Métodos Cromatográficos - CQFQ

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MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS 
 
 
CROMATOGRAFIA EM CAMADA DELGADA 
Separação principalmente por adsorção (ocorre na interface entre sólido e fase móvel). Ideal que solvente que dilui 
amostra tenha baixo ponto de ebulição. Se tem espalhamento da mancha, sempre medir no ponto de maior 
intensidade. 
Apesar da CCD ser técnica de triagem e separação, também pode ser de identificação (compara Rf com literatura) e 
quantificação (extração do composto diretamente da mancha, escaneamento densimétrico com radiação 
fluorescente ou comparação da área da mancha com área do padrão), sendo útil também para monitorar reações 
químicas. Pode ser de aplicação analítica ou preparativa (vai coletar as frações separadas). 
Diferentes substâncias podem ter mesmo Rf (distância dos componentes / distância fase móvel), pq CCD tem baixa 
seletividade. 
*Métodos químicos de revelação são destrutivos. Cuidar com o Iodo, pode ser físico ou químico dependendo da 
interação. Sílica é fracamente ácida e polar. As vezes pode precisar ativar a placa aquecendo a 105 a 110 graus pra 
retirar umidade e expor grupos necessários a interação. Ideal que tenha entre 11-12% de água em peso. 
*CCD/CPI bidimensional: usa 2 fases móveis. Depois de correr a primeira e secar, gira a placa e corre com a 
outra fase móvel. 
*CCDAE: fase estacionária com partículas de tamanho uniforme (15µm), eluição é mais homogênea. Para FB, 
partículas entre 5 a 6µm. 
*CCP (cromatografia em camada sob pressão) ou OPLC: migração forçada do eluente pela fase estacionária. 
Otimização da velocidade do processo sem perda da resolução. 
 
CROMATOGRAFIA EM PAPEL 
Uso de papel de filtro de qualidade especial (fase estacionária). Tem contribuição de mecanismo de partição 
principalmente por conta do teor de intrínseco de água do papel. Útil para separar substâncias muito polares. 
 
CROMATOGRAFIA EM COLUNA 
Os tipos de cromatografia em coluna podem ser: por adsorção (líquido-sólido), por partição (líquido-líquido) ou por 
troca iônica. Coluna de diâmetro de 10-30 mm. 
 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA 
Distribuição dos componentes de uma mistura entre duas fases imiscíveis, a fase móvel líquida, e a fase estacionária 
sólida, contida em uma coluna cilíndrica. As separações são alcançadas por partição (principalmente), adsorção, 
troca iônica, exclusão por tamanho ou interações estereoquímicas. Importante para análise de substâncias não 
voláteis e termolábeis (normalmente se usam as colunas em temperatura ambiente, sendo raramente aquecidas a 
temperaturas superiores a 60°C). 
Coluna com fase estacionária extremamente empacotada. Tem alta eficiência (picos estreitos e bem definidos), 
baixo LD e pouco uso de solvente. Pode ter um gradiente de eluição ou essa pode ser isocrática (usa o mesmo 
solvente em todo o processo). 
*CLUE (ultra eficiência): partículas de 1,7 µm e 1000 bar 
*CLUAP (ultra alta pressão): fase estacionária com partículas <2µm. Aumento ainda maior da pressão (7000bar 
+ partícula 1 µm) levou ao termo UPLC. 
 
DETECTORES + USADOS EM CLAE 
 UV: compostos tem que ter cromóforos na estrutura. Em uso de gradiente de eluição, pode ocorrer 
deslocamento da linha base se as leituras são feitas em baixo comprimento de onda. Detectores de 
comprimento de onda fixo operam em um único valor, 254 nm, emitido por uma lâmpada de mercúrio de 
baixa pressão. Aqueles com comprimento de onda variável contêm uma fonte contínua de emissão, como 
uma lâmpada de deutério ou xenônio. 
 DAD (detector de arranjo de diodos): registra dados de absorvância em toda a faixa do espectro do 
ultravioleta e visível e, adicionalmente, os espectros de cada pico registrado no cromatograma. 
 DIR (detector de índice de refração): medem a diferença entre o índice de refração da fase móvel pura e da 
fase móvel contendo a substância a ser analisada. Usa para substâncias que não absorvem no ultravioleta 
ou visível. Tem baixa sensibilidade e é muito suscetível a mudanças de temperatura ambiente, pressão e 
fluxo. Não compatível com gradiente de eluição. 
 DF (detector de fluorescência): um dos mais sensíveis e seletivos. Só detecta analitos que emitem 
fluorescência (com grupos fluoróforos ou que podem ser convertidos em derivados fluorescentes). 
 Detectores potenciométricos, voltamétricos ou eletroquímicos: quantificação de substâncias que podem 
ser oxidadas ou reduzidas em um eletrodo. Esses detectores são altamente seletivos, sensíveis e seguros, 
mas requerem fases móveis livres de oxigênio e íons de metais redutíveis. 
 EM (detecção por espectrometria de massas): mede-se a razão m/z (razão massa/carga) do íon precursor de 
uma substância. O íon precursor é gerado a partir da protonação da substância (modo positivo), da 
desprotonação (modo negativo) ou, ainda, da formação de íons aduto. 
 DDLE (detector de dispersão de luz por evaporação): detecta qualquer analito menos volátil que a fase 
móvel. Pode utilizar em gradientes de eluição com alta proporção de água e com cromóforos. 
 DAPC (detector de aerossol de partículas carregadas): aplicação de descarga elétrica por agulha de metal em 
partículas secas. Mais indicado para marcadores que não absorvem no UV. 
 
CROMATOGRAFIA DE ÍONS 
Método de separação e determinação de íons utilizando cromatografia a líquido de alta eficiência (CLAE). O 
mecanismo de interação com a fase estacionária é a troca iônica. 
 
CROMATOGRAFIA GASOSA 
Baseada na diferença de distribuição de espécies de uma mistura entre duas fases não miscíveis, na qual a fase 
móvel é um gás de arraste. A CG é baseada no mecanismo de adsorção, distribuição de massa ou exclusão por 
tamanho. 
Coluna em rolo (2-50m ou 5-60m pela FB comprimento e diâmetro de 0,1-0,53 mm). Uso para compostos voláteis e 
que podem ser volatizados. Pouca amostra, rápida análise (pelas altas temperaturas e alto fluxo do gás de arraste), 
menor dispersão das bandas, mais sensível e seletivo que HPLC (pelo maior número de pratos teóricos). 
 
DETECTORES + USADOS EM CG 
 Ionização de chama: ampla faixa linear e são sensíveis à maioria dos compostos. Operam tanto com hélio 
quanto com nitrogênio para colunas empacotadas, e com hélio ou hidrogênio para colunas capilares. 
 Detectores por condutividade térmica: fio de metal aquecido localizado na corrente do gás de arraste, 
mede a diferença na condutividade térmica da corrente de gás de arraste quando passa o analito. 
Respondem a substâncias voláteis sem considerar sua estrutura; entretanto, são menos sensíveis que o 
detector por ionização de chama. 
 Ionização de chama alcalina ou detector nitrogênio-fósforo: resulta em eficiente ionização de nitrogênio 
orgânico e substâncias contendo fósforo. Seletivo com baixa resposta para hidrocarbonetos. 
 Captura de elétrons: fonte radioativa de radiação ionizante. Exibem uma resposta extremamente alta a 
compostos halogenados e a grupo nitro 
 
CROMATOGRAFIA POR FLUIDO SUPERCRÍTICO 
Uso de fluido com densidade e viscosidade entre gás e líquido. Pouco uso em CQ. 
 
 
ELETROFORESE 
*Gel: aplicação de diferença de potencial no local em que está o analito. Ocorre migração eletrocinética. Se for 
analisar analito neutro, tem que complexar com elemento carregado (normalmente surfactantes como SDS). 
Uso de altas voltagens aquece muito e danifica o gel. 
*Capilar: Analito carregado migra em tubo capilar preenchido com eletrólitos. Tem alto poder de resolução. LD 
maior que HPLC. 
*EC de Zona ou em Solução Livre: Analito carregado migra em tubo capilar preenchido com eletrólitos 
(normalmente com característica tamponante – maximiza a diferença nas mobilidades e minimiza alargamento 
das zonas) 
*CCEM (cromatografia capilar eletrocinética micelar): adição de tensoativo no eletrólito de eluição, isso leva a 
formação de micelas e a existência de um sistema bifásico (fase 1ª é eletrólito e a 2ª é a micela). Ocorre 
separação seletiva. 
 
 
 Forma mais fácil de se regularuma interação é alterando a fase móvel (NÃO é válido pra CG, já que o gás de 
arraste serve unicamente como força mecânica) 
 Fase normal: fase estacionária é + polar que fase móvel. 
 Fase reversa: fase estacionária é + apolar que fase móvel. Elui com solventes polares. 
 
EFICIÊNCIA CROMATOGRÁFICA Parâmetro relacionado 
Seletividade 
Representa capacidade da análise de não sofrer 
interferência de outros compostos. Relação 
com poder de separação e detector. 
Resolução (o quanto a técnica separa as 
manchas) e fator de seletividade α 
Sensibilidade 
Quanto maior o sinal de detecção gerado por 
uma massa, mais sensível o método. Relação 
com dispersão das bandas e detector. 
LD e número de pratos teóricos (prato é a etapa 
de equilíbrio entre fase móvel e estacionária - 
quanto + pratos [maior o número de equilíbrios, 
maior o numero de vai e volta do analito da fase 
móvel e estacionária], + eficiente o processo) 
Rapidez da 
Análise 
Envolve tamanho da coluna ou da placa, tipo e 
tamanho das partículas da fase estacionária e 
todos os outros elementos cromatográficos. 
Tempo de retenção e fator de retenção ou de 
capacidade. 
 
 
MECANISMOS DE SEPARAÇÃO 
 
Adsorção: envolvimento principalmente de pontes de hidrogênio e interações eletrostáticas. Lembrar que a fase 
móvel também vai ser adsorvida - competem pelos sítios e regulam as interações de retenção do analito. 
 
 
Partição: distribuição do analito entre 2 fases imiscíveis no estado de equilíbrio. A diferente solubilidade das fases 
que promove a partição. Fase estacionária tem uma película líquida (C8 ou C18, são apolares, retém compostos que 
possuem pelo menos 1 porção apolar capaz de se solubilizar parcialmente na fase móvel) recobrindo a parte sólida 
(normalmente sílica). Fase móvel normalmente é líquido bastante polar, como água, metanol e acetonitrila. 
 
 
 
*Troca Iônica: transferência de carga e força eletrostática são as principais forças de interação. Pode separar 
qualquer composto que possa ser ionizado ou que forme um complexo carregado (proteínas, aminoácidos, 
nucleotídeos...). Fase estacionária: sílica e vidro revestidos com polímeros e próprios polímeros de poliestireno. 
 
 
 
 
 
*Exclusão: espera-se interação mínima ou nenhuma interação entre analito e fase estacionária. Separação por 
massa molecular com uso de polímeros porosos: moléculas maiores que o poro não penetram, as menores 
penetram e fazem um “caminho mais demorado” - relação direta entre tempo de eluição e volume molecular. Tem 
limite de exclusão (ou limite mínimo de tamanho: compostos com PM < que esse limite penetram nos poros com 
mesma facilidade – não separa) e limite de permeação (ou limite máximo de tamanho: compostos com PM > que 
esse limite não entram no poro e passam direto pela porção externa – não separa). A faixa entre esses limites se 
chama de região de permeação seletiva. 
 
 
 
*Bioafinidade: fase estacionária formada por macromoléculas (proteínas, anticorpos, antígenos). Pouco uso pra CQ, 
usa mais para purificação na indústria. Interações altamente específicas. 
 
 
 
 
Gil, E. S. Controle físico químico de qualidade de medicamentos. 3ª ed. São Paulo: Pharmabooks, 2010. 
Farmacopeia Brasileira, 6ª edição.