia em coluna consiste em uma coluna de vidro, metal ou plástico, 
preenchida com um adsorvente adequado. O adsorvente pode ser colocado na coluna 
diretamente (seco) ou suspendido em um solvente adequado (geralmente o próprio 
eluente a ser usado no processo de separação). De acordo com Collins, os principais 
adsorventes normalmente utilizados são a sílica gel, a alumina, o carbonato de cálcio, o 
óxido de magnésio, o carvão ativado, a sacarose e o amido, entre outros. A substância 
a ser separada ou analisada é colocada na coluna pela parte superior e o eluente é 
vertido após, em quantidade suficiente para promover a separação. A coluna pode ser 
um simples tubo de vidro, aberto em ambas as extremidades, ou semelhante a uma 
bureta (figura 3). Em alguns casos aplica-se vácuo pela parte inferior da coluna ou uma 
ligeira sobpressão pela parte superior da mesma. Quando a amostra a ser 
cromatografada possui cor, pode-se visualizar as diferentes zonas coloridas descendo 
pela coluna, que são recolhidas, separadamente, pela extremidade inferior. 
Assim, este relatório tem como objetivo o aprendizado ás técnicas de 
cromatografia, realizando a separação, identificação e purificação de uma mistura de 
compostos orgânicos. 
 
 
 
 
Figura 2: Esquematização de um cromatograma obtido por CCD. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Figura 3: Ilustração de uma coluna cromatográfica 
 
 
 
 
3. MATERIAIS E MÉTODOS 
 
3.1. Cromatografia em camada delgada (CCD) 
 Em uma placa cromatográfica previamente preparada fez-se um “spot” da 
substancia A (azul), da substancia B (laranja) e da substancia C (marrom), deixando o 
solvente evaporar. 
 Em seguida, transferiu-se essa placa para uma cuba de vidro contendo uma 
pequena quantidade de etanol absoluto, quantidade esta que não ultrapassasse a 
altura dos “spots”, seguindo da eluição da placa cromatográfica. 
 Inseriu-se dentro da cuba, um pedaço de papel de filtro, apoiado em uma das 
paredes, localizada atrás da placa. Tampou-se a cuba, até que fosse concluída a 
eluição. Depois da eluição, retirou-se a placa e a deixou secar a temperatura ambiente. 
Por fim, se mediu o Rf , em cm, com a ajuda de uma régua para cada substancia. 
 
3.2 Cromatografia em coluna 
 Inicialmente, lavou-se a colunacromatográfica (bureta), com acetona e a deixou 
secar completamente. 
 Em seguida, colocou-se na extremidade inferior, logo acima da torneira, um 
pequeno chumaço de algodão seco, levemente compactado. Daí , pensou-se 4g de 
sílica em gel em um béquer de 50 mL e adicionou ao mesmo um volume de 10 mL de 
Hexano, até cobrir toda a sílica. 
 Após a homogeneização da mistura, a mesma foi transferida para a coluna 
esperando-a decantar. Posteriormente, empacotou-se a coluna passando 25 mL da 
mistura hexano/etanol, numa proporção de 1:1, recolhendo a mistura em um 
erlenmeyer. 
 Após, adicionou-se com cuidado, a mistura a ser separada, colocando em 
seguida, outro chumaço de algodão logo acima da mistura. 
 
 
 
 
 Acrescentou-se um volume correspondente a 10 mL de etanol, de forma a não 
permitir a secura da coluna. 
 
 Assim, frações foram coletadas em erlenmeyers até um volume próximo de 10 mL, 
numa quantidade de 4 erlenmeyers. Por fim, adicionou-se 20 mL da mistura de 
etanol/acido acético, numa proporção de 1:1, recolhendo também frações, de 10 mL 
aproximadamente, em erlenmeyers, até a secura total da bureta. Observaram-se as 
separações 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 
4.1. Cromatografia em camada delgada (CCD): 
 A cromatografia é utilizada como um processo de análise para separar, identificar e 
até mesmo purificar tanto substâncias inorgânicas quanto orgânicas, usando como 
parâmetro a velocidade que essas substâncias se movem por uma fase estacionária, 
nesse caso a fase estacionária utilizada foi a sílica. 
Ao adicionarmos a camada delgada de sílica, já com os “spots” das substâncias 
desejadas (substâncias A,B e C), a uma cuba de vidro contendo cerca de 10mL etanol 
absoluto e fecharmos a cuba notou-se o início da eluição da substância B, que 
apresentou uma cor alaranjada, em seguida a substância C também começou a eluir, 
mais lentamente que a substânica B, apresentando uma cor azulada. Já a substância 
A não apresentava eluição. 
Após algum tempo a eluição começou a ficar mais rápida e efetiva nas substâncias B e 
C ( a substância C se tornou amarelada), enquanto a substância A apresentou apenas 
uma eluição mínima, quase que insignificante. 
Ao término da eluição pudemos concluir que a substância A seria a mais polar, por não 
eluir praticamente nada com o etanol. A substância B seria a substância menos polar 
entre as três, pois acompanhou a eluição do etanol, apresentando uma cor alaranjada. 
A substância C teria uma polaridade intermediária, pois apesar de ter se apresentado 
azul no início da eluição, ao fim da mesma apresentava uma coloração amarelada. 
Os fatores de retenção (Rf) apresentados foram: 
RfA = 0,4/ 4,8 = 0,08 
RfB = 3,3/ 4,9 = 0,7 
 
 
 
 
RfC = 3,6/ 4,7 = 0,8 
Acredita-se que a substância C seja uma mistura, já que possuía originalmente uma 
cor amarronzada e no decorrer do processo passou a ser azul e no final possuía uma 
coloração amarelada. 
4.2. CROMATOGRAFIA EM COLUNA: 
 Ao colocarmos a substância que desejávamos separar na coluna em contato com 
a mistura de sílica gel, hexano e hexano/etanol (1:1), notou-se a separação de “fases” 
na coluna uma que variava do laranja escuro para um laranja bastante claro, e acima 
dessa outra fase que variava do azul claro ao azul escuro. 
A primeira amostra recolhida foi de cerca 10 mL de uma solução laranja bem clara, 
quase que incolor, já a segunda amostra também de cerca de 10 mL, foi de uma 
solução laranja bastante forte, já a terceira também foi também de um laranja forte, 
porém mais fraco que o da segunda amostra, enquanto isso a quarta amostra 
apresentou uma cor laranja mais fraca, e a quinta apresentou uma coloração 
semelhante a da primeira amostra recolhida. Essa foi a última amostra alaranjada 
recolhida. 
Após o recolhimento das fases alaranjadas foi acrescentado à coluna uma mistura 
etanol/ácido acético (5%) 1:1, e foram recolhidas duas fases, a primeira possuía uma 
coloração azul escuro bem forte e a segunda amostra um azul bem fraquinho. 
A fase alaranjada interagiu mais com a fase móvel por ser apolar, por isso foi a primeira 
a ser recolhida enquanto isso a fase azulada é polar, não tendo interagido com o álcool 
sozinho, somente após ter entrado em contato com a mistura etanol/ ácido acético 
(5%) 1:1. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
5. CONCLUSÃO 
 
 Através do experimento foi possível atingir o objetivo da prática de purificar e 
separar uma mistura de compostos orgânicos, além de introduzir aos discentes a 
técnica de cromatografia. A partir do experimento também foi possível inferir a 
diferença de polaridade entre as substâncias utilizadas. 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
6. REFERÊNCIAS: 
 COLLINS, C.H.; BRAGA, G.L. e BONATO, P.S. Introdução a métodos 
cromatográficos. 5.ed. Campinas: Editora da Unicamp, 1993. 
 
 HARRIS, C Daniel. Análise Química Quantitativa 5.ed. Rio de Janeiro: LTC, 
2002 
 
 LOUGH, W.J. e CHAVES, M.H.; Análise de extratos de plantas por CCD: uma 
metodologia aplicada à disciplina “Química Orgânica”. Química Nova, v. 20, n. 5, 
p. 560-562, 1997. 
 
 
 STROBEL,Howar A.;Chemical Instrumentation: A Systematic Approach. 2. ed. 
Addsison-Wesley Publishing company, 1973 
 
 VOGEL;Análise Química Quantitativa 6.ed. Rio de Janeiro: S.A, 2002.