Técnicas de Microscopia

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Técnicas de Microscopia 
Profa Dra Luciana Pugliese 
Preparação do tecido 
• Fixação – preservação das estruturas 
– Formaldeído à 37%, ph 7,0 
• Inclusão em parafina – permite o corte 
– Desidratação até álcool absoluto 
– Clarificação – substituição do álcool por xilol 
– Parafina derretida 
• Corte em micrótomo 
• Meio de montagem 
• Coloração – mais usual hematoxilina eosina 
• Após o corte das peças e/ou biópsias este material é 
encaminhado para o setor de inclusão, onde este 
material será incluído em um bloco de parafina; 
HISTOLOGIA 
• Este bloco de parafina será cortado e um micrótomo onde 
produzirá finos cortes 
• Em banho maria estes cortes são “pescados” e colocados 
em uma lâmina 
HISTOLOGIA 
• Estas lâminas são coradas pelo método 
de H/E (Hematoxilina e Eosina) 
HISTOLOGIA 
LÂMINAS CORADAS POR H/E 
Coloração H-E 
• Eosina – corante ácido (possui carga negativa) 
• Hematoxilina – propriedades semelhantes a 
de um corante básico 
• Corantes básicos – reagem com componentes 
aniônicos  BASOFILIA 
– Grupos fosfato dos ácidos nucleicos; sulfato das 
GAGs e carboxila das proteínas 
• Corantes ácido – reagem com componentes 
catiônicos  ACIDOFILIA 
– Grupo amino ionizado das proteínas, mas não são 
tão específicos quantos os basofílicos 
 
Resolução do olho versus instrumento 
Distância entre os pontos resolvíveis 
Olho Humano 0,2 mm 
Microscópio de campo luminoso 0,2 m 
Microscópio eletrônico de Varredura 2,5 nm 
Microscópio eletrônico de Transmissão 1,0 nm 
Microscopia de força atômica 50,0 pm 
Microscopia óptica 
• Descendente direto dos microscópios - ano 1.800 
• Microscópio de LUZ COMUM 
– Fonte de luz – iluminação da amostra 
– Lente condensadora – focaliza o feixe de luz 
– Platina (ou mesa) – apoio para a amostra (muito fina) 
– Lente objetiva – capta a luz que passou pela amostra 
– Lente ocular – observação da imagem formada 
CONVENCIONAL 
CONTRASTE 
DE 
FASE 
Microscopia de Luz 
Nikon Microscópio Invertido TS100/TS100-F Nikon Modelo Eclipse E-100 
Microscópio de Contraste de Fase 
• Pequenas diferenças no índice de refração em 
diferentes parte de uma célula ou amostra de 
tecido 
Usado para: 
• Examinar células de tecidos vivos (cultura de 
células) 
• Examinar cortes semifinos +/- 0,5 m de 
tecidos incluídos em plástico 
 
Duas modificações: 
• Microscópio de interferência que permite a 
quantificação de massa tecidual 
• Microscópio de contraste de interferência 
diferencial – DIC (usando a óptica de 
Nomarski) especialmente útil para avaliar as 
propriedades de superfície das células 
Microscópio de Contraste de Fase 
Microscópio Biológico BX51 Olympus 
Light photomicrograph (Nomarski differential 
interference contrast) of mouse sperm bound 
to the ZP of an unfertilized mouse egg in vitro. 
A profile of fertilization in mammals 
Paul M. Wassarman, Luca Jovine & Eveline S. Litscher 
Nature Cell Biology 3, E59 - E64 (2001) 
• Apenas a luz dispersada pelas estruturas da 
amostra alcança a objetiva 
• Utiliza de um condensador especial 
• O campo de visão fica escuro e as pequenas 
partículas da amostra, que refletem alguma 
luz para a objetiva, aparecem brilhantes 
• Útil para examinar os cristais da urina e para 
espiroquetas (principalmente T. pallidum) 
Microscopia de Campo Escuro 
• Utiliza luz ultravioleta que leva à emissão de luz 
de uma molécula fluorescente 
• Detecção de antígenos ou anticorpos em 
procedimentos de coloração imunocitoquímica 
• Detecção de moléculas fluorescentes 
específicas injetadas em animais ou células 
como marcadores 
• Necessita de vários filtros entre a luz UV e a 
amostra para produzir luz monocromática e 
entre a amostra e a objetiva 
Microscópio de Fluorescência 
• Vizualização de uma amostra biológica em 3D 
• Principal diferença é a adição de uma abertura 
detectora (orifício) que é CONjugada com o 
ponto FOCAL da lente 
• A luz “no foco” passa para dentro do detector 
(dispositivo fotomultiplicador) e a luz “fora de 
foco” é impedida de entrar 
• Resolução de 0,2 a 0,5 m e excelente clareza 
• Usa de iluminação por laser e software para 
aquisição da imagem e reconstrução 3D 
Microscópio de Varredura Confocal 
Zeiss LSM 510 NLO Laser Scanning Confocal Microscope with Multiphoton Excitation 
The proximity between the mitochondrial network and the filamentous actin cytoskeleton was visualized by treating a culture of Indian Muntjac 
deer skin fibroblasts with MitoTracker Red CMXRos and Alexa Fluor 488 conjugated to phalloidin. The specimen was also probed with DRAQ5, a 
DNA-interactive reagent that exhibits preferential intercalation at AT base pairs. Images were recorded on a FluoView FV1000 with a 60x oil 
immersion objective using a zoom factor of 3.5 and sequential scanning with the 488-nanometer spectral line of an argon-ion laser, the 543-
nanometer line from a green helium-neon laser, and the 633-nanometer line of a red helium-neon laser. During the processing stage, the image 
channels were pseudocolored with RGB values corresponding to each of the fluorophore emission spectral profiles, with the exception of 
DRAQ5, which was pseudocolored cyan. Fonte: Olympus Fluoview – Confocal Microscopy Image Gallery 
• Microscopia de Transmissão 
• Microscopia de Varredura 
 
• Utiliza feixe de elétrons 
• Principal melhoria em relação ao microscópio 
óptico é que o comprimento de onda do feixe 
é 1/2.000 o do feixe do óptico aumentando a 
resolução em 103 
Microscopia Eletrônica 
• Pedaços de até 1 mm3fixados com glutaraldeído 
e lavagem com tetróxido de ósmio (ligação aos 
fosfolipídeos das membranas) 
• Inclusão em resina epóxi (plástica) 
• Cortes de 50 a 150 nm em navalha de diamante 
• Grades de malha de cobre revestida de plástico 
• Coloração com metal pesado 
• Captação em filme ou câmara CCD 
 
Cortes para Microscopia Eletrônica 
de Transmissão 
• Aparência tridimensional (assemelha-se à TV) 
• Amostra fixada, desidratada e coberta com 
uma película de ouro-carbono evaporada, 
montada em fragmento de alumínio 
• A varredura é realizada pelos elétrons 
refletidos a partir da superfície e os elétrons 
forçados para fora da superfície coletados por 
detectores e reprocessados para criar a 
imagem de alta resolução em 3D da superfície 
Microscopia Eletrônica de Varredura 
Microscópio Eletrônico de Transmissão, modelo TECNAI 10 (Anatomia Patológica – InCor) 
Microscópio Eletrônico de Varredura 6460LV Marca Jeol – IF-USP 
Chains of S. pyogenes on a macrophage. Copyright 2005. 
http://www.ncl.ac.uk/facilities/microscopy/index.htm Used with permission.