Aula 12 - Fundamentos de cromatografia

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UNIVERSIDADE FEDERAL UBERLÂNDIA
CAMPUS DE PATOS DE MINAS 
ENGENHARIA DE ALIMENTOS
QUÍMICA ANALÍTICA
Prof. Dra. DJENAINE DE SOUZA
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1) Introdução às separações cromatográficas;
2) Classificação da cromatografia;
3) Mecanismos de separação;
4) Teoria básica:
a) Velocidade de migração;
b) Constante de distribuição;
c) Tempo ou volume de retenção;
d) Fator de retenção;
e) Fator de separação;
f) Eficiência de separação;
g) Fatores que afetam a eficiência.
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A cromatografia surgiu em 1906 quando um botânico 
russo (Mikhael Semenovih Tswet) separou pigmentos 
de plantas em uma coluna de vidro contendo CaCO3.
éter de
petróleo
CaCO3
mistura de
pigmentos
pigmentos
separados
Cromatografia = kroma [cor] + graph [escrever]
1 –SEPARAÇÕES CROMATOGRÁFICAS
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A cromatografia é baseada na 
diferença de mobilidade de solutos 
passando por uma fase sólida. 
A + B FASE MÓVEL
Tempo de retenção
Sinal
A separação e isolamento das 
espécies é feita passando-se uma
quantidade suficiente de solvente
através da coluna para provocar o 
aparecimento de bandas ou zonas
de separação individuais que
devem sair pela extremidade
oposta da coluna, onde podem ser 
detectadas.
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CROMATOGRAFIA
PLANAR COLUNA
CENTRÍFUGA CCD
CP
CSC GASOSA
LÍQUIDA
CLÁSSICA CLAE
CG CGAR
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1 – Pela forma física do sistema cromatográfico: PLANAR e COLUNA
2 – Classificação dos métodos cromatográficos 
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* CROMATOGRAFIA EM PAPEL
* CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA
* CRHOMATHON
* CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
* CROMATOGRAFIA GASOSA 
* CROMATOGRAFIA FLUÍDO SUPERCRÍTICO
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Cromatografia em papel
• Compostos hidrossolúveis, ácidos orgânicos e 
ions metálicos
• Princípio: partição (solubilidade)
• Quantidade de amostra necessária 10-3 a 
10-6 g
• Tipos: ascendente, descendente, 
bidimensional, circular
• F.M. - Sistema de solventes
• F.E. - Água retida na celulose (papel 
Whatman)
• Métodos de detecção: físico-químicos
• Análise qualitativa: Rf (fator de retenção) 
- problema : reprodutibilidade
• Análise quantitativa: densitômetro, 
extração dos solutos
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Cromatografia em Camada Delgada
• Método rápido (20-40 min.)
• Uso de diversos agentes 
cromogênicos
• Maior sensibilidade que C.P. (10-9 g)
• Grande gama de compostos pode ser 
analisada
• Método simples e barato
• F.M. - sistema de solventes
• F.E - Adsorventes (sílica, alumína, 
celite, amido)
• Métodos de detecção: físico-químicos
• Princípio: Adsorção (polaridade)
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Tipos de adsorventes:
G- aglutinantes (gesso amido ou
talco)
H- sem aglutinante (p/ CL)
P-camada preparativa
F- contém fluorescência
R- adsorvente sem aditivo
Critérios para escolha da fase móvel:
analitos devem ser solúveis diferentemente
não deve haver reação entre analitos/FM e FM/FE
Adsorção depende:
natureza química do adsorvente
área de superfície/ tamanho da 
partícula
porosidade da partícula
-atividade --> sítios ativos
Requerimento da amostra::
detectável no cromatograma
solúvel na FM
estável à luz, oxigênio, solvente, não ser volátil
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Cromatografia em papel
Vantagens:
•técnica simples
•não requer
instrumentação sofisticada
•baixo custo
Desvantagens:
•uso limitado
•alargamento de banda-
difusão-
•pouca alternativa de 
reveladores 
Cromatografia em camada delgada
Vantagens:
•maior sensibilidade
•mais rápido
•> repetibilidade
•< difusão
•> faixa de aplicação
•reveladores reativos
•permite aquecimento
Desvantagens
•degradação de compostoslábeis 
devido á grande superfíciede 
exposição
•dificuldades na quantificação
Comparação
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Centrífuga - Chromatron
• É um tipo de cromatografia em 
camada delgada, preparativa e 
acelerada por movimento rotacional
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Cromatografia em coluna
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2 – De acordo com a fase móvel empregada:
LÍQUIDA, GASOSA e FLUÍDO SUPERCRÍTICO
Características da fase móvel:
Inerte � Não interage nem com a amostra, nem com a fase estacionária, 
apenas transporta a amostra através da coluna.
Puro � Isento de impurezas que possam contaminar a amostra, ou gerar 
ruído no sinal.
Compatível com o detector.
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DETECTOR 
É um dispositivo que indica os componentes separados pela coluna. 
Examinam continuamente o material, gerando um sinal na passagem 
de substâncias que foram separadas.
���� 3 tipos:
• Universais – geram um sinal para qualquer composto.
• Seletivos – geram um sinal apenas para compostos com determinadas 
características.
• Específicos – geram um sinal para compostos que tenham um 
determinado elemento na sua estrutura.
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3 – De acordo com a fase estacionária:
SÓLIDAS, LÍQUIDAS E QUIMICAMENTE LIGADAS
Características da fase estacionária:
• Características próximas das dos solutos a serem separados.
• Seletividade, deve ser um bom solvente diferencial dos componentes da 
amostra.
• Quimicamente inerte relativamente à amostra.
• Volatilidade baixa.
• Estabilidade térmica.
• Pouco viscoso.
• Puro.
Parafinas – apolares
Poliglicóis – polares
Poliésteres - polares
Silicones – cobrem ampla faixa de polaridade.
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4 – De acordo com o modo de separação:
ADSORÇÃO, PARTIÇÃO, TROCA IÔNICA, EXCLUSÃO ou MISTURAS 
DE MECANISMOS.
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Para que uma separação ocorra é necessário que os componentes da amostra 
apresentem mobilidades diferentes e interações diferentes com a fase móvel e 
estacionária. Existem diferentes mecanismos para que a separação ocorra, 
proporcionando técnicas cromatográficas diferentes.
1 – Cromatografia de 
adsorção: o soluto é 
adsorvido na superfície 
de uma fase 
estacionária.
2 – Cromatografia de 
partição: o soluto 
dissolvido em um líquido 
recobre a superfície de 
um suporte sólido.
3 3 3 3 –––– MECANISMOS DE SEPARAÇÃOMECANISMOS DE SEPARAÇÃOMECANISMOS DE SEPARAÇÃOMECANISMOS DE SEPARAÇÃO
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3 – Cromatografia de troca iônica: ânions são mantidos 
ligados a cátions que estão covalentemente ligados à fase 
estacionária. Resinas de troca iônica podem ser empregadas 
na fase estacionária para a atração e troca de ânions de 
interesse.
4 – Cromatografia de exclusão molecular:
pequenas moléculas penetram os poros da fase 
estacionária e moléculas grandes são excluídas.
5 – Cromatografia de afinidade: um tipo de 
molécula em uma mistura complexa é ligada 
covalentemente à fase estacionária e todas as 
outras moléculas são excluídas.
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4 4 4 4 –––– TEORIA BÁSICATEORIA BÁSICATEORIA BÁSICATEORIA BÁSICA
Velocidades de migração
Constante de distribuição
Tempo ou volume de retenção
Fator de retenção
Fator de separação
Eficiência de separação
Fatores que afetam a eficiência
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tR
tM
tR’ = tR - tM
TEMPO
SI
N
AL
tR = TEMPO DE RETENÇÃO (tempo, após a injeção da amostra, que o analito
demora para atingir o detector cromatográfico).
tM = TEMPO MORTO (tempo que a espécie não retida leva para atingir o 
detector).
tR’ = TEMPO DE RETENÇÃO AJUSTADO (tempo médio que o analito fica 
retido na fase éstacionária).
a) Tempo ou volume de retenção
3030
b) Velocidades de migração
Concentração X distância migrada
Perfis de concentração em 
diferentes tempos de migração.
B é mais retido pela coluna que A
B migra mais rapidamente.
O movimento através da coluna 
aumenta a distância entre A e B.
Alargamento dos picos e 
diminuição na eficiência de 
separação
Diferenças nas velocidades de 
migração melhoram a eficiência 
da separação.
Velocidade de migração do analito e o 
alargamento dos picos são os principais fatores 
em separações cromatográficas.
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c) Constante de distribuição (Kc)
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Numa coluna cromatográfica ocorreuma série de estágios 
independentes, nos quais acontece o equilíbrio entre o analito 
dissolvido na fase estacionária e na fase móvel
A velocidade de eluição depende das constantes de distribuição do 
analito entre as fases móvel e estacionária.
MENOR RETENÇÃO !!!
[A]móvel
Afinidade pela fase estacionária [A]estacionária
Afinidade pela fase móvel
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d) Fator de retenção (k)
constante de equilíbrio em termos da MASSA do analito em cada fase.
M
S
W
Wk ====
FATOR DE RETENÇÃO, k: razão entre as massas de analito 
contidas na fase estacionária (Ws) e na fase móvel (WM)
S
M
V
V
====ββββ
RAZÃO DE FASES, ββββ: razão entre volumes 
de estacionária (Vs) e na fase móvel (VM)
O fator de retenção k depende da constante termodinâmica 
de distribuição KC e da razão de fases ββββ da coluna.
Descreve as velocidades de migração do soluto nas colunas
m
mr
t
ttk −= Fator de retenção avaliado em função do tempo de retenção.
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e) Fator de separação
Tempo de retenção
SI
N
AL
A B
Razão entre o tempo de retenção
de 2 componentes (A e B)
t0
mA
mB
tt
tt
−
−
=α
Define a seletividade 
da separação
A retenção é 
proporcional à razão
dos coeficientes de 
partição.
A
B
K
K
=α
Quanto maior a relação dos coeficientes 
de partição entre as fases móvel e 
estacionária maior será a separação.
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f) Eficiência de separação
Considerando-se que a coluna cromatográfica é composta por uma série de 
estágios separados onde ocorre o equilíbrio entre o analito e as fases móvel 
e estacionária.
Cada “estágio” de equilíbrio é 
chamado de PRATO TEÓRICO
O número de pratos teó-ricos de uma 
coluna (N) pode ser calculado por:
Coluna mais 
eficiente
tR
wb
N
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ALTURA EQUIVALENTE A UM PRATO 
TEÓRICO (H) = “Tamanho” de cada estágio de 
equilíbrio
A eficiência da coluna cromatográfica aumenta à medida que o número 
de pratos teóricos aumenta e a altura do prato teórico diminuí. 
N
LH =
Distância migrada
N
úm
er
o
 
de
 
m
o
lé
cu
la
s
σσσσ = variância do pico. Pico tem perfil gausiano, pode-se 
considerar o formato do pico pela variância do pico.
Perfil de concentração 
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1 – Cada prato teórico tem um equilíbrio do soluto entre a 
fase móvel e a estacionária;
2 – Movimento do soluto coluna abaixo é transferência de 
equilíbrio de um prato para outro;
3 – prato teórico explica a forma gausiana do pico 
cromatográfico e suas velocidade de movimentação na 
coluna.
Capilares, L = 30 m
Empacotadas, L = 2 mDiferenças no número de pratos 
teóricos varia de centenas a 
milhares de coluna para coluna.
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g) Fatores que afetam a eficiência
1 – Velocidade do fluxo da fase móvel;
2 – Coeficientes de difusão do soluto na fase móvel;
3 – Coeficiente de difusão do soluto na fase estacionária;
4 – Fator de retenção (k);
5 – Diâmetro da partícula na fase estacionária;
6 - Espessura da camada de líquido que recobre a fase
estacionária.
A altura equivalente a um prato 
téorico (H) é função da 
velocidade linear média da fase 
móvel (u).
(A, B, C = constantes)
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A = TERMO RELACIONADO AOS MÚLTIPLOS CAMINHOS. As moléculas 
do soluto podem percorrer diferentes caminhos na fase estacionária, 
promovendo alargamento do pico cromatográfico. Depende do diâmetro das 
partículas da fase estacionária. 
B = TERMO LONGITUDINAL. As moléculas do soluto difundem na direção 
perpendicular ao fluxo. Depende do coeficiente de difusão da fase móvel e é 
inversamente proporcional ao fluxo. Vazões altas fazem com que o analito
permaneça pouco tempo em contado com fase estacionária, minimizando a 
difusão longitudinal.
C = EFEITO DOS COEFICIENTES DE TRANSFERÊNCAIA DE MASSA (Cm e 
Cs). Uma coluna cromatográfica não opera no equilíbrio, pois há um fluxo. 
Quanto mais rápido o fluxo, menor o tempo para se ter o equilíbrio do soluto 
com a fase móvel e estacionária. Aumentando o fluxo aumenta-se o efeito 
proporcional de C.
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