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* Clonagem gênica Lavras – 2016/2 * Revolução Agricultural 10000 anos atrás - Primeiros agricultores Selecionavam as melhores sementes (de interesse) para plantio. Século XXI – Selecionamos genes de interesse – inserção em genomas/ investigação e análise Domesticação – Seleção visual – Melhores genótipos permaneciam = melhores alelos permaneciam na pop. Clonagem Gênica * Transferiram o DNA de um vírus para uma bactéria, produzindo o primeiro organismo com DNA recombinado. S. Cohen e H. Boyer (1973) Materias Geneticamente Modificados * A clonagem gênica e feita pela introdução de vetores recombinantes únicos em bactérias receptoras, seguida de amplificação dessas moléculas como um resultado da tendência natural desses vetores em se replicar. Griffths , 2008 Clonagem Gênica * Sequenciamento; TECNOLOGIA DO DNA RECOMBINANTE - técnicas coletivas para obter, amplificar e manipular fragnmentos específicos de DNA. ENGENHARIA GENÉTICA - aplicação da tecnologia do DNA a problemas específicos biológicos,médicos ou agriculturais. MANIPULAÇÃO DO DNA Genômica e ômicas... Clonagem Gênica * A tecnologia do DNA recombinante tem sido usada para criar plantas geneticamente modificadas Milho geneticamente modificado: produz uma toxina que mata as pestes de insetos hoje constitui mais de 30% de todo o milho cultivado nos EUA Clonagem Gênica * Métodos para localizar seqüências especificas de DNA; Técnicas para cortar o DNA em locais precisos; Procedimentos para amplificar determinadas seqüências; Métodos para mutar e unir fragmentos de DNA para produzir seqüências desejadas; Procedimentos para transferir seqüências de DNA para células receptoras. Técnicas de DNA Recombinante Clonagem Gênica * Reconhecem e fazer cortes bifilamentares em sequências específicas de nucleotídeos nas moléculas de DNA. - Pontas Adesivas; Enzimas de Restrição Envolvida na proteção da bacteria contra infecção de DNA estranho; Endonucleases; 3,139 ER conhecidas. Clonagem Gênica Tesouras moleculares * Modo de ação de enzimas de restrição As enzimas de restrição cortam o DNA em fragmentos de tamanho manejável, e muitas delas geram pontas adesivas unifilamentares adequadas para fazer DNA recombinante. Clonagem Gênica * Figura 22: Modo de ação de enzimas de restrição. Enzyme Site Recognition Each enzyme digests (cuts) DNA at a specific sequence = restriction site; Enzymes recognize 4- or 6- base pair, palindromic sequences (eg GAATTC). Clonagem Gênica * Enzyme cuts 5’ versus 3’ overhang Generates 5’ overhang Clonagem Gênica * EcoRI Escherichia coli 5’ overhang PstI Providencia stuartii 3’ overhang 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ 5’ CTGCAG 3’ 3’ CACGTC 5’ Common Restriction Enzymes Clonagem Gênica * As enzimas de restrição fazem: cortes bifilamentares na estrutura açúcar-fosfato do DNA pontas coesivas ou adesivas Clonagem Gênica * O número de sítios de restrição está relacionado ao número de fragmentos produzidos quando o DNA é cortado por uma enzima de restrição. Clonagem Gênica * Visualização dos fragmentos de DNA Clonagem Gênica * A eletroforese em gel pode ser usada para separar moléculas de DNA com base em seu tamanho e carga elétrica. Clonagem Gênica * DNA genômico Enzima de Restrição milhões de fragmentos seqüência continua no gel (arraste) impossível visualização dos fragmentos!! Pedaço relativamente curto de DNA Enzima de restrição visualização dos fragmentos em bandas distintas em gel de eletroforese Clonagem Gênica * Precast Ready Agarose Gel Bio-Rad’s Electrophoresis Equipment Clonagem Gênica * Transferência de Southern e hibridização com sondas podem ser usadas para LOCALIZAR ALGUNS FRAGMENTOS ESPECÍFICOS em uma grande quantidade de DNA. Clonagem Gênica * Localização dos Fragmentos de DNA com a Transferência de Southern (Edwin M. Southern) e Sondas; Localizar fragmentos portadores de genes específicos SONDA Clonagem Gênica * Muitos métodos de DNA recombinante necessitam de numerosas copias de um fragmento especifico de DNA. CLONAGEM produção de copias idênticas do trecho original de DNA Inserir o fragmento em uma bactéria e deixar que ela replique o DNA. Clonagem de Genes A amplificação aproveita-se de processos genéticos procarióticos, incluindo os de transformação bacteriana, replicação de plasmideos e crescimento de bacteri6fagos * Fonte : Griffths , 2008 * Vetor de Clonagem molécula de DNA estável, replicante, a qual um fragmento de DNA exógeno pode ser ligado para introdução em uma célula. Três características de um vetor de clonagem idealizado 1 Uma origem de replicação; 2 Um ou mais marcadores selecionáveis; 3 Um ou mais sítios de restrição Clonagem Gênica * Plasmídios moléculas circulares de DNA presentes em bactérias. Ampicilina antibiótico que normalmente mata as bactérias Bactéria + pUC19 resistente O Plasmídeo pUC19 é um vetor típico de clonagem. Ele contém um grupo de sítios de restrição, e dois marcadores selecionáveis, um gene de resistência á ampicilina e um gene lacZ. * * Um fragmento exógeno de DNA pode ser inserido em um plasmídeo com o uso de: a) Clonagem de Restrição * Um fragmento exógeno de DNA pode ser inserido em um plasmideo com o uso de: b) Clonagem por Ramificação * Um fragmento exógeno de DNA pode ser inserido em um plasmideo com o uso de: c) Clonagem usando ligadores * Clonagem dentro do Plasmideo * DNA Recombinante * * O gene lacZ pode ser usado para triar bactérias contendo plasmídeos recombinantes. * * Transformação capacidade de as bactérias captarem DNA do ambiente externo. PlasPlasmídeo recombinante introduzido em uma bactéria Clonagem Gênica * Bacteriófagos vetores Fagos recombinantes são embalados em capas protéicas e adicionados em bactérias Injeção do DNA recombinante para ser replicado Clonagem Gênica * O fago λ é um efetivo vetor de clonagem * Vetor de expressão garante a transcrição e a tradução do gene exógeno inserido seqüências adicionais DNA exógeno * * Esquema simplificado da construção de um OGM. Organismo Doador ( Realiza a Função “A”) Organismo Receptor (Não realiza a função “A”) Organismo Receptor (Passa a realizar a função “A”) * O que é transgenia? É a inserção, no genoma de um organismo receptor, mediante técnicas de Engenharia Genética, de um ou mais genes obtidos de indivíduos diferentes da mesma espécie do indivíduo receptor, ou de espécie diferente. * Localização de um gene Como encontrar seqüências de DNA em uma célula a serem clonadas? CLONAR primeiro para depois encontrar * Localização de um gene Shotgun clonagem de espingarda clonar um número grande de fragmentos de DNA (um ou mais contém o DNA de interesse). Biblioteca de DNA coleção de clones contendo todo os fragmentos de DNA. * Uma biblioteca genômica contém todas as sequências de DNA encontradas no genoma de um organismo. * Uma biblioteca de cDNA contém apenas as sequências de DNA que são transcritas em mRNA. Criação de uma biblioteca de cDNA * Uma biblioteca de cDNA contém apenas as sequências de DNA que são transcritas em mRNA. Criação de uma biblioteca de cDNA * Criação de uma biblioteca de cDNA Primers de oligo(T) * Triagem de bibliotecas de DNA As bibliotecas genômicas e de cDNA podem ser triadas com uma sonda para encontrar o gene de interesse. * * Uma sonda sintética pode ser criada com base no código genético e na sequência de aa conhecido da proteína codificada pelo gene de interesse. Sonda Sintética * * No “caminhar” no cromossomo, os genes vizinhos são usados para localizar um gene de interesse. * O uso das sequências de DNA para identificar uma pessoa é chamado fingerprinting de DNA. Fingerprinting * Todas essas tecnologias em necessitam e usam da clonagem * uma enzima de restri<;ao cortara o DNA em urn con junto de fragmentos de restri.;ao determinados pelos locais dos sitios de restri<;ao. * * * * * Fonte : Griffths , 2008 *
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