Métodos Físicos de Análise - Cromatografia

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Perito Criminal – Polícia Federal – maio/2012
Métodos Físicos de Análise 
- CROMATOGRAFIA
Prof. Dr. Leonardo Lucchetti
Mestre e Doutor em Ciências – Química de Produtos Naturais – NPPN/UFRJ
Depto. de Química de Produtos Naturais – Farmanguinhos – Fiocruz
Docente do Programa de Pós-Graduação em Vigilância Sanitária – Instituto Nacional de Controle de Qualidade 
em Saúde – Fiocruz
Docente do Curso de Mestrado Profissional em Gestão, Pesquisa e Desenvolvimento na Indústria Farmacêutica 
– Farmanguinhos – Fiocruz
Métodos Físicos de Análise
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Conceito:
Método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura,
realizada através da distribuição desses componentes entre duas fases
(estacionária e móvel) que estão em contato íntimo.
móvel
Fases
estacionária
Gás
Líquido
Fluido supercrítico
Líquido
Sólido
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Métodos Físicos de Análise
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Métodos Físicos de Análise
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A distribuição, exclusão, partição ou adsorção seletiva dos componentes é um 
processo de equilíbrio dinâmico: as moléculas dos analitos ora estão retidas na 
fase estacionária, ora estão deslocando-se com a fase móvel
Quanto mais tenazmente uma substância interage com a fase estacionária, mais 
alta é a percentagem de moléculas que ficam retidas, o que provoca um 
retardamento em sua migração
Quanto maior interação com a fase estacionária (fe), maior será o tempo de 
retenção (tr)
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Classificação quanto à natureza da fase móvel:
(a) Cromatografia com fase gasosa (CG) – fase móvel é um gás.
(b) Cromatografia com fase líquida (CL) – fase móvel é um líquido
(c) Cromatografia com fluido supercrítico (CS) – fase móvel é um fluido
em estado supercrítico.
Os processos de separação podem ocorrer por:
- Adsorção
- Partição
- Exclusão
- Complexação (troca de íons)
- Bioafinidade
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Classificação quanto a(o) Técnica/natureza Subtipo(s)
Suporte da fase 
estacionária
Planar
Camada fina
Papel
Coluna CG, CLAE, CS
Natureza da fase móvel
Normal Fase estacionária polar
Reversa Fase estacionária apolar
Tipo de interação
Adsorção
Partição
Exclusão
Complexação (íons)
Afinidade
Objetivo da separação
Analítica
Preparativa
Pré-tratamento
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(b) Cromatografia em Coluna
Placa de 
vidro ou de 
alumínio
Coluna cromatográfica 
empacotada c/ uma fase 
estacionária
(a) Cromatografia planar
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Classificação quanto ao tipo de interação fm x fe (mecanismo de separação)
Tipo de interação Características
Adsorção Fase sólida contém adsorventes que promovem separação por 
interação eletrostática ou dipolar
Partição
Fase sólida contém um líquido que promove absorção ou partição 
dos analitos. Mecanismo baseia-se na solubilidade dos 
componentes da amostra
Exclusão Fase sólida contém poros de dimensões determinadas que 
capturam moléculas menores e excluem maiores
Complexação (troca de íons)
Fase sólida incorpora íons fixados a ela, os quais retêm contra-
íons. Íons da amostra presentes na fase móvel podem deslocar 
os contra-íons originais, fixando-se em seu lugar
Afinidade (imunoafinidade) Fase sólida incorpora receptores elaborados por antígeno ou 
anticorpo , os quais retêm analitos que tenham afinidade por ela
Afinidade (bioafinidade)
Fase sólida incorpora receptores elaborados por sistemas 
biológicos (enzimas, lecitinas), os quais retêm analitos que 
tenham afinidade por ela
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Classificação Quanto ao Tipo de Interação fm x fe (mecanismo de separação)
Interação das fases Tipo de interação Fase estacionária
(exemplos)
Adsorção Sólido-Líquido ou 
Sólido-Gás
Sílica, Alumina
Partição Líquido-Líquido ou 
Líquido-Gás
RP18 e RP8
Exclusão Molecular Permeação em Gel Sephadex® LH-20
Complexação Troca de Íons Resinas ligadas a cátions 
(NH4+) ou ânions (SO42-)
Afinidade Complexação Carbodiimida
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Mecanismo de Interação: Adsorção
O analito é adsorvido na interface 
da fm e fe. O fenômeno de retorno 
é chamado de dessorção. Os 
adsorventes possuem grupos 
ativos que promovem as atrações 
eletrostáticas ou dipolo-dipolo. 
Entre os adsorventes mais comuns 
estão a sílica e, em segundo lugar, 
a alumina (ácida, básica ou neutra)
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Mecanismo de Interação: Adsorção
As interações ocorrem nos sítios 
ativos da sílica: interação dipolo-
dipolo e eletrostática. Grupos 
polares terão maior afinidade pelo 
sítios ativos da sílica e, por isso, 
ficaram retidos no leito 
cromatográfico. A sílica poderá ser 
inativada pela presença de água.
Em fase reversa, os sítios ativos 
da sílica são ligados quimicamente 
a hidrocarbonetos (ex. RP8, 
RP18). Neste caso, alteram-se os 
mecanismos de interação (força de 
Van der Waals)
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Mecanismo de Interação: Partição
A fe é um líquido ligado a um 
suporte sólido e inerte ou nas 
paredes do tubo 
cromatográfico. O processo é 
intrafacial, ocorrendo por 
absorção ou partição. Baseia-
se nas diferenças de 
solubilidade dos componentes 
da amostra. A volta dos 
componentes à fase móvel 
depende da volatilidade (gás-
líquido) ou da solubilidade nesta 
fase (líquido-líquido)
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Mecanismo de Interação: Troca de íons
Mecanismo de Interação: Troca de íons
A fe é constituída de uma matriz onde 
são adicionados grupos funcionais 
ionizáveis. Estão disponíveis trocadores 
aniônicos (retêm ânions) que têm sítios 
ativos carregados positivamente e 
trocadores catiônicos (retêm cátions) que 
têm sítios ativos carregados 
negativamente. A fm é uma solução 
iônica que deve ter a propriedade de 
substituir os íons que estão ligados à fe.
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Mecanismo de Interação: Exclusão molecular (filtração em gel)
Exemplo: purificação de 
polissacarídeos e proteínas. As 
substâncias de mesmo tamanho 
dos poros do gel são retidas, 
enquanto que as maiores serão 
eluídas. Com isso, tem-se uma 
separação baseada no tamanho 
molecular. 
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Mecanismo de Interação: Exclusão molecular (filtração em gel)
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Mecanismo de Interação: Bioafinidade
1
2
3
4
1- A fe entra em contato 
com a fm contendo o 
analito. Somente as 
substâncias com afinidade 
pelo ligante da fe sofrerão 
interação.
2- Os demais analitos serão 
eluídos com a fm.
3- Altera-se as propriedades 
da fm (pH) para que seja 
possível eluição da 
substância desejada.
4- A matriz é recuperada 
para ser usada novamente.
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Propósitos da Cromatografia
Separação
Identificação
Quantificação
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Análise Qualitativa
- Baseadana comparação de parâmetros de retenção
- fator de retenção
- tempo de retenção
- Baseada na resposta da detecção
- forma da mancha/pico
- cor ou ausência de cor
- reações
- espectros
- especificidade do detector
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Análise Qualitativa
Relação: concentração x área do sinal (pico)
Normalização
Padrão externo
Padrão interno
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Análise Qualitativa
Normalização
- Todo componente produz um pico
- A resposta do detector é dependente apenas da concentração
Calibração externa (padrão externo)
- Solução contendo padrões de todas as substâncias a serem analisadas
- Padrões em concentrações próximas à amostra
- Condições analíticas devem ser as mesmas, inclusive o volume de injeção
Padronização interna
- Uma substância conhecida é adicionada em concentração definida em todos os padrões e nas amostras;
- Não co-elui com a amostra;
- É estável e detectado na concentração em que se encontra.
- Faz-se uma curva de calibração baseada na relação entre as áreas e concentrações do PI e da 
substância de interesse
- Contamina-se a amostra com um volume conhecido da solução estoque do padrão interno (PI)
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CROMATOGRAFIA EM CAMADA FINA
(ou DELGADA)
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(a) demonstração de um cromatograma em camada fina
(b) determinação do fator de retenção (Rf) 
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Distância de Retenção e Fator de Retenção na cromatografia planar
Parâmetros:
(a) Distância total percorrida pelo solvente (dm);
(b) Distância percorrida pela substância rosa ou 
distância de retenção (dr b);
Assim: Rf = dr b / dm
Exemplo: Se b percorrer 5 cm em um campo 
cromatográfico de 10 cm (dm);
Rf = 5/10 = 0,5 (isso quer dizer que b ficou retido 
no meio da placa, ou 50%).
dm
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Adsorventes para ccf
Silica gel
Silica gel-F (indicator de fluorescência)
Silicato de magnésio (Florisil)
Poliamidas
Amido
Alumina
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Adsorventes para ccf
Silica Gel
Polímero baseado em ligações silício-oxigênio com grupamentos hidroxila estendidos ao longo 
da matriz
Si-O-Si-O-Si-O-Si-O-Si-O-Si-(OH)x
Modo de separação: adsorção ou partição
Regra das polaridades
Ligações hidrogênio são a principal força que controla a adsorção dos grupos funcionais dos 
analitos
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Principais solventes para composição de fase móvel e ordem eluotrópica
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Revelação de cromatogramas
- olho nu (substâncias coloridas)
- câmara de revelação (lâmpada)
- 254nm
- 365nm
- reações cromogênicas
- gerais (ex. iodo, H2SO4, anisaldeído sulfúrico, NH3, etc)
- específicas (grupamentos funcionais)
- ninhidrina
- FeCl3
- orcinol sulfúrico
- etc
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CROMATOGRAFIA INSTRUMENTAL
(EM COLUNA)
Cromatografia líquida de alta eficiência
(CLAE/HPLC)
Cromatografia com fase gasosa
(CG/GC ou CGAR/HRGC)
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Termos técnicos e parâmetros para cromatografia em coluna
Parâmetros:
(a) Tempo de retenção = tR = tempo que 
a substância leva para ser eluída, a partir 
da injeção
(b) Volume Morto = volume da coluna 
cromatográfica. Calculado com base no 
TR do metano (p/CG)
(c) tR = tR – tM = tempo de retenção 
ajustado
(d) a = fator de separação = tR2 – tR1
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Volume morto = volume da fase líquida/gasosa na coluna
regra simplificada: volume morto = 65% do volume da coluna vazia
e
Termos técnicos e parâmetros para cromatografia em coluna
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Parâmetros de retenção
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Seletividade = capacidade de um sistema diferenciar dois compostos
(na CG é mais associada à coluna cromatográfica)
Desejável: α maior que 1.2
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Parâmetros de eficiência: pratos teóricos
Pratos teóricos de uma coluna = representa as
regiões de equilíbrio na coluna, como função
das interações dos analitos entre a fm e a fe.
Pode ser expresso por:
n = 16 (tR / Wb)2
Pode ser obtido tb a partir da largura na
metade do pico:
n = 5,545 (tR / Wh)2
Para se comparar uma coluna com a outra,
usa-se a altura equivalente a um prato teórico:
h = L / n
L = comprimento da coluna
h= altura equivalente a um prato teórico
Wh
Wb
Vários fatores alteram o n, incluindo: condições de 
análise, tamanho da amostra, tipo de soluto e 
comprimento da coluna. Em tese, quanto maior for o 
comprimento da coluna, maior será a eficiência, em 
termos de pratos teóricos (mais regiões de 
equilíbrio).
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Resolução
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Resolução
Medida de separação de dois picos consecutivos e traduz a eficiência da coluna 
e da fase estacionária.
Distância entre dois sinais dividido pela média das larguras das respectivas 
bases:
Rs = 2 (tr2 – tr1) / Wb1 + Wb2 
Deve-se, considerar, portanto, que o importante para a RESOLUÇÃO em 
cromatografia não é apenas a separação entre dois picos, mas também a largura 
desses picos.
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Resolução
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EXERCÍCIO
Resolução x Seletividade x Eficiência:
A =
B =
C =
C
A (1-3)
B (5-6)
C (7-8)
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Cromatografia com fase gasosa
(CG/GC ou CGAR/HRGC)
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Método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura através de 
uma fase gasosa móvel sobre um sorvente estacionário (líquido ou sólido). Foi 
dividida inicialmente em gás-líquido e gás-sólido. 
A partir da década de 80 surgiu a cromatografia com fase gasosa de alta resolução 
(CGAR) que emprega colunas capilares de alta resolução
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Cromatografia com fase gasosa: tipos
Cromatografia Gás-Sólido
FE: sólidos (sílica, carvão grafitinizado, polímeros porosos)
Princípio de retenção: adsorção, volatilidade
Cromatografia Gás-Líquido
Líquido mantido estacionário em suporte inerte
Princípio de retenção: solubilidade, volatilidade
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Cromatografia com fase gasosa: vantagens e desvantagens
� 1- Grande poder de resolução, o que possibilita a análise de amostras contendo até 
dezenas (ou centenas – CGAR) de componentes;
2- Alta sensibilidade: dependendo do tipo de amostra e do detector empregado, é 
possível analisar amostras em concentração de picogramas (10-12). Geralmente em CGAR, 
injeta-se 1ml de amostra em concentração que varia de 10 a 1000 ppm;
3- Excelente técnica paraanálise quantitativa (desde picogramas até miligramas);
4- Técnica de análise relativamente rápida.
� 1- Só pode ser empregada em substâncias voláteis e estáveis termicamente. É 
possível a derivatização para se contornar este problema;
2- Não é conveniente para aplicação em cromatografia preparativa;
3- Não é muito eficiente como técnica analítica, uma vez que necessita de técnicas 
auxiliares, como acoplamento à espectrometria de massas.
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Cromatografia com fase gasosa: gás de arraste (fase móvel)
Características:
(a) não deve interagir com a fe;
(b) deve ser barato;
(c) compatível com o tipo de detector.
Gases mais usados:
- Nitrogênio
- Hélio
- Hidrogênio
- Argônio
- Ar sintético (usado em conjunto com o detector de ionização em chama)
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Cromatografia com fase gasosa: introdução da amostra
- on-column
- split/splitless
- large volume
- headspace
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Cromatografia com fase gasosa: colunas e fase estacionária
Tipos de fases estacionárias (exemplos):
- sólida: sílica, alumina, carvão ativado
- líquida: DB-1, DB-50, OV-275.
A fase estacionária pode ser polar, de polaridade intermediária ou apolar. Podem
ser recheadas ou empacotadas (capilares);
As colunas podem variar de 1m (recheadas)
até 50m (capilares);
Geralmente, a temperatura de análise não passa
dos 350oC em CGAR.
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Cromatografia com fase gasosa: colunas e fase estacionária
*carvão ativo, silica, peneiras moleculares, polímeros porosos
** porous layer open tubular / wall coated open tubular; silicones
Parâmetro Coluna empacotada Coluna capilar
Diâmetro interno (mm) 1 - 4 0,15 - 0,75
Comprimento (m) 1 - 3 10 -100
Pratos teóricos 2400 3000
Espessura da fase estacionária (µm) 5 0,5 - 2
Vazão do gás (ml/min) 20 - 60 1- 5
Volume da amostra (µl) 02 - 20 0,001- 0,5
Flexibilidade rígida flexível
Fenômeno de separação adsorção partição
Construção Camada 
porosa/convencional*
PLOT/WCOT**
Fase estacionária sólida líquida
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Cromatografia com fase gasosa: colunas e fase estacionária
Apolar: hidrocarbonetos não aromáticos, silicones (ex.: SE-30)
Polar: contém grande quantidade de grupos polares (Ex.: Carbowax) - interações 
tipo pontes de hidrogênio
Intermediária: grupos polares ou potencialmente polares em esqueleto apolar (ex. 
SE-52)
Escolha da coluna: 
Polaridade da fase estacionária
diâmetro e espessura do filme � quantidade de amostras, tempo de análise, 
pressão (velocidade da FM), temperatura do forno
Comprimento � pratos teóricos
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Cromatografia com fase gasosa: colunas e fase estacionária
Abreviação de algumas fases estacionárias
DEGA - adipato de dietileno glicol 
DEGS - succinato de dietileno glicol
SE-30 - metil silicone
OV -11 - 35% fenil- metilsilicone
Carbowax 20 M - polietilnoglicol
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Cromatografia com fase gasosa: programação (gradiente) de temperatura
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Silicones
� Polímeros estáveis e inertes
� Menos polares: polidimetilsiloxanas
� Substituição de metilas por outros grupos (fenil, ciano, trifluoropropil etc) gera fases 
estacionárias com polaridades crescentes
Poliglicóis
• Polímeros de etileno glicol e epóxido, preparados com diferentes tamanhos da cadeia 
polimérica
• Moderadamente polares (álcoois, aldeídos, éteres etc)
• Carbowax (ex 20M = 20.000.000g/mol)
Poliésteres
• Condensação de diácidos com glicóis
• Fases altamente polares
• Mais comuns: succinato e adipato de dietilenoglicol (DEGS e DEGA, respectivamente)
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Cromatografia com fase gasosa: derivação (ou derivatização)
A técnica não é adequada para análise de açúcares, aminoácidos e oligopeptídeos, por exemplo. Para que 
essas substâncias sejam analisadas por CG necessitam ser derivatizadas.
Alguns derivatizantes
1- Trimetilsilano (TMS)
2- Diazometano (H2C=N=N)
3- Anidrido acético / piridina
4- BF3 / MeOH
5- BSTFA / piridina
AÇÚCARES AÇÚCARES ACETILADOS
(AcO)2O / piridina
ÁCIDOS CARBOXÍLICOS ÉSTERES METÍLICOS
BSTFA/piridina
ÁLCOOIS ÉTERES METÍLICOS
BF3/metanol
Exemplos:
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Cromatografia com fase gasosa: detecção
No caso de acoplamento do cromatógrafo com um espectrômetro de massas, o detector é o próprio 
espectrômetro. Os analitos deixam a coluna e entram na câmara de ionização, que está sob vácuo. As 
substâncias são ionizadas e os íons são identificados pelo espectrômetro, gerando um fragmentograma. 
Existem diferentes tipos de espectrômetros, sendo que os quadrupolos são os mais usados em CG/EM.
Em CG/EM usa-se 70 
eV para gerar os íons 
que serão analisados.
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Cromatografia com fase gasosa: detecção
- seletividade: universais x específicos
- ruídos (problemas eletrônicos, impurezas, sujeiras nos gases/detector)
- tipo de resposta (proporcionalidade à concentração do soluto ou à taxa de entrada de soluto
no detector)
- quantidade mínima detectável (gera sinais 2x mais intensos que o ruído) – característica
intrínseca do detector!)
- fator de resposta: intensidade do sinal gerado por determinadas massas de soluto, que
depende do detector e da substância analisada e pode ser visualizado como a inclinação da
reta que correlaciona o sinal com a massa do soluto (curva de calibração); quanto maior o fator,
mais confiável a análise quantitativa
- faixa linear dinâmica = razão entre a menor e a maior massa entre as quais o fator de
resposta de um detector para um soluto é constante, isto é, onde a curva de calibração é linear
(mais significativos: TCD e FID)
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Cromatografia com fase gasosa: detecção
Captura de Elétrons (DCE)
Bastante seletivo, respondendo bem para halogenetos orgânicos, aldeídos
conjugados, nitrilas, nitratos e organometálicos. Pode ser empregado para análise de
inseticidas clorados
O nitrogênio com alto grau de pureza deve ser usado.
Termoiônico (DPN)
Seletivo para compostos contendo nitrogênio e fósforo
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Cromatografia com fase gasosa: detecção
Condutividade térmica (TCD ou DCT)
A velocidade de perda de calor de um corpo quente para um frio é proporcional, dentre outros
fatores, à condutividade térmica do gás que separa estes dois corpos.
Quando um componente é eluído, ele sai misturado com o gás de arraste e passa pelo
detector. Se a condutividade desta mistura for diferente da do gás de arraste puro, o filamento
perde calor para o bloco numa taxa diferente daquela do equilíbrio.
Detector universal e sensível à concentração de soluto no gás de arraste (H2 ou He, gases de
altíssimas condutividades térmicas – assim, a mistura com o soluto sempre terá condutividade
menor e, com isso, há a geração de sinais positivos e maiores fatores de resposta).
Não é muito sensível (400pg/ml gás arraste) – barato, simples e muito aplicado a análises
que não requeiram alta sensibilidade
Resposta universal, não destrói a amostra
Fase móvel: hélio ou hidrogênio
Métodos Físicosde Análise
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Cromatografia com fase gasosa: detecção
Ionização em chama (FID ou DIC)
O funcionamento se baseia na condução de eletricidade pela chama originada pelos íons
provenientes da queima de substâncias orgânicas.
A chama de H2 forma poucos íons (mau condutor elétrico) e quase nenhuma corrente passa
pelos eletrodos – a chama passa a conduzir corrente elétrica quando uma substância orgânica é
queimada e gera íons. Esta corrente elétrica, amplificada, gera o sinal cromatográfico.
Apenas substâncias não inflamáveis (CCl4, H2O) ou algumas poucas que não formam íons
em chamas (HCOOH) não dão sinal; de um modo geral, quanto mais ligações C-H a substância
tiver, maior a resposta.
Mais sensível que o TCD: 10 a 400pg. É o mais usado.
Grande sensibilidade, resposta quase universal (não responde bem à agua)
Sensível à concentração e destrutivo.
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Cromatografia com fase gasosa: detecção
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Cromatografia líquida de alta eficiência
(HPLC ou CLAE)
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workstation
bombas para eluição 
em gradiente
injetor
coluna
detector
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Cromatografia líquida de alta eficiência: peculiaridades e características
1- Comumente chamada de cromatografia líquida de alta performance, alta pressão, alto
desempenho;
2- Capacidade de realizar separações e realizar análises qualitativas/quantitativas de um
grande número de substâncias, em poucos minutos, com alta resolução, eficiência e
sensibilidade;
3- Permite a utilização de colunas com fase normal, reversa, com resinas de troca iônica e
com polímeros que possibilitam exclusão molecular;
4- As colunas podem ser reaproveitadas;
5- Existem diversos tipos de detectores que podem ser usados em CLAE, os quais focam as
propriedades do soluto ou deste dissolvido na fase móvel;
6- O uso de bombas pneumáticas permite a aplicação de gradientes de solventes, ou seja,
mudanças na composição da fase móvel ao longo da corrida cromatográfica;
7- As bombas usadas em CLAE permitem fluxo constante, o que garante maior eficiência de
separação e, consequentemente, maior resolução.
8- A amostra deve ser solúvel na fase móvel
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Cromatografia líquida de alta eficiência: principais componentes
solventes
bomba
amostra
sistema de 
injeção
coluna detector
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Cromatografia líquida de alta eficiência: principais componentes
Métodos Físicos de Análise
Perito Criminal – Polícia Federal – maio/2012
Cromatografia líquida de alta eficiência: principais componentes
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Cromatografia líquida de alta eficiência: mecanismos de interação
1- Adsorção – Fase estacionária é um sólido (cromatografia líquido-sólido) – As condições de análise 
podem ser preestabelecidas por ccd, usando sílica gel. Ex. colunas com sílica e alumina. Solventes usados: 
os mesmos empregados para ccd, como hexano, clorofórmio, acetato de etila, metanol e misturas destes. 
Usos: ácidos graxos, álcoois, barbitúricos, corantes, esteróides.
2- Partição – Fase estacionária é um líquido (cromatografia líquido-líquido) – A fase estacionária não está
quimicamente ligada à superfície de um suporte. Ex. coluna empacotada com sílica, com adição de água e 
clorofórmio como fase móvel. A separação se dará pela partição das substâncias entre a fase aquosa e a 
orgânica. 
3- Exclusão Molecular – Fase estacionária é uma resina ou sílica com tamanho de partícula controlada –
cromatografia de exclusão. Efetua a separação de acordo com o tamanho efetivo das moléculas. As 
moléculas maiores movem-se rapidamente, enquanto que as menores (considerando-se o tamanho dos 
poros) movem-se mais lentamente com a fase móvel.
4- Troca Iônica – Fase estacionária é uma resina ligada a grupos iônicos (ânions ou cátions) –
cromatografia por troca iônica. Usos: análise de ácidos carboxílicos, analgésicos, ânions inorgânicos e 
cátions metálicos.
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Cromatografia líquida de alta eficiência: fase estacionária
Polar (fase “normal”):
Silica, alumina
Terminações ciano, amino ou diol na fase ligada
Não-polar (“fase reversa”)
Normalmente terminações C18 e C8 na fase ligada
Terminações fenil e ciano na fase ligada
Misturas de grupos funcionais podem ser usadas
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Cromatografia líquida de alta eficiência: fase estacionária
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Cromatografia líquida de alta eficiência: mecanismo (simplificado)
• Interações não polares (não específicas) do analito com a superfície hidrofóbica 
adsorvente (-C18, C8, fenil etc)
• Diferença na afinidade de sorção do analito resulta em separação
• Analitos mais polares ficam menos retidos
• Analitos com partes hidrofóbicas maiores ficam mais retidos
• Isômeros estruturais praticamente não se separam
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Cromatografia líquida de alta eficiência: efeito da composição da fm na seletividade
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 1 2 3 4 5 6 7
0
5
10
15
20
25
0 1 2 3 4 5 6 7
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
0
2
4
6
8
10
12
0 2 4 6 8 10 12
90% MeCN
80% MeCN
70% MeCN
60% MeCN
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Cromatografia líquida de alta eficiência: otimização da polaridade da fm
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Cromatografia líquida de alta eficiência: fase móvel
1- Ter alto grau de pureza (grau HPLC);
2- Dissolver a amostra sem decompor seus componentes ou a fase estacionária;
3- Ter baixa viscosidade (para não aumentar a pressão do sistema);
4- Ser compatível com o tipo de detector usado;
5- Ter polaridade adequada para permitir uma separação conveniente dos 
componentes da amostra.
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Cromatografia líquida de alta eficiência: detectores
1 – Alta sensibilidade e baixo limite de detecção
2 – Resposta rápida
3 – Insensibilidade às mudanças de temperatura e vazão de fase móvel
4 – Resposta independente da composição da fase móvel e proporcional em 
relação à concentração dos analitos
Infelizmente, não existe um só tipo de detector tão versátil. Os aparelhos 
modernos podem trabalhar com mais de um tipo de detector ao mesmo 
tempo.
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Cromatografia líquida de alta eficiência: detectores
1- Espectrofotometria no UV-VIS – absorbância na faixa do UV-VIS (limite = 2 x 10-10)
2- Fluorescência – excitação com luz produz uma fluorescência (limite = 10-12)
3- Índice de refração – mudançasno IR da fase móvel (limite = 10-7)
4- Eletroquímico – oxidação ou redução em potencial fixo (limite = 10-12)
5- Condutividade elétrica – condutividade elétrica em razão da presença de íons (limite = 10-8)
6- Espectrometria de massas – analisa os fragmentos obtidos após ionização; usado para
análise qualitativa; empregado em conjunto com o UV-vis (quantitativa).
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Cromatografia líquida de alta eficiência: detectores
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Cromatografia líquida de alta eficiência: eluição em gradiente
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Cromatografia líquida de alta eficiência: influências
1 – Que afetam a eficiência:
• Fluxo
• Comprimento da coluna
• Diâmetro da partícula
• Distribuição de tamanho de partícula
2 – Que afetam a retenção:
• Tipo de eluente
• Composição do eluente
• Tipo de fase estacionária
• Natureza do analito
3 – Que afetam a seletividade:
• Tipo de fase estacionária
• Natureza do analito
• Aditivos no eluente
• Temperature
• Composição do eluente (analitos ionizáveis)
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COMPARAÇÃO: CG X CLAE
Fator CG CLAE
Requisitos para Amostra Amostra ou derivado volátil, 
termicamente estável na 
temperatura do sistema
Amostra solúvel na fase 
móvel.
Tipo de Amostra Gases, líquidos e sólidos.
PM de 2 a 1200
Líquidos e sólidos, iônicos ou 
covalentes. PM de 32 a 
4.000.000
Limite de Detecção 10-12 (DIC ou DCE) 10-9 (UV-VIS)
Pratos Teóricos / Coluna 2.000–300.000 500–25.000
Capacidade Preparativa Pobre até razoável Boa, com facilidade de coleta 
e automação
Capacidade Analítica Excelente. Até 200 
componentes
Excelente. Até 50 
componentes.
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QUESTÕES DE CONCURSOS
1- A Cromatografia em Camada Delgada (CCD) consiste na separação dos componentes de
uma mistura através da migração diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente retido
sobre uma superfície plana. Neste contexto, assinale a alternativa que indica o adsorvente
seguramente mais utilizado em CCD nos laboratórios. (Perito Criminal – PC/ PE – 2006 –
IPAD)
A) Celulose.
B) Sílica.
C) Alumina.
D) Poliamida.
E) Silicato de cálcio.
2- Julgue CERTO OU ERRADO. (Pesquisador – Inmetro – 2007 – CESPE/ UnB).
A cromatografia é um método de separação dos componentes de uma mistura. No entanto,
não pode ser usado para misturas complexas, pois apresenta restrições na separação de
componentes muito semelhantes.
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QUESTÕES DE CONCURSOS
3- Julgue CERTO OU ERRADO. (Pesquisador – Inmetro – 2007 – CESPE/ UnB).
A classificação dos métodos apóia-se nos tipos de fases móvel e estacionária. A fase
estacionária pode ser sólida ou líquida; nesse último caso, o líquido é adsorvido ou ligado
ao sólido. A fase móvel, por sua vez, pode ser líquida, gasosa ou um fluido supercrítico.
4- Na cromatografia gasosa de partição, as interações que ocorrem entre as moléculas dos
diferentes componentes da mistura a analisar e a fase estacionária líquida são devidas,
principalmente, a forças de atração de Van der Waals e a ligações de hidrogênio.
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QUESTÕES DE CONCURSOS
PERITO CRIMINAL – NÍVEL SUPERIOR – SSP/PB - 2003 
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QUESTÕES DE CONCURSOS
PERITO CRIMINAL – NÍVEL SUPERIOR – SSP/PE - 2006 
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QUESTÕES DE CONCURSOS
PERITO CRIMINAL – NÍVEL SUPERIOR – SSP/PE - 2006 
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QUESTÕES DE CONCURSOS
57 - A separação entre dois picos em um cromatograma é definida pela sua 
resolução RS, calculada como sendo:
a) igual ao fator de separação a.
b) a razão entre o valor médio das bases dos dois picos pela distância entre os 
pontos de altura máxima dos dois picos.
c) a razão entre a distância entre os pontos de altura máxima dos dois picos pelo 
valor médio da largura das bases dos dois picos.
d) a média das alturas dos picos, dividida pelo fator de separação a.
e) a razão entre a distância entre os pontos de altura máxima dos dois picos e o 
fator de separação a.
PERITO – SSP/PR – ENG.QUÍMICA - 2007
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QUESTÕES DE CONCURSOS
PERITO – SSP/PR – ENG.QUÍMICA - 2007
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QUESTÕES DE CONCURSOS
48. Sobre a cromatografia, marque a opção verdadeira:
A) A cromatografia pode ser classificada de acordo com os mecanismos de separação física em 
cromatografia de adsorção e de partição. A de adsorção baseia-se nas diferentes solubilidades 
dos componentes da amostra.
B) Na Cromatografia em Camada Delgada a análise qualitativa de uma substância realiza-se 
através de seu Rf que se determina pela relação entre a distância percorrida pela fase móvel 
dividida pela distância percorrida pela substância.
C) A fase móvel é selecionada em função de suas polaridades; logo em ordem crescente de 
polaridade podemos citar: éter de petróleo, clorofórmio, acetona, metanol e água.
D) O processo de separação da Cromatografia em Camada Delgada está fundamentado no 
fenômeno de partição
(PERITO LEGISTA, SSP-CE, 2003)
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QUESTÕES DE CONCURSOS
49. Sobre a cromatografia gasosa, marque a opção verdadeira:
A) A cromatografia gasosa é utilizada na separação de substâncias volatilizáveis, uma vez que 
se usam temperaturas convenientes no local de injeção da amostra e na coluna, possibilitando a 
vaporização dessas substâncias.
B) A fase estacionária na cromatografia gasosa é um gás. E os gases mais usados são: 
nitrogênio, hélio, hidrogênio e argônio.
C) O Detector de captura de elétrons utilizado na Cromatografia Gasosa é seletivo para 
compostos contendo fósforo e nitrogênio como os inseticidas fosforados e nitrogenados.
D) O Detector por ionização em Chama tem uma baixa sensibilidade, sendo utilizados para 
identificação de compostos com halogênios como os inseticidas clorados.
(PERITO LEGISTA, SSP-CE, 2003)
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QUESTÕES DE CONCURSOS
55 - Em uma separação cromatográfica existe a fase móvel e a fase estacionária. A fase móvel é um solvente que fica
armazenado e necessita de tratamento preliminar para seu emprego. Esse tratamento preliminar consiste em degaseificar o
solvente para:
1. evitar a formação de bolhas de gás quando a fase móvel é despressurizada.
2. garantir a alta sensibilidade do resultado obtido por detectores ultravioleta, uma vez que o oxigênio dissolvido absorve na
região do UV entre 190 e 260 nm, alterando o resultado.
3. evitar “ruído” quando são empregados eletrodos eletroquímicos.
4. evitar interferências na adsorção das substâncias que estão sendo separadas na coluna.
Assinale a alternativa correta.
a) As afirmativas 1, 2, 3 e 4 são verdadeiras.
b) Somente as afirmativas 1 e 2 são verdadeiras.
c) Somente as afirmativas 3 e 4 são verdadeiras.
d) Somente as afirmativas 1, 2 e 3 são verdadeiras.
e) Somente as afirmativas 1, 2 e 4 são verdadeiras.
56 - Quanto ao emprego de detectores de fluorescência em cromatografia, a fase móvel interfere na emissão de
fluorescência,quando apresenta características inadequadas. Assinale a alternativa que apresenta as propriedades a
serem analisadas para seleção da fase móvel.
a) Constante dielétrica, pH, temperatura, concentração da fase móvel, viscosidade.
b) Fotodecomposição, pH, temperatura, concentração.
c) Viscosidade, densidade, pH, potencial de oxi-redução.
d) Constante dielétrica, viscosidade e fotodecomposição.
e) Densidade e constante dielétrica.
PERITO – SSP/PR – ENG.QUÍMICA - 2007
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QUESTÕES DE CONCURSOS
PF – Farmácia – 2004
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QUESTÕES DE CONCURSOS
A análise qualitativa de uma substância por cromatografia em camada delgada, realiza-se 
através do seu Rf (razão entre a distância percorrida pela substância e a distância percorrida 
pela frente da fase móvel). Esse parâmetro está relacionado com outro parâmetro nas 
cromatografias líquida e gasosa que é:
a) a altura do pico;
b) o tempo de retenção;
c) a razão entre área da substância e área do padrão interno;
d) a velocidade linear do gás de arraste;
e) a relação sinal/ruído.
(PERITO LEGISTA – TOXICOLOGIA – PF) 
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QUESTÕES DE CONCURSOS
35 - Com relação à cromatografia líquida de alta pressão (HPLC), assinale a alternativa 
correta.
a) As técnicas de cromatografia em HPLC separam apenas peptídeos.
b) Na HPLC, um solvente líquido, com uma mistura de moléculas a serem identificadas, é 
passado por uma coluna contendo resina ligada a compostos de alta afinidade.
c) Na HPLC, as esferas de resina podem ser recobertas por grupos carregados para separar 
compostos por troca iônica.
d) Em HPLC, são usados tubos de plástico ou vidro para realizar o empacotamento da resina.
e) As separações de HPLC têm resolução alta e reprodutibilidade baixa.
(PERITO – FARMÁCIA E BIOQUÍMICA – SSP/PR – 2007)
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QUESTÕES DE CONCURSOS
A cromatografia em camada delgada é a técnica de triagem mais utilizada em todos os laboratórios de toxicologia 
forense. Esta técnica permite a manipulação de variáveis importantes para detecção de compostos isolados 
da matriz orgânica. Entre essas variáveis podemos enunciar:
a) eluente, índice de refluxo e revelador;
b) adsorvente, índice de refluxo e agente cromogênico;
c) adsorvente, eluente e agente cromogênico;
d) adsorvente, eluente e gás carreador;
e) pressão de vapor e temperatura do eluente.
A cromatografia gasosa é uma técnica de separação que desde os anos 70 vem sendo cada vez mais utilizada na 
área da toxicologia forense. Entretanto, como toda técnica, ela tem limitações quanto ao seu emprego na 
fase de triagem. A princípio, para ser passível de análise por cromatografia gasosa, uma substância precisa:
a) se degradar nas temperaturas do injetor;
b) se volatilizar nas temperaturas operacionais;
c) não conter nitrogênio na estrutura química;
d) não interagir com a fase estacionária;
e) ser volátil e estável à temperatura ambiente.
A cromatografia líquida de alta eficiência é uma das técnicas empregadas nas análises toxicológicas. Indique a 
alternativa que NÃO se apresenta como vantagem na aquisição desse equipamento:
a) a boa sensibilidade;
b) a versatilidade;
c) a alta resolução;
d) os resultados qualitativos;
e) o baixo custo de aquisição do equipamento.
(PERITO LEGISTA– TOXICOLOGIA – PF)