Clonagem - Biomol

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Clonagem
● Um clone é uma cópia idêntica
● Células cultivadas para criar uma população de células idênticas
● O pesquisador deve cortar o gene do cromossomo maior, anexá-lo a uma
porção muito menor de DNA transportador e permitir que o microrganismo
faço muitas cópias dessa porção pra ela
● O resultado é a amplificação seleta de um determinado gene ou segmento
de DNA, facilitando seu isolamento e estudo
● Classicamente a clonagem envolve 5 procedimentos gerais:
○ Cortar o DNA-alvo em locais precisos. Endonucleases específicas de
sequência (endonucleases de restrição) fornecem as tesouras
moleculares necessárias
○ Selecionar uma pequena molécula transportadora de DNA capaz de
autorreplicação. Esses DANs são chamados de "vetores de clonagem".
São geralmente plasmídeos ou DNAs virais
○ Juntar os dois fragmentos de DNA de modo covalente. A enzima
DNA-ligase liga o vetor de clonagem e o DNA a ser clonado. Moléculas
de DNA compostas por segmentos ligados de modo covalente a partir
de duas ou mais fontes são chamadas de DNAs recombinantes
○ Transportar o DNA recombinante do tubo de ensaio para uma célula
hospedeira que irá proporcionar a maquinaria enzimática para a
replicação do DNA
○ Selecionar ou identificar as células hospedeiras que contém DNA
recombinante
● Juntos, esses métodos são chamados de tecnologia do DNA recombinante
ou engenharia genética
● Bactéria Escherichia coli - primeiro organismo utilizado para o trabalho de
DNA recombinante (célula hospedeira mais comum)
○ Possui várias vantagens: metabolismo de seu DNA (como muitos outros
de seus processos bioquímicos é bem compreendido) são bem
caracterizados; e existem técnicas para transportar o DNA
recombinante de uma célula bacteriana a outra
○ Muitos vetores de clonagem ocorrem naturalmente associados a E.
coli, como plasmídeos e bacteriófagos
● Plasmídeo
○ Molécula de DNA circular que se replica separadamente do
cromossomo hospedeiro
○ Grande variedade de plasmídeos bacterianos, ocorre naturalmente,
varia de tamanho de 5.000 a 400.000 pb.
○ As mesmas características que permitem que os plasmídeos
sobrevivam em um hospedeiro bacteriano ou eucariótico são úteis
para os biólogos moleculares desenvolverem um vetor para clonagem
de um segmento específico de DNA
○ Características úteis:
■ Origem de replicação ou ori: uma sequência onde a replicação é
iniciada por enzimas celulares. Essa sequência é necessária
para propagar o plasmídeo. Um sistema regulatório associado
limita a replicação de 10 a 20 cópias por célula
■ Genes que conferem resistência a antibióticos, permitindo a
seleção de células que contém o plasmídeo intacto ou uma
versão recombinante dele
■ Várias sequências para endonucleases de restrição, fornecendo
sítios onde o plasmídeo pode ser cortado e inserido em um DNA
exógeno
■ Pequeno tamanho
■
● A clonagem tem partes na biologia (em vetores) e na química (PCR)
● Foi o pontapé inicial da biologia molecular
● Clonagem biológica:
○ Clonagem pelo DNA recombinante
○ Pega o DNA alvo (inserto) e um DNA circular (vetor), de bactéria na
maior parte das vezes, e coloca o inserto dentro do vetor
○ Vetores de clonagem biológica
■ Plasmídeo (beta galactosidase)
■ Fago (lambda e m13)
■ YAC
■ BAC
○ YAC: levedura + cromossomos do inserto = levedura modificada
■ Produz recombinações, menos popular
○ F e R: cromossomos passados entre bactérias (R tem genes de
resistência)
○ BAC: vetor + inserto
○ Como colocar o DNA dentro do plasmídeo:
■ Eletroporação
○ A tecnologia do DNA recombinante se baseia no vetor (plasmidium) e
no DNA que se deseja estudar
○ Esta tecnologia pode ser chamada de clonagem, visto que o DNA que
se deseja vai se reproduzir com o DNA vetor
○ Atualmente se fabricam plasmodium com MCS (multiple cloning sites,
ou sítios de clonagem múltiplos). O plasmodium deve ter um gene de
resistência a antibióticos para que se possa fazer a pressão seletiva e
deve ter origem de replicação bem definida
○ Outra coisa que ele deve ter é um gene repórter, que te dá notícia que
as coisas deram certo. Um dos utilizados é a galactosidase, que
quebra a lactose em galactose e glucose. Contudo ela também quebra
um composto chamado x-gal, que ao ser quebrada dimeriza e muda
suas ligações de lugar o que dá a ela uma cor azul
○ Se eu clonei, meu DNA entrou no meio da galactosidase e a quebrou,
então a bateria não muda de cor, fica branca; se não clonei a bactéria
não se quebra e fica azul.
○ Clonagem biológica envolve um ser vivo: bactéria
● Clonagem química
○ Envolve a reação em sequência de polimerização, também conhecido
como PCR (polymerase chain reaction)
○ Etapas:
■ Separar as fitas: por desnaturação a 96°C (desnaturação =
perder a estrutura nativa)
■ Pareamento: colocar pontes de hidrogênio a 60° no mínimo
■ Duplicar (polimerizar): fazendo o dobro
○ Atualmente existem máquinas com programas que fazem PCR
automaticamente
■ São feitas duas desnaturações para se ter certeza que as fitas
foram desnaturadas
■ A polimerase faz 1 milhão de bases por minuto
○ A impureza consegue inibir a polimerização.
● Normalmente se utiliza a clonagem biológica e química juntas. Depois do
PCR, é clonado no plasmídeo, que possui todo o maquinário de correção e
etc.
● Eletroforese
○ Uma vez que a molécula de DNA tenha sido clivada em fragmentos, um
determinado fragmento de tamanho conhecido pode ser
parcialmente purificado por meio de eletroforese em gel de agarose ou
poliacrilamida ou por HPLC
○ A cromatografia líquida de alta eficiência - CLAE; em inglês: High
performance liquid chromatography, HPLC – é um método de
separação de compostos químicos em solução)
● BLOTS
○ Southern Blot: serve para ver um gene no meio da multidão
○ Migração do gene de DNA hibridizado com um radioativo e impresso
no papel
○ Northern blot: migração do gene de RNA
○ Estern Blot: mesma coisa para proteína