AULA 3_MICROSCOPIA_MICROBIOLOGIA

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13/08/2019
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MICROBIOLOGIA GERAL
Microscopia
Eliane Melo Brolazo
MIC R O S C O PIA
Microscópio ótico composto:
equipamento que produz imagens ampliadas de objetos, que 
não podem ser visualizados a olho nu.
Fornece uma imagem maior, invertida e virtual.
Ampliação/Aumento do poder de 
resolução do olho humano
MICROSCOPIA
Microscópio ótico composto:
MICROSCOPIA
RESOLUÇÃO:
Poder de fornecer imagens nítidas e diferenciáveis de dois 
pontos muito próximos. A distância mínima entre os dois 
pontos é o LIMITE DE RESOLUÇÃO. 
duas partículas separadas por 0,25 micrometros aparecerão 
individualizadas quando observadas em um microscópio com 
limite de resolução igual a 0,2 micrometros 
Se examinadas em microscópio com limite de resolução igual 
a 0,5, aparecerão como se fossem uma só partícula.
1 micrometro = 0,0001 cm (10-4 cm)
MICROSCOPIA
Poder de RESOLUÇÃO:
É limitado pelo comprimento de onda (luz visível 400 a 700 nm
e pela abertura numérica, que é o ângulo formado pela luz ao 
atravessar a objetiva (relacionado ao índice de refração do 
material (ar e vidro)
Objetiva de imersão, precisa do óleo de imersão para evitar o 
desvio da luz pelo ar entre a lâmina e a lente.
O óleo tem índice de refração próximo ao do vidro, por isso 
não há o desvio do feixe de luz
MIC R O S C O PIA
Composto por parte ótica:
Lentes objetivas: aumento de 4x, 10x,40x e 100x
Lentes oculares: aumento de 10x ou 15x
Podem ser monoculares, binoculares ou trinoculares
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MICROSCOPIA
Objetiva: Projeta a imagem do material em direção à lente 
ocular. A imagem é real (raios luminosos convergem/encontro 
dos raios luminosos) e invertida.
Ocular: Amplia imagem proveniente da lente objetiva e a 
projeta sobre a retina, tela. A imagem é direita e virtual 
(prolongamento dos raios luminosos).
Condensador: Concentra os raios luminosos, projetando um 
cone de luz em direção ao material.
Diafragma: Regula a intensidade de luz quer atravessa o 
condensador.
Espelho de face côncava: Superfície refletora, utilizada 
quando se trabalha com uma fonte de luz artificial.
MICROSCOPIA
PARTE MECÂNICA:
Base ou pé: Fornece sustentação para todo o 
equipamento.
Haste ou coluna: O deslocamento permite a 
movimentação do canhão
Tubo ou canhão: Região por onde o feixe de luz chega à 
lente ocular, proveniente da lente objetiva.
Revólver ou tambor: Peça circular giratória que permite 
a trocadas lentes objetivas.
MIC R O S C O PIA
PARTE MECÂNICA:
Parafuso macrométrico: Seu ajuste permite uma 
focalização mais grosseira do material a ser observado.
Parafuso micrométrico: Propicia uma focalização 
precisa do material, melhorando a nitidez da imagem. 
Permite a focalização do material em diferentes planos.
Platina ou mesa: Placa na qual são apoiadas as lâminas 
para observação.
Charriot: Mecanismo que permite o deslocamento da 
lâmina em várias direções sobre a platina
MICROSCOPIA
MICROSCOPIA
A potência de um microscópio é igual ao produto do 
aumento fornecido pela lente objetiva pelo aumento 
fornecido pela lente ocular.
PM = aumento da objetiva x aumento da lente ocular
Para uso objetiva 100x, utilização óleo de imersão (tem 
Índice de refração igual ao da lâmina de vidro), para 
permitir focalização neste aumento, pois ocupa o espaço 
do ar (ind. refração = do vidro)
LIMITE DE RESOLUÇÃO DOS SISTEMAS ÓPTICOS:
Olho humano 100 um
Microscópio óptico 0,25 um
Microscópio eletrônico 0,001 um
MICROSCOPIA
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MICROSCOPIA
Técnicas de Microscopia:
✓ Campo claro, a mais usada, a luz passa através da 
amostra, fazendo com que a área observada seja bem 
iluminada. O feixe de luz é então captado pela objetiva.
Usada para material à fresco (até 400x aumento) ou 
corado (aumento 1000x – objetiva imersão)
MICROSCOPIA
Técnicas de Microscopia:
✓ Campo escuro: alguns raios luminosos incidem na 
amostra e são captados pela lente objetiva, o que 
gera “figuras” luminosas em um fundo escuro. Apenas 
a luz que dispersa pelas estruturas na amostra 
alcançam a lente.
É o mesmo princípio que nos permite ver as estrelas a 
noite ou as partículas de pó no feixe de luz em um 
projetor numa sala escura.
MICROSCOPIA
Campo escuro/Aplicação: amostras com pouco contraste. Serve 
para examinar a existência de cristais na urina, visualizar 
bactérias como espiroquetas, muito finas e difíceis de corar.
Material à fresco, sem corante
Uso de um tipo especial de condensador (bloqueia parte da luz), 
capaz de fazer com que somente os raios luminosos que atingirem 
um objeto na lâmina entrem na objetiva.
MICROSCOPIA
✓ Contraste de Fases
Adaptação do microscópio ótico, utiliza um sistema de lentes e 
condensador que transforma diferenças de densidade (e índices 
de refração) em diferenças de intensidade da luz (brilho) 
A luz atravessa diferentes quantidades de matéria, o que gera 
diferentes índices de refração.
Porções escuras da imagem correspondem a porções densas do 
espécime, porções claras da imagem correspondem a porções 
menos densas do espécime.
MICROSCOPIA
Aplicação: observação de células e tecidos não corados e 
células vivas (geralmente em cultura)
Muitas vezes, é um microscópio invertido, para acomodar o 
frasco de células em cultura
MICROSCOPIA
✓ Polarização
modificação simples do m.o., no qual um filtro polarizante
(o polarizador) é colocado entre a fonte de luz e a 
amostra, e um segundo polarizador (o analisador) entre a 
lente objetiva e a ocular. 
Esses filtros modificam a luz e são eficientes na
análise de materiais biorrefringentes (que 
produzem dupla refração). 
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MICROSCOPIA
Aplicação:
A técnica explora as propriedades ópticas para 
revelar informações detalhadas sobre a 
estrutura e composição dos materiais.
estudos de petrografia e mineralogia. 
Em materiais biológicos usa-se para o estudo de
paredes celulares, DNA, células musculares 
estriadas, espermatozoides, proteínas estruturais 
(colágeno), detecção de substâncias minerais em tecidos.
Brânquia de larva de libélula
Aumento 25x
HONORABLE MENTION
2016 PHOTOMICROGRAPHY 
COMPETITION
Marek Mis Photography
Poland
MICROSCOPIA
✓ Fluorescência
Usa a capacidade de algumas moléculas em fluorescer
(emitir luz visível) sob luz ultravioleta.
A excitação e a emissão de luz das moléculas 
fluorescentes são reguladas por filtros para promover 
cor e contraste.
Uso de diferentes corantes
para visualizar diferentes 
estruturas (imunocitoquímica) 
Tb para diferenciar células 
bacterianas viáveis de não 
viáveis 
MICROSCOPIA
Microscopia Eletrônica: (1933), utiliza no lugar do luz, 
um feixe de elétrons, que passa por um campo 
eletromagnético que, imitando a lente de um aparelho 
óptico, concentra-o sobre o objeto de estudo. 
A amostra é colocada em uma grade de fios de cobre. 
O feixe de elétrons passa por uma lente condensadora, 
atinge a amostra e prossegue por meio de lentes
projetivas e objetivas, antes de ser recolhido em uma 
tela de substância fosforescente.
A amostra é destruída no processo. 
MICROSCOPIA
Microscopia Eletrônica:
PR IN CÍPIO S D E CO LO R A ÇÃ O
✓ Coloração Simples:
O material é tratado com um só reagente, de modo todas as 
estruturas ficam coradas da mesma cor. 
Mais usados corantes básicos, pois ligam-se aos ácidos nucleícos e 
outros componentes ácidos da parede celular.
O objetivo desta coloração é permitir a visualização e observações 
sobre a dimensão, a forma e o arranjo das células microbianas.
Corantes básicos mais usados são o azul de metileno (azul), o violeta 
de cristal (roxo), a fucsina (vermelho) e o verde de malaquita 
(verde).
PRINCÍPIOS DE COLORAÇÃO
✓ Coloração diferencial:
Mais do que um corante permitindo distinguir diferentes estruturas 
e tipos de células microbianas
Permitem separar os microrganismos em grupos, pois distinguem pelo 
menos dois tipos de comportamento diferente, ou seja, 
microrganismos com características de coloração diferentes.
Servem também para corar especificamente certas estruturas 
microbianas como flagelos, endósporos, cápsula,gorduras, etc.
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PRINCÍPIOS DE COLORAÇÃO
✓ Coloração diferencial:
Os corantes atuam fixando-se seletivamente em determinadas 
estruturas celulares, conferindo a elas diferentes graus de absorção 
da luz incidente, e possibilitando a identificação de diferentes 
estruturas na mesma célula
Ex: hematoxilina e eosina, 
A hematoxilina tem atração por substâncias 
ácidas dos tecidos, como as proteínas, núcleo.
Já a eosina é ácida e cora o citoplasma, estruturas 
compostas por substâncias com caráter básico.