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UNIVERSIDADE JOSÉ DO ROSÁRIO VELLANO – UNIFENAS CURSO DE FARMÁCIA DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO SIMONE SONARA OLIVEIRA SUZANA SAMARA OLIVEIRA MARCUS HENRIQUE LILIANA APª. OLIVEIRA HENRY LANOICAR PIRES MARINE BITTENCOURT PROF. KLAUBER DIVINÓPOLIS – MG 2007 ANÁLISES DE AMOSTRAS FECAIS Exame macroscópico As amostras de fezes não preservadas devem ser examinadas macroscopicamente para determinar a consistência, o odor, a cor, a presença ou ausência de sangue, de muco, de proglotes e de vermes adultos ou outras condições anormais. Consequentemente, o exame macroscópico deve sempre anteceder o exame microscópico. O material fecal varia quanto a sua consistência, e geralmente é classificado em fezes formadas, semi-formadas, pastosas ou líquidas diarrêicas. Os trofozoítos são usualmente encontrados nas fezes líquidas, nas pastosas ou nas mucosanguinolentas, enquanto que os cistos são diagnosticados nas fezes formadas ou semiformadas. Ovos e larvas de helmintos podem estar presentes em todos os tipos de amostras fecais; entretanto, eles podem ser mais dificilmente encontrados em espécimes líquidos e, se presentes, em pequeno número. As formas móveis de protozoários se degeneram mais rapidamente do que as formas císticas; por esta razão, é de extrema importância que o estudo de espécimes fecais seja realizado o mais rápido possível. A consistência das fezes não interfere na distribuição dos ovos e das larvas de helmintos, apesar de nas amostras líquidas haver uma distribuição relativa do número de ovos, devido ao fator de diluição. As fezes devem ser distribuídas no laboratório quanto a sua consistência. O material fecal líquido ou pastoso deve ser examinado primeiro, sendo seguido pelos espécimes semiformados e formados. Registrar a presença de sangue e muco nas amostras fecais, os quais podem indicar manifestações patológicas do trato gastrointestinal. O sangue oculto nas fezes pode estar relacionado com uma infecção parasitária, ou ser um resultado de outras condições anormais. A ingestão de diferentes produtos químicos, medicamentos ou alimentos pode atribuir às fezes colorações variadas. O exame macroscópico pode ser realizado pela simples observação ou pela tamização, as quais, em muitos casos, são suficientes para estabelecer um diagnóstico final. Simples Observação Examinar e revolver todo o material fecal com bastão de vidro. Anotar todas as características observadas e coletar os vermes adultos ou proglótes de tênias dejetadas. FiG 1. Distribuição de cistos e trofozoitas em relação à consistência do material fecal. Tamisação Emulsionar as fezes com água. Coar a emulsão através de peneira metálica. Este procedimento deve ser realizado em uma pia, servindo-se de um jato de água corrente. Vermes adultos como o Ascaris lumbricoides e Enterobius vermicularis são encontrados frequentemente misturados ou na superfície das fezes, como também as proglótides de tenias. Outros helmintos como o Trichiuris trichiura, ancilostomídeos e Hyminolepis nana são depositados no bolo fecal após o início do tratamento. Frequentemente poderão ser encontrados helmintos adultos nas amostras fecais e ausência dos ovos. Esses processos macroscópicos são vantajosos para a demonstração e coleta de pequenos helmintos, de proglotes e de escólices. Identificação de Proglótides de Taenia Dois métodos são indicados para a identificação de proglótes de Taenia: o àcido acético e o de CAMPOS (AMATO NETO & CORREA, 1980). Método do Ácido Acético Glacial: 1. Colocar em uma placa de Petri, contendo ácido acético glacial, a proglote a ser identificada, durante 15 a 20 minutos. 2. Após o período, comprimi-la entre lâminas. 3. Examinar sob iluminação intensa. Método de CAMPOS: 1. Dissolver três comprimidos de metoquina em 5 ml de água destilada-deionizada. 2. Mergulhar nesta solução, durante 15 minutos, a proglote a ser identificada. 3. Após este período, comprimi-la entre lâminas. 4. Examinar sob iluminação intensa. Exame Microscópico Exame de esfregaço a fresco pelos métodos diretos é o método mais fácil e, talvez, o mais usado na rotina do laboratório, permitindo visualizar os estágios de diagnóstico dos protozoários (trofozoítas e cistos) e dos helmintos (ovos, larvas e pequenos adultos). Para uma diagnose absoluta é necessário observar o parasita em um de seus estágios de evolução. O simples exame microscópico é, em muitos casos, suficientemente para o diagnóstico. Entretanto, para a obtenção de melhores resultados será necessário o uso de técnicas de concentração, ou seja, processos mecânicos e/ou biológicos. Exame Direto a Fresco O exame direto a fresco é um procedimento simples e eficiente para o estudo das fezes, permitindo observar as formas trofozoíticas vivas dos protozoários. Este procedimento coprológico jamais deve ser omitido. As preparações a fresco são obtidas diretamente dos espécimes fecais e requerem o mínimo de material (2 mg) para cada método de exame . Todos os estágios de diagnóstico dos organismos, pelo uso de diferentes soluções, podem ser determinados e identificados. Os esfregaços com fezes frescas e não fixadas são rotineiramente preparados com as soluções salina a 0,85% e de iodo. Entretanto, se o número de organismos for pequeno, o exame de pequena quantidade de fezes usadas para a preparação de esfregaços a fresco pode ser insuficiente para revelar a presença de parasitas. Os esfregaços deverão ser sistemática e completamente examinados através da objetiva do microscópio de pequeno aumento (10x) e com pequena intensidade de luz. A confirmação dos parasitas deve ser realizada com a objetiva de grande aumento (40x). Exame Direto para a Pesquisa de Ovos de Helmintos (KATO & MIURA, 1954). Método: 1. Colocar 60 a 70 mg de fezes (tamanho de um grão de feijão preto) em uma lâmina de microscopia. 2. Cobrir as fezes com lamínula e celofane (embebida em solução aquosa de verde de malaquita a 3%), após a remoção do excesso do corante. 3. Comprimir a lamínula, com uma folha de borracha macia, e espalhar o material com uniformidade até as margens da cobertura de celofane. Examinar ao microscópio. TÉCNICA DE CONCENTRAÇÃO TÉCNICA DE FLUTUAÇÃO FLUTUAÇÃO SIMPLES Flutuação em Solução Saturada de Cloreto de Sódio (WILLIS, 1921) 1. Colocar uma quantidade de fezes de aproximadamente 1 a 2 g. coletada de várias partes do bolo fecal, em pequena cuba de vidro de 3 cm de diâmetro com capacidade aproximada de 20 ml. Completar ¼ da capacidade do recipiente com solução saturada de cloreto de sódio. 2. Suspender as fezes na solução saturada salina até haver uma total homogeneização. 3. A lamínula deve ficar em contato com o menisco durante 30 a 45 minutos; não deverá haver formação de bolhas de ar entra a lamínula e a superfície do líquido. A gota contendo os ovos se adere à face inferior da lamínula . 4. Remover a lamínula e inverter rapidamente a sua posição sobre uma lâmina. 5. Examinar ao microscópio com objetiva de pequeno aumento. Observações: Os ovos não flutuam na superfície do reagente quando a homogeneização do material fecal é incompleta, havendo uma imperfeita separação dos ovos e dos detritos fecais. A flutuação é muito curto ( menos de 30 minutos ) ou muito longo ( mais de 60 minutos ). Nesse caso os ovos que flutuam na superfície podem descer para o fundo da pequena cuba ( Suzuki, 1980 ). CENTRÍFUGO-FLUTUAÇÃO Centrifugo - Flutuação em solução deSulfato de Zinco (FAUST et al. 1938). A: Material fecal fresco 1. Colocar 1 ou 2 g de fezes coletadas de várias partes do bolo fecal em frasco contendo 10 ml de água corrente . Filtrar a suspensão através de gazes dobrado em quatro vezes , e receber o filtrado em um tubo cônico de centrífuga de 15 ml. 2. Adicionar água corrente até completar 2/3 da capacidade do tubo. Centrifugar ( 650 x g por 1 minuto ). 3. Decantar o sobrenadante e adicionar 1 a 2 ml de água corrente ao sedimento , ante de ressuspendê-lo. Completar com água corrente 2/3 do volume do tubo, agitar e centrifugar. 4. Repetir a etapa 3, até que o sobrenadante apresente-se relativamente claro. 5. Depois que o último sobrenadante é decantado, adicionar 1 a 2 ml do reagente , e ressuspender o sedimento: completar com sulfato de zinco até 0,5 cm da borda do tubo e centrifugar (650 x g por 1 min ). 6. Cuidadosamente, remover o tubo da centrifuga e, sem agitação Coloca-lo em uma estante em posição vertical. 7. Com uma alça de arame (diâmetro de 5 a 7 mm) tocar no centro da membrana formada na superfície, transferido várias alçadas para uma lâmina de microscopia. Examinar ovos larvas e cistos. 8. Alguns pesquisadores preferem a sobreposição de uma lamínula na borda do tubo à remoção da película com alça de arame. (BURROWS, 1965: MELVIN & BROOKE, l982). Depois de concluída a etapa 4, com auxílio de pipeta, encher o tubo até a borda com solução de sulfato de zinco. Colocar uma lamínula (22 x 22 mm) na superfície do tubo. Deixando-a em contato com o líquido durante 8 a 10 minutos. Remover a lamínula, invertendo a sua posição, e colocar a face com a gota sobre uma lâmina. Examinar para larvas e cistos. B: Material Fecal Preservado pela Solução de Formaldeido: 1. A suspensão fecal formolizada deverá ser aproximadamente uma parte de fezes para duas a três partes de solução de formoldeido. Se a suspensão for muito espessa, diluir com solução de formaldeido a 10 % para se aproximar da proporção. 2. Filtrar a suspensão fecal fomolizada, através de gazes umedecida. De modo a obter ¾ de um tubo de 13 x 100 mm. Adicionar, se necessário, ao tubo água corrente. 3. Seguir as etapas de 2 a 8 , como foi descrito para o material fecal não preservado, usando sulfato de zinco de densidade 1.20 g/ml. Observação: Alguns ovos de trematódeos e de cestóides podem estar presentes nas superfície da membrana , em densidade alta de 1,20 g/ml. Entretanto, para um exame completo, deverão ser examinados a membrana e o sedimento uma permanecia prolongada da suspensão de fezes na solução de sulfato de zinco, de alta densidade especifica, pode resultar em colapso e distorção dos cistos e dos ovos de nematoídes com parede fina. Examinar a preparação após 20 minutos ( ASH & ORIHEL, 1987 ). TÉCNICAS DE SEDIMENTAÇÃ0 SEDIMENTAÇÃO SIMPLES: Sedimentação Espontânea em água (LUTZ, 1919; HOFFMANN, PONS E JANER, 1934). 1. Colocar cerca de 5g de fezes, coletados de várias partes do bolo fecal, em copo graduado ou Becker de 250 ml. Completar o volume de 50 a 60 ml de água corrente e misturar vigorosamente. 2. Preparar a suspensão juntando 100 ml de água corrente. 3. Filtrar essa suspensão através de gaze dobrado 4 vezes, recolhendo-a em copo de sedimentação de capacidade de 125 ml. 4. Se necessário, adicionar água corrente, até completar aproximadamente ¾ do volume do copo cônico. Deixar a suspensão em repouso durante 1 a 2 horas. 5. Com uma longa pipeta capilar, fixada a um bulbo de borracha, colher uma pequena porção do sedimento na camada inferior, depositando sobre uma lâmina. Se a preparação estiver muito espessa, diluir com uma gota de solução salina a 0,85% ou água corrente. Colher amostra adicionais do centro e do fundo do sedimento. 6. Examinar ao microscópio, a presença de ovos, larvas e cistos. Observação: MELVIN & BROOKE, (1982) e ASH & ORIHEL (1987) apresentaram a seguinte conduta depois de concluída a etapa 4 (1) decantar com cuidado 2/3 do líquido sobrenadante sem perder nenhuma porção do seguimento; (2) ressuspender o sedimento em água corrente, e deixar a suspensão em repouso por mais 1 h; (3) esse procedimento de lavagem pode ser repetido até o líquido sobrenadante fique relativamente claro. Após seguir as etapas 5 e 6 na técnica acima descrita. CENTRÍFUGO-SEDIMENTAÇÃO Centrífugo - Sedimentação pela Formalina-Éter, (RITCHIE, 1948). A. Material Fecal a Fresco 1. Colocar 1 ou 2g de fezes coletadas de várias partes do bolo fecal em frasco contendo 10ml de água corrente ou solução salina a 0,85%; 2. Filtrar a suspensão através de gaze dobrada quatro vezes, e receber o filtrado em um tubo cônico de centrífuga de 15 ml. 3. Centrifugar (650 x g por minuto); 4. Decantar o sobrenadante e adicionar 1 a 2 ml de água corrente ou solução salina a 0,85% ao sedimento antes de ressuspendê-lo. Completar com água corrente (ou solução salina a 0,85%) 2/3 do volume do tubo. Agitar e centrifugar (650 x g por 1 min). 5. Repita a etapa 4, até que o sobrenadante se apresente relativamente claro. 6. Depois que o último sobrenadante é decantado, ressuspender o sedimento com 1 a 2 ml de formalina a 10% (dar preferência à solução tamponada de formalina a 10% , pH. Neutro). Completar o volume da suspensão em 10 ml com formalina a 10%. Deixar em repouso em repouso durante 5 minutos. 7. Adicionar 3ml de éter ou acetado de etila, fechar o tubo e agitar vigorosamente, na posição invertida, por 30 minutos. Remover a tampa com cuidado. 8. Centrifugar (500 x g por 1 min). Quatro camadas se formarão: (1) sedimento no fundo do tubo contendo os parasitas, (2) camada de formalina, (3) tampão de detritos fecais, e (4) camada de éter na superfície. 9. Afrouxar e separar o tampão de detritos das paredes do tubo com um estilete fino,e com cuidado decantar as três camadas superiores. Limpar com swab de algodão as paredes do tubo, removendo os detritos remanescentes. 10. Uma pequena quantidade de líquido que permanece nas paredes do tubo escorre para o fundo junto ao sedimento. Misturar o líquido e o sedimento, preparando as lâminas para a pesquisa de ovos, lavas e cistos. MÉTODOS QUANTITATIVOS Método Modificado de KATO-KATZ (KATO,1960; KATZ, CHAVES E PELLEGRINO, 1972) 1. Colocar a amostra fecal sobre o papel absorvente. 2. 3. Comprimir a tela metálica ou de náilon sobre as fezes, fazendo com que parte passe através das malhas. 4. Remover as fezes que passam através das malhas e transferi-las para o orifício do cartão, colocado sobre a lâmina. 5. Depois de encher o orifício central, remover com cuidado o cartão, deixando as fezes com a lamínula. 6. Cobrir as fezes com a lamínula de celofane, invertendo e pressionando a lâmina sobre o papel absorvente. 7. Deixar a preparação em repouso (clarificação) durante 30 minutos a 34-40°C ou à temperatura ambiente por 1-2 horas. 8. Examinar a preparação ao microscópio MÉTODOS PARA O ISOLAMENTO DE LARVAS MÉTODO DE BAERMANN (1917) E MORAES (1948) 1. Encher o funil com água corrente, aquecida a 40-45ºC. 2. Abrir a pinça de Mohr, deixando escorrer uma pequena quantidade de água para evitar a formação de bolhas de ar na haste e no tubo de látex. 3. Colocar 8 a 10 g de fezes, recentemente emitidas, sobre gaze dobrada quatro vezes e, se necessário, juntar mais água, até que as fezes fiquem submersas. 4. Deixar em repouso durante 60 minutos. 5. Abrir a pinça e coletar parte do líquido em vidro de reógio; examinar ao microscópio estereoscópio (aumentos 20 a 30 x). Deixar em repouso durante alguns minutos, pois desta forma as larvas migrarão para ocentro do vidro de relógio, ou proceder de acordo com o item 6. 6. Coletar em tubo cônico de centrífuga. Centrifugar (500 x g por 1 min), e exarminar o sedimento entre lâmina e lamínula. Corar a preparação com solução de Lugol, para a identificação das características morfológicas das larvas, e examinar ao microscópio com aumento de 20x. Nota: Esse método é baseado no hidro e termotropismo das larvas que saem do material, migrando para a água quente; por densidade, se depositam no fundo do funil. Para maior comunidade, costuma-se construir um pequeno suporte de tábua, com vários furos circulares para receberem os funis, facilitando o trabalho. Algumas vezes, para examinar larvas de helmintos há necessidade de matá-las, e para isso coloca-se gotas de lugol (estando imóveis, permitem a visualização dos detalhes no diagnóstico específico). MÉTODO DE RUGAI, MATTOS & BRISOLA (1954). 1. Estender, sobre a abertura de um recipiente contendo fezes, gaze dobrada quatro vezes, e repuxar as extremidades para trás; 2. Encher, com aproximadamente 70 a 100 ml de água corrente aquecida a 40-45°C, um copo cônico de sedimentação (capacidade de 125ml); 3. Transferir o recipiente com as fezes para o interior do copo cônico de sedimentação, de modo que o líquido alcance toda a extensão da abertura do recipiente, cuidando para não formar bolhas de ar; 4. Deixar em repouso durante 60 minutos. 5. Colher o sedimento, no fundo do copo cônico, com pipeta capilar longa. Alguns autores recomendam retirar o recipiente do copo Cônico antes da colheita do sedimento. Entretanto, outros preferem manter o recipiente, para evitar o revolvimento do líquido; 6. Examinar o sedimento entre lâmina e lamínula. Corar a preparação com solução de lugol. Observação: Este método é indicado para a pesquisa de larvas de S. Stercoralis. IDENTIFICAÇÃO DE OOCISTOS DE Cryptosporidium Preparação e Armazenamento dos Espécimes Fecais Contendo Oocistos. 1. Preservação dos Espécimes A detecção e identificação dos oocistos está em relação direta com a quantidade da amostra entregue ao laboratório. São recomendados certos princípios básicos que asseguram uma coleta correta. As fezes poderão ser examinadas frescas ou após a fixação em solução salina de formaldeído a 10%, ou no fixador acetato de sódio - ácido acético-formaldeído (SAF). A solução salina de formaldeído a 10% apresenta a vantagem de fixar os oocistos e destruir o seu poder patogênico e inativar outros agentes infecciosos (CENAC et al ., 1984). Entretanto, o material preservado na solução fixadora álcool polivinílico (fixador APV) não apresenta bons resultados quando é corado pelos métodos derivados da fuscsina fenicada. 2. Armazenamento dos Espécimes A solução de bicromato de potássio a 2 ou 2,5% (m/v) é usada na rotina como meio para preservar a viabilidade dos oocistos. Essa solução não é fixadora. Quando os oocistos são armazenados a temperatura de 4°C em solução de bicromato de potássio, eles permanecem viáveis durante 3 meses, e alguns podem manter a sua infectibilidade por mais de 12 meses (CURRENT, 1990) EXAME DIRETO EXAME MACROSCÓPICO DE PREPARAÇÕES A FRESCO O diagnóstico é realizado pela observação microscópica dos oocistos entre lâminas e lamínulas. O exame direto a fresco é realizado diretamente das fezes diarreicas, ou após a diluição das fezes pastosas, em solução salina a 0,85% (1:5). Examinar com objetiva de imersão. A microscopia de contraste de fase facilita a observação dos parasitas. Observações: O oocisto no exame direto aparece maior que aqueles observados nos esfregaços fixados e corados. Os oocistos apresentam-se como elemento esféricos de 5 a 6 µm de diâmetro, com membrana externa fina, com um citoplasma finalmente granulado, e com mancha negra proeminente, central ou lateral, quer representa os corpos residuais. Os quatro esporozoítos livres aparecem como pequenas manchas dispostas na periferia em forma de "C". O núcleo é visto no centro do organismo (GARCIA et al., 1983; LEMETEIL, 1987; MEHLHORN, 1988). Métodos de Coloração Derivados de Ziehl – Neelsen As colorações recomendadas para oocistos de C. parvum não são indicadas para amostras fecais preservadas pelo fixador álcool - polivinílico ( fixador APV). As colorações de rotina, com tricrômio e hematoxilina férrica, não apresentam bons resultados na identificação desse coccídio. A coloração de Ziehl-Neelsen e suas variações são os procedimentos que oferecem os melhores resultados. Coloração da Amostra 1. Preparar o esfregaço com fezes frescas ou preservadas. 2. Deixar secar à temperatura ambiente. 3. Fixar com álcool metílico por 5 minutos e deixar secar à temperatura ambiente. 4. Corar com o corante de Kinyoun ( a frio) durante 1 hora. 5. Lavar com água corrente. 6. Diferenciar com solução aquosa de ácido sulfúrico a 2%. 7. Lavar com água corrente. 8. Corar o fundo com solução de verde de malaquita a 5% por 8 minutos. 9. Lavar com água corrente e secar. Observações: A diferenciação depende do corante, de ensaios preliminares sobre fezes positivas para adaptar a concentração do ácido a ser utilizada, e da definição dos tempos de diferenciação. Current (1990) usa a solução aquosa de ácido sulfúrico a 10% na etapa 6 e os corantes light green SF yellowish (CI 42095) ou azul-de-metileno a 0,3% (CI 42780) diluídos em água destilada - deionizada na etapa 8. Outros autores preferem lavar o esfregaço na etapa 7 com álcool etílico a 50% (v/v). Alguns procedimentos usam o método a quente. Entretanto, a coloração a frio apresenta os melhores resultados. O escarro deverá ser tratado com solução de formaldeído a 10% e processado como as amostras fecais. Centrífugo - Sedimentação pelo Formaldeído-Éter (Técnica de Ritchie, 1948; Modificada por Allen & Ridley, 1970). A técnica de Ritchie, modificada por Allen & Ridley, é a que apresenta os melhores resultados. A concentração pode ser realizada a partir de fezes frescas ou formolizadas. Sendo a amostra mucosa, ela deverá ser fluidificada, sob agitação, com algumas gotas de hidróxido de potássio a 10%. Técnica 1. Diluir 1 ou 2g de fezes frescas ou formolizadas em 7ml de solução de formaldeído a 10%. 2. Filtrar em gaze dobrada quatro vezes e receber o filtrado em tubo cônico de centrífuga de 15 ml. 3. Adicionar 3 ml de éter, fechar o tubo e agitar vigorosamente, na posição invertida, por 30 segundos. Remover a tampa com todo cuidado. 4. Centrifugar ( 500xg por 2 min). Quatro camadas se formarão: (1) sedimento no fundo do tubo contendo os parasitas; (2) camada de forrmalina; (3) tampão de detritos fecais, e (4) camada de éter na superfície . 5. Afrouxar e separar o tampão de detritos das paredes do tubo com estilete fino, e com cuidado decantar as três camadas superiores. Limpar com swab de algodão as paredes do tubo, removendo os detritos remanescentes. 6. Uma pequena quantidade de líquido permanece nas paredes do tubo, escorrendo para o fundo junto ao sedimento. Misturar o líquido e o sedimento e preparar as lâminas para a pesquisa de ovos, larvas e cistos. 7. Corar o sedimento pelos métodos de Giemsa ou de Henriksen e Pohlenz. Observação : Adicionar 10 gotas de solução de hidróxido de sódio ( NaOH) a 10% ao sedimento, quando este se apresentar mucóide ( RITCHIE, 1948; DELUOL et al., 1984; LEMETEIL, 1987). Pesquisa de Sangue Oculto Nas Fezes Técnica: Espalhar pequena quantidade de fezes sobre o papel de filtro limpo e colocar duas gotas de água oxigenada sobre o esfregaço. Adicionar duas gotas de solução de benzidina. Observar imediatamente a cor. Leitura: A reaçãode benzidina é sensível, mas as gorduras podem torna-la positiva. Nenhuma mudança de cor: Negativo Cor esverdeada: Traços Cor verde claro: + Cor vede escuro: ++ Cor verde azulado: +++ Azul intenso: ++++ Métodos de Coloração Derivados de Ziehl – Neelsen (Pesquisa de Coccídeos) Coloração da Amostra 1. Preparar o esfregaço com fezes frescas ou preservadas. 2. Deixar secar à temperatura ambiente. 3. Fixar com álcool metílico por 5 minutos e deixar secar à temperatura ambiente. 4. Corar com o corante de Kinyoun ( a frio) durante 1 hora. 5. Lavar com água corrente. 6. Diferenciar com solução aquosa de ácido sulfúrico a 2%. 7. Lavar com água corrente. 8. Corar o fundo com solução de verde de malaquita a 5% por 8 minutos. 9. Lavar com água corrente e secar. Observações: A diferenciação depende do corante, de ensaios preliminares sobre fezes positivas para adaptar a concentração do ácido a ser utilizada, e da definição dos tempos de diferenciação. Current (1990) usa a solução aquosa de ácido sulfúrico a 10% na etapa 6 e os corantes light green SF yellowish (CI 42095) ou azul-de-metileno a 0,3% (CI 42780) diluídos em água destilada - deionizada na etapa 8. Outros autores preferem lavar o esfregaço na etapa 7 com álcool etílico a 50% (v/v). Alguns procedimentos usam o método a quente. Entretanto, a coloração a frio apresenta os melhores resultados. O escarro deverá ser tratado com solução de formaldeído a 10% e processado como as amostras fecais. TESTES IMUNOLÓGICOS Os teste imunológicos são baseados no modelo biológico do tipo enzima-substrato, um perfeito encaixe espacial entre duas moléculas, lembrando a idéia de chave-fechadura. Tem como características: • Reversibilidade: a interação entre os epítopos antigênicos e o sito combinatório do anticorpo é do tipo não covalente e dependem de interações do tipo pontes de hidrogênio e hidrofobicidade. • Especificidade: em razão das características da resposta imune, para cada epítogo antigênico são obtidos anticorpos com sítio combinatório perfeitamente específico para essa conformação. • Constante de afinidade: é uma medida da força de ligação molecular entre o antígeno e o anticorpo. Princípio de alguns testes imunológicos: Precipitação: Foram os primeiros métodos utilizados na detecção do complexo Ag- Ac.No entanto, eram de baixa sensibilidade, já que para a visualização do macrocomplexo era necessárias enormes quantidades de moléculas de Ag e de Ac.Para a obtenção de precipitados visíveis é preciso que o antígeno contenha múltiplos determinantes e que ocorram interações cruzadas entre moléculas diferentes de Ac e esses determinantes, formando uma rede complexa e de elevado peso molecular. Aglutinação: O princípio das técnicas de aglutinação é o mesmo das de precipitação, mas o componente conhecido, Ag ou Ac, está ligado à superfície de partículas/ células, o que facilita em muito a visualização do complexo Ag/Ac na forma de agregados.Outra vantagem desse método é a rapidez com que se obtêm os resultados, de minutos a hora.Em relação à precipitação, a aglutinação perde o poder de discriminar frações dos componentes; por outro lado, quando os antígenos são fixados às células pode ser purificado e ainda sim conservar suas características de complexibilidade. Quando as células são hemáceas, a técnica é chamada de Hemoaglutinação. Reação de fixação do complemento: A técnica é utilizada para detectar Ac fixadores de complemento.Os Ac só fixam complemento após a interação com o antígeno específico.A técnica é realizada em duas etapas.Na primeira, o soro é incubado com extrato antigênico solúvel e complemento ( soro fresco de cobaia ).Se a amostra contiver Ac específicos fixadores de complemento, este será ativado e consumido.Na segunda etapa do teste utiliza-se sistema hemolítico para detectar se o complemento está livre ou não.O complemento livre irá lisar as hemácias sensibilizadas indicando um resultado negativo do teste.Se o complemento for consumido na etapa anterior não haverá hemólise, indicando um teste positivo. Métodos utilizando ligantes: 1- IMUNOFLUORESCÊNCIA São moléculas capazes de absorver radiação eletromagnética ou energia luminosa, tornando-se excitadas por alteração na configuração de seus elétrons.A energia absorvida é dissipada na forma de calor.Certas substâncias dissipam essa energia por emissão de fótons de luz.Esse fenômeno é chamado de Luminescência.Há dois tipos de substâncias luminescentes: A fosforescência, em que o tempo entre a excitação e emissão é longo, e a fluorescência, em que esse tempo é menor. 2 - IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA: É a técnica utilizada para a pesquisa de antígenos em células ou tecidos, usando-se conjugados compostos de anticorpos específicos para o antígeno em questão e marcados com fluorocromos. 3- IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA: É a opção de escolha para detectar Ac circulantes específicos para os mais variados antígenos infecciosos (bactérias, protozoários, helmintos, vírus).Esses antígenos são fixados em lâminas, o soro contendo anticorpos é incubado sobre eles e esses anticorpos são detectados por meio de imunoglobulinas específicas para cada classe de anticorpos ( IgG, IgM, ou IgA ). 4- IMUNOENZIMÁTICOS: Nesse tipo de teste o marcador é uma enzima que na presença de um substrato altera sua cor, de modo a diferenciar o teste positivo do teste negativo.Esse ensaio é um ensaio em fase sólida, o que significa que os imunocomplexos marcados deverão ser separados da substância marcada livre.Quando há um suporte de fase sólida o teste ganha o nome de ELISA, que é de fácil realização, principalmente para a detecção de anticorpos e de antígenos circulantes. 5-WESTERN BLOTTING É um teste imunoenzimático em que o antígeno é processado por eletroforese em gel, separando os componentes antigênicos por peso molecular.Esses componentes são transferidos para membranas de nitrocelulose (blotting ) e nessas tiras se processa o teste. 6-RADIOIMUNOENSAIO: Há 30 anos têm sido aplicado como instrumento de diagnóstico na prática diária do laboratório clínico, devido a sua sensibilidade, especificidade e simplicidade.Sua elevada sensibilidade o tornou-se útil para a dosagem de hormônios e marcadores tumorais.Porém algumas desvantagens importantes levaram a busca de alternativas, como marcador de meia-vida curto e cuidados especiais necessários com o material radioativo, desde o transporte até o descarte final. Parâmetros dos testes imunológicos: Na etapa de padronização dos testes imunológicos são utilizadas amostras de referência, positivas e negativas, para a doença em questão.Portanto, na adequada escolha dessas amostras é importante definir qual será a referência padrão-ouro (gold standart).Outro aspecto a ser considerado importante é a inclusão de amostras de pacientes em diferentes fases da evolução da doença.Por isso, é necessário seguir rigorosamente o protocolo padronizado com a inclusão de controles positivos e negativos.Dentre eles: • Limiar de radioatividade; • Sensibilidade; • Especificidade; •Eficiência. Simplicidade e custo dos testes imunológicos: Tão importante quanto à eficiência diagnóstica, os testes imunológicos devem apresentar custo acessível, pois a população mais beneficiada com essas metodologias é justamente a de baixa renda.Espera-se facilidade no processo de execução e realização dos testes.Os testes de diagnóstico de parasitoses, por exemplo, devem ser realizados em laboratórios sem complexidade; de preferência devem poder ser realizadosem campo, ou seja, sem a necessidade de equipamentos. Testes imunológicos nas infecções parasitárias: Diversos fatores devem ser considerados no desenvolvimento dos testes imunológicos para diagnóstico de infecções parasitárias.Esses fatores são determinantes na eficiência do teste utilizado.São eles: 1- Relação parasita/hospedeiro: Bastante complexa e diversificada em razão das variáveis da espécie humana. 2- Intensidade e localização do parasitismo: Isso acontece quando parasita se instala em estruturas privilegiadas, como no globo ocular ou sistema nervoso central, aí, a resposta imunológica pode ser apenas local, requerendo a coleta de material biológica de sítios específicos e minuciosos, necessitando de um profissional especializado e condições adequadas para a realização da coleta. 3- Ciclo biológico do parasita: É a fase de evolução do parasito e as variações antigênicas entre as cepas, representando uma outra dificuldade para a padroniozação deste teste. 4- Escolha do material biológico e conservação da amostra: Dependendo do elemento a ser detectado, há uma grande dificuldade da coleta do material e na sua conservação. 5- Mecanismo de evasão parasitária: É o modo de sobrevivência do organismo dentro do hospedeiro, sua ação espoliativa e suas variações antigênicas. 6- Hospedeiro humano: A ação do parasita depende muito da resposta do hospedeiro e o equilíbrio do organismo do mesmo. 7- Papel da resposta imune: muitas vezes é a imunopatogenia que explica as lesões graves da infecção parasitária.Em infecções crônicas, é comum o aparecimento de fenômenos de auto- imunidade, responsáveis por danos adicionais ao hospedeiro. Testes de hipersensibilidade imediata: São testes, especialmente de helmintos para obter um diagnóstico de infecções sistêmicas causadas pelo mesmo, como exemplo a HIDATIDOSE. Testes de hipersensibilidade tardia Como em toda resposta imune complexa, nas infecções parasitárias há uma participação da resposta celular T e de macrófagos. A injeção subcutânea de antígenos no paciente previamente sensibilizado irá promover a migração celular para este local, formando uma “pápula” ou um nódulo constituído por essas células. Outros testes de imunidade celular: A utilização de técnicas de estudo da imunidade celular é restrita à investigação de mecanismo de patogenicidade.A técnica de estimulação de linfócitos em cultura com antígenos específicos, mede a proliferação induzida e permite a determinação de citocinas no sobrenadante da cultura.A dosagem de citocinas, como interleucinas e interferons, pode auxiliar na compreensão dos mecanismos de defesa contra os patógenos. MARCADORES IMUNOLÓGICOS NO DIAGNÓSTICO DE ALGUMAS INFECÇÕES PARASITÁRIAS Protozoários Amebíase Emtamoeba histolytica é a única da classe locozia que é considerada patogênica. A amebíase é de distribuição mundial, com predomínio nas regiões tropicais. Os sintomas clínicos surgem em cerca de 10% dos infectados e se caracterizam por sintomas gastrintestinais, disenteria e colites. Destes 2 a 10% evoluem para a forma invasiva extra- intestinal, de elevada letalidade, com formação de abscessos, principalmente no fígado. São características imunológicas da amebíase: a) anticorpos circulantes são detectados em pacientes com as formas extra-intestinais e invasivas da mucosa intestinal; b) esses anticorpos podem indicar infecções atual (IgM, IgE, IgG) ou passada (IgG e IgE); c) testes de hipersensibilidade imediata (IgE) e tardia (celular) podem ser utilizados, mas a padronização de antígenos adequados e difícil; d) pacientes com abscessos amebianos apresentam resposta de hipersensibilidade tardia menos intensa, sugerindo possíveis eventos de supressão imune desencadeados por antígenos parasitários; e) essa supressão é abolida após a cura; f) o papel protetor da imunidade parece importante em pacientes curados de abscessos hepáticos indicando participação da resposta celular T; e g) em pacientes com elevados níveis de antibióticos podem ocorrer reinfecção com a forma intestinal, mas parecem não desenvolver formas invasivas, indicando imunidade parcial. A elevada prevalência de portadores sadios transmitindo a infecção pode ser reduzida pelo diagnostico parasitológico e a instituição terapêutica adequada. Doença de chagas O trypamosoma cruzi é um protozoário flagelado, que se desenvolve no tubo digestivo de vetores insetos da subfamília Triatominae e é transmitido na forma de tripomastigota metacíclico pelo contato direto com as fezes do vetor. Originariamente, era encontrado em diversas espécies de animais silvestres e atingiu a espécie humana, quando se pode determinar quadros crônicos inaparentes ou graves. A transmissão vertical é possível e os parasitos já foram encontrados em leite materno de mulheres infectadas. Uma das características imunológicas na doença de chagas mais interessantes é o desenvolvimento de auto-imunidade envolvendo antígenos das células infectadas em processos crônicos de longa duração, exarcebando assim os mecanismos de imunopatogenicidade. Os testes imunológicos para detecção de anticorpos anti-T. cruzi são amplamente empregados para selecionar doadores em bancos de sangue, para acompanhamento terapêutico, para fins sociais na seleção de trabalhadores, para confirmar ou excluir suspeita clinica e para inquéritos epidemiológicos. A complexidade antigênica do parasito e a variação imunológica do hospedeiro tornam difícil o diagnostico sorológico de certeza e indicam a necessidade de criteriosa avaliação clinica com exames radiológicos e, se possível, isolamento do parasito para definição do caso. Vários testes foram utilizados para o diagnostico imunológico da doença de chagas, como a reação de fixação de complemento, precipitação e aglutinação direta e foram substituídos por outros de metodologia com maior reprodutibilidade e sensibilidade, como imunofluorescência indireta, hemaglutinação passiva e testes imunoenzimáticos, ELISA e dot-ELISA. Leishmaniose Causada por protozoários intracelulares do sistema retiloendotelial. As espécies do complexo Leishmania tropica, L. major, L. brasiliensis e L. mexicana comumente envolvidas na forma tegumentar e mucocutanea. Na forma visceral, ou calazar, as espécies L. donovani, L. chagasi e L. infantum são as causadoras da doença. A Leishmania, após ser introduzida na pele pela picada do inseto do gênero Lutzomyia, é fagocitada pelos macrófagos, processada e apresentada a linfócitos T e, dependendo da espécie e da suscetibilidade do hospedeiro, haverá predomínio da resposte Th1 ou Th2. na resposta Th1, presente na forma tegumentar, operfil de citocinas presente é de IL-2, delta-IFN e IL-12, regulando a resposta para hipersensibilidade tardia com manutenção da infecção ao nível da pele. Quando há predomínio da resposta Th2, há excesso de IL-4 e Il-10 com aumento da resposta humoral e menor quantidade de ativação macrofágica, permitindo a disseminação de parasitos e a infecção de maior numero de células. A resposta Th2 é mais intensa na forma visceral. Os mecanismos imunopatogênicos observados na leishmaniose servem de modelo para o estudo da complexa relação parasito/hospedeiro e do papel da resposta imune nas lesões teciduais. São exemplos dessas características a invasão da mucosa e do tecido cartilaginoso, na forma tegumentar, dependente de mecanismos de hipersensibilidade, e a alergia observada na forma visceral. Toxoplasmose O agente etiológico da toxoplasmose, Toxoplasma gondii, é um protozoário intracelular e presenteem líquidos somáticos, exceto em hemácias, com tropismo por células embrionárias e tecido nervoso. Infecção disseminada entre aves e mamíferos, com elevada prevalência entre os humanos. Os sintomas clínicos dependem da virulência da cepa e da resistência do hospedeiro. Destacam-se como formas graves o comprometimento ocular, a forma congênita por transmissão placentária e , mais recentemente, a forma de reativação, observada entre indivíduos imunocomprometidos, pela presença do HIV ou pelo uso de imunossupressores, especialmente entre transplantados. Os testes imunológicos na toxoplasmose são de uso em larga escala e diversos marcadores tem sido utilizados para melhor esclarecer os perfis das infecções aguda, crônica ou latente, ocular, do sistema nervoso, de forma congênita e de reativação. A toxoplasmose apresenta três perfis distintos de marcadores humorais IgG e IgM. O perfil I está presente na soroconversão recente e caracteriza-se pela presença de IgM e IgG. Na fase muito inicial pode não ser detectada a IgG e em razão da menor especificidade da IgM detectada, pode ser útil a repetição do teste com amostra coletada em intervalos de 7-15 dias para surpreender o aparecimento de Igg e confirmar a positividade de IgM. Nessa fase, anticorpos IgG são de baixa avidez. O perfil II, de transição, apresenta elevados níveis de IgG com índices de avidez crescentes ao longo do tempo e redução gradativa da IgM. O emprego do teste ELISA de captura de IgM, pela elevada sensibilidade, pode mostrar reatividade muito prolongada, por meses, dificultando a definição adequada da fase da infecção. No caso de gestantes, já no segundo ou terceiro trimestre gestacional, que estejam fazendo o teste pela primeira vez das quais se desconheça a historia previa da toxoplasmose, pode haver dificldade em esclarecer a i,portancia de resultado positivo de TgM nessa fase. Nesses casos, a ausência de anticorpos IgA, que desaparecem mais rapidamente, e o achado de elevado nível de acidez dos anticorpos IgG podem definir o caso. Os testes diretos podem ser outra opção suplementar nessa situação. O perfil III, característico da infecção latente ou crônica, apresenta apenas anticorpos IgG, geralmente e baixos títulos e com elevada avidez. Na triagem sorológica de gestantes, o ideal seria o teste antes da gravidez ou o mais precocemente possível, facilitando a interpretação dos resultados. Devem ser realizados testes para pesquisa de IgG e IgM. A presença de IgG e ausência de IgM geralmente indicam infecção crônica, sem risco de transmissão placentária. É a presença de IgM que sugere infecção aguda ou recente, sendo difícil estabelecer o período em que ocorreu a parasitemia de risco para infecção fetal. Nesses casos, podem ser necessários testes complementares, como determinação de anticorpos IgA e do índice de avidez de IgG, e ate exames diretos de detecção do parasito. Na vigência de suspeita, o diagnostico e o tratamento da toxoplasmose congênita são importantes para prevenir lesões cerebrais e oculares que podem ocorrer, ainda que de forma assintomática, devido á maior suscetibilidade do neonato, mesmo quando ele não apresenta sinais aparentes da doença. No recém-nascido infectado, o Toxoplasma pode ser isolado na camada leucocitária de sangue. O exame da placenta, mostrando os parasitos, também é útil. Os anticorpos IgG detectados são em parte maternos e a detecção de IgM confirma a infecção intra-uterina. No entanto devido á imaturidade imunológica, muitos neonatos não produzem IgM. A detecção de IgA parece ser mais sensível nesses casos, mas o emprego de técnicas de biologia Molecular ainda é a perspectiva mais promissora para o diagnostico precoce e eficiente da toxoplasmose congênita. O diagnostico imunológico da toxoplasmose ocular é mais difícil. Se o paciente apresenta anticorpos IgM indicando fase aguda/recente da infecção, a certeza do comprometimento ocular pode ser presumida. Já na fase crônica, a etiologia da lesão ocular pode requerer exames diretos de isolamento do parasito ou o achado de anticorpos no humor aquoso. É recomendado que se determinem as concentrações de IgG sérica e no humor aquoso, bem como os títulos de anticorpos em cada compartimento, para calculo do índice de produção intra-ocular de anticorpos. HELMINTOS Constituem um grupo muito numeroso, com três filos: Platyhelminthes, Aschelminthes e Acanthocephala, incluindo espécies de vida livre e espécies parasitas. As ocorrências no homem são muito comuns. A exemplo, cerca de 20% da população humana do mundo está parasitada por ancilostomídeos, o que equivale a mais de um bilhão de pessoas. A situação é equivalente em relação ao Ascaris lumbricoides. Estas infecções, em geral. Resultam em danos para o hospedeiro, os quais se manifestam de formas variadas. No Brasil, a situação não é diferente, justificando lembrar a antológica figura do “Jeca Tatu”, criada por Monteiro Lobato. “O jeca não é assim, está assim.” Cisticercose A cisticercose humana representa importante problema de Saúde Pública em áreas carentes de condições sanitárias e de Políticas de Saúde.A dificuldade em detectar e notificar os casos da doença advém da necessidade de confirmação diagnóstica por procedimentos de custo elevado, pouco disponíveis e inacessíveis para grande parcela da sociedade. O ser humano é o único hospedeiro do verme adulto, Taenia solium, e elimina ovos nas fezes, contaminando o meio ambiente.No suíno , após ingestão dos ovos, o embrião liberado, com a ruptura da casca quitinosa calcária, no intestino delgado atravessa a mucosa por meio de seus acúleos e alcança tecidos e órgãos, desenvolvendo-se até a forma larvária , cisticerco.Completando o ciclo, o ser humano ingerindo carne suína com cisticercos viáveis permitirá o desenvolvimento do verme adulto a partir da fixação das ventosas e acúleos do parasita na mucosa intestinal.Acidentalmente ocorre a cisticercose humana,associada a maus hábitos de higiene,presença de portadores de teníase,água e alimentos contaminados.Cisticercos de Taenia solium têm sido observados no globo ocular, músculos e sistema nervoso central, sendo a neurocisticercose a mais freqüentemente relatada com 60% a 90% dos casos, possivelmente pela gravidade dos sintomas que leva o paciente a buscar auxílio médico.Entre os pacientes com neurocisticercose predomina a faixa etária de 21 a 40 anos , economicamente produtiva, o que revela o impacto social da parasitose.O período de hospitalização desses pacientes é em média de 9 a 28 dias por ano, com letalidade estimada entre 5% e 25%.A sintomatologia apresentada depende do número , tamanho, idade, vitalidade, localização, estágio de evolução do parasito e seus processos reacionais sobre o hospedeiro, além das respostas imune-inflamatórias do hospedeiro ao parasito.As apresentações clínicas mais freqüentes são:convulsão,hipertensão intracraniana, hidrocefalia , demência, meningite e paresias, isoladas ou associadas. A neurocisticercose apresenta-se com mecanismo fisiopatogênico do tipo repetitivo e os surtos de agudização, com exacerbação da resposta imune detectada no líquido cefalorraquiano (LCR),verificam-se quando da morte e degeneração do parasito, com liberação maciça de antígenos e quadro clínico meningítico, em decorrência da resposta imune-inflamatória do hospedeiro. A pleocitose observada no LCR é, geralmente, do tipo linfomononuclear com eosinófilo e neutrófilos; a proteinorraquia revela padrão do tipo gama poli e oligoclonal,à custa de anticorpos específicos que podem ser detectados por vários testes, mas aqueles mais sensíveis , como oteste imunoenzimático ELISA , são recomendáveis e amplamente utilizados.A sensibilidade e a especificidade relatadas são de 90% a 100% para o teste realizado no LCR, enquanto a detecção de anticorpos no soro apresenta menor especificidade, principalmente em populações com outra infecções parasitárias. A pesquisa de antígenos de cisticercos, principalmente de excreção e secreção, ampliaria as perspectivas de estudo dos mecanismos imunopatogênicos da neurocisticercose.No entanto ,esses métodos requerem ainda melhores avaliações. Esquistossomose Mansônica A esquistossomose mansônica representa uma das principais endemias parasitárias no Brasil.A espécie Schistossoma mansoni é a responsável pela infecção humana por contato com água doce infestada de cercarias eliminadas por moluscos planorbídeos do gênero Biomphalaria . A infecção do caramujo é feita através dos miracídios eliminados naquela água e que foram liberados dos ovos viáveis.O parasito adulto, macho e fêmea acasalados, habita o sistema porta e elimina ovos embrionados, que em parte conseguem atravessar a mucosa intestinal e são excretados nas fezes.Parte dos ovos se perde no processo migratório, se deposita em tecidos , principalmente no fígado, e aí entra em degeneração.A resposta de defesa do hospedeiro, que se inicia já na infecção pelas cercárias, desencadeia intenso processo imune-inflamatório com reação do tipo granulomatosa , responsáveis pela imunopatogenia da esquistossomose. Alguns ovos podem migrar de forma errática até o canal espinhal,onde também se processam as mesmas reações, determinando formas graves de mietlites,paresias e até paraplegia.Na neuroesquistossomose, a análise do líquido cefalorraquidiano pode ser de grande utilidade diagnóstica, principalmente porque a administração precoce de antiinflamatórios minimiza o processo e as conseqüentes lesões.A apresentação clínica clássica da esquistossomose pode ser dividida em duas formas:intestinal e hepatoesplênica, sendo esta última de maior gravidade e morbidade, subdividindo-se em forma hepatoesplênica compesada e descompensada.Como a evolução natural da infecção depende do número de parasitos, é proporcional à quantidade de ovos e intensidade reacional do hospedeiro, costuma ser logo o período até a manifestação grave, sendo muito freqüente o achado de grande número de pacientes assintomáticos nas áreas endêmicas. O diagnóstico parasitológico, achado dos ovos nas fezes, é eficiente na fase intestinal, principalmente na parasitemia intensa.São utilizados os métodos clássicos de pesquisa de ovos, sedimentação espontânea e o método quantitativo de Kato-Katz.Esses testes serão negativos se a infecção é unissexuada e têm menor eficiência na forma hepatoesplênica, quando já se observam granulomas e fibrose na mucosa intestinal, impedindo que os ovos ganhem o lúmen intestinal. Na esquistossomose, as principais características imunológicas são a presença de anticorpos IgG e IgM, a resposta de hipersensibilidade imediata e tardia e, como mecanismo de evasão parasitária, a adsorção de proteínas do hospedeiro no tegumento dos vermes.Os testes imunológicos de pesquisa de anticorpos séricos anti-Schistosoma são muito utilizados em nosso meio, embora ainda restritos a Centros de Pesquisa, já que não há reagentes disponíveis no mercado.Uma das principais utilizações dos testes imunológicos na esquistossomose mansônica é em estudos epidemiológicos para determinar índices de prevalência ou incidência ou avaliar programas de controle e vigilância epidemiológica. Hidatidose A hidatidose humana ocorre na América do Sul, principalmente no Uruguai, na Argentina e no Chile.No Brasil, a região de fronteira com Uruguai e Argentina é de destaque para hidatidose, embora casos isolados sejam detectados em outras áreas.Dentre as espécies de Echinococcus , o E.granulosus é de maior importância clínica no Brasil. O ciclo biológico do E. granulosus envolve o cão e outros carnívoros como hospedeiros definitivos, eliminando ovos no meio ambiente, e os ovinos, os bovinos e os suínos são os hospedeiros intermediários.Daí, ser comum a presença do parasito em áreas de pastoreio de gado ovino, onde auxiliando o homem na atividade pastoril temos o cão , que se alimenta e vísceras de ovinos infectados com cistos hidáticos e elimina ovos nas fezes.Por sua vez, o gado no pasto ingere os ovos do parasito e assim passa a ser hospedeiro da forma larvária.O embrião do E. granulosus, após atravessar a mucosa intestinal, pode migrar para todos os tecidos e órgãos, sendo encontrado de preferência no fígado e pulmões e mais raramente nos ossos e cérebro.A evolução clínica é longa e os sintomas dependem do crescimento do cisto e de seus eventuais rompimentos, que podem desencadear reação anafilática devido à elevada concentração de anticorpos IgE que são produzidos.Como a principal intervenção terapêutica é a cirúrgica para retirada do cisto, o seu rompimento, causando disseminação posterior ou choque anafilático imediato, é o principal risco do procedimento.Os exames de imagem são ferramentas obrigatórias para a adequada avaliação clínica do caso , além , do diagnóstico. O cisto de E. granulosus, diferente dos cistos de Taenia, possui milhares de escólices no interior da vesícula, circundada por uma membrana germinativa ou prolígera, com capacidade de regeneração.Essa característica faz com que o cisto, após rompimento e extravasamento de seu conteúdo, possa disseminar-se formando novos cistos, que irão crescer individualmente. São características imunológicas da hidatidose:o elevado nível de IgE, que pode desencadear anafilaxia após a ruptura de cistos e liberação maciça de antígenos; anticorpos IgG são produzidos desde o início da infecção; o teste intradérmico de Casoni permite a leitura imediata (IgE) e tardia (resposta celular); tanto os anticorpos quanto a resposta T podem mostrar resultados cruzados com outras helmintíases.Para o diagnóstico da hidatidose são considerados, além de dados clinicoepidemiológicos, os resultados de exames de imagem (ultra-sonografia, ressonância magnética) e de testes imunológicos para pesquisa de anticorpos séricos. Os principais testes imunológicos utilizados para pesquisa de anticorpos contra antígenos do líquido hidático são o ELISA para triagem e dupla difusão, e a contra- imunoeletroforese ou imunoblot para confirmar a especificidade dos peptídeos reativos. Toxocaríase (Síndrome de Larva Migrans Visceral) A síndrome de larva migrans visceral (LMV) se manifesta pela migração e persistência de larvas vivas, em tecidos de hospedeiro não habituais, impedindo o completo ciclo biológico do parasito.No ser humano , o Toxocara canis é o agente mais relacionado com a LMV.Ovos do parasito contaminam o ambiente e, em solo argiloso e condições de umidade e calor, poderão se manter embrionados até a ingestão acidental pelo ser humano.Os cães são o reservatório natural do parasito e desenvolvem o verme adulto com postura de ovos nas fezes.Através da circulação umbilical, o feto canino pode ser infectado e desse modo, em cerca de 28 dias após o nascimento , o cãozinho já estará eliminado ovos. Utilizando testes imunológicos , tem sido observada maior freqüência de anticorpos anti-Toxocara em crianças, sugerindo possível imunidade protetora em adultos.a maioria dos casos passa como assintomática, mas são descritas três formas de apresentação da LMV:visceral, ocular e atípica ou oculta.Esta ultima se caracteriza por manifestaçõesinespecíficas , como cefaléia, hepatomegalia como aumento dos níveis de gamaglutamiltransferase, astenia e dor abdominal.Na forma oculta é mais rara a eosinofilia intensa, mas há elevados títulos de anticorpos.A forma ocular foi identificada em olhos enucleados com suspeita de retinoblastoma.São observados granulomas retinianos , catarata, ceratite e endoftalmite.Embora o quadro seja grave, pode não haver larvas em outros tecidos e o nível de anticorpos estar muito baixo ou indetectável, dificultando o diagnóstico imunológico. A forma clássica da LMV apresenta febre , manifestações pulmonares, às vezes semelhantes às alergias respiratórias, hepatomegalia, anemia, leucocitose, intensa eosinofilia(>20%) e hipergamaglobulinemia.Os casos fatais geralmente estão associados com envolvimento do sistema nervoso, meningoencefalites e polirradiculoneurites ou com resposta anafilática do hospedeiro.O diagnóstico direto pode ser feito em tecidos de biópsia, onde se observam granuloma eosinofílico e o parasito que pode ser identificado morfologicamente ou por meio de técnicas imunológicas de pesquisa de antígenos ( imuno- histologia).Devido às limitações da técnicas diretas e ausência de ovos e vermes nas fezes, a toxocaríase humana é estudada por meio de testes imunológicos para detecção de anticorpos séricos. TRATAMENTO DAS HELMINTOSES A terapêutica anti-helmíntica tem apresentado apreciáveis progressos ao longo deste século, sobretudo nas duas últimas décadas, com a introdução de novas drogas cada vez mais próxima do anti-helmíntico ideal, ou seja, aquele que reúna as seguintes características: 1) capacidade de alcançar o parasito onde este se encontre, no intstino, no sangue ou nos tecidos; 2) ação deletéria sobre o helminto; 3) boa tolerância pelo hospedeiro; 4) utilização em dose única ou em esquemas de curta duração; 5) amplo espectro de ação, cobrindo o maior número possível de helmintos; 6) preço reduzido; 7) possibilidade de tratamento em massa, sem inconvenientes ou grandes dificuldades; 8) possibilidade de uso profilático, de forma cômoda. Importantes estudos da biologias e fisiologia dos helmintos, bem como a utilização de técnicas adequadas para a avaliação e controle da atividade anti-helmíntica de drogas, têm contribuído para o descobrimento e o uso clínico de novas substâncias dotadas de maior especificidade, melhor tolerância e, mais recentemente, dotadas também de amplo espectro de ação. DROGAS MAIS USADAS NA TERAPÊUTICA ANTI-HELMÍNTICA ALBENDAZOL É um derivado imidazólico de amplo espectro de ação, pois é eficaz no tratamento de ascaridíase, enterobíase, tricocefalíase e ancilostomíase, entre os nematóides, sendo recentemente utilizado como droga preferida no tratamento da cisticercose. Em sua farmacodinâmica ele atua inibindo a captação de glicose associada a uma depleção de glicogênio e diminuição do ATP, que é essencial para a sobrevivência e a reprodução dos parasitas. Comercializada pelos nomes; Parasin®, Zentel®, Zoben®. CAMBENDAZOL O cambendazol é o 2-(4-tiazolil)-5 isopropoxicarbonilaminobenzimidazol, cuja fórmula estrutural, muito parecida com a do tiabendazol. É uma droga específica para o tratamento da estrongiloidíase. Comercializada pelo nome Cambem®. IVERMECTINA É um derivado dos anvermctins, uma nova classe de 16-lactonas, amplamente utilizado em medicina veterinária e que, ultimamente, teve sua utilização estendida também a seres humanos. A ivermectina é o Mectizan; 22,23 diidroavermectin B1a, um semi-sintético análogo de avermectin B1a (Abamectin), um inseticida desenvolvido para amplo manejo, cuja fórmula. Em humanos, é a droga preferida para o controle e tratamento em massa de oncocercíase e, de acordo com vários trabalhos em andamento, para o tratamento da filariose linfática. Adiocionalmente, a ivermectina é também, eficaz para tratar a estrongiloidíase. Sua farmacodinâmica consiste em provocar imobilização dos vermes induzindo uma paralisia tônica da musculatura. Em seres humanos, já ficou demonstrada sua eficácia terapêutica Ochicerca volvulus, Wulchereria bancroft, Strongiloidis stercoralis, Ascaris lumbricoides, Enterobius vermiculares e Trichurus trichura, entre os nematóides, além de eficácia também comprovada na escabiose, pediculose e larva migrans. Comercializada pelo nome; Revectina®. MEBENDAZOL O mebendazol, derivado benzimidazólico, representa real progresso no arsenal terapêutico anti-helmíntico, tanto pela sua elevada eficácia e excelente tolerabilidade, como também pelo seu amplo espectro de ação contra nematóides; A. lumbricoides, Tricocephalus trichiuris, Enterobius vermicularis, Ancylostoma duodenale, Necator americanus e cestóides como Taenia solium e Taenia saginata. O mebendazol é o metil N-[5(6)-benzoil-2 benzi-mendazolil] carbamato, e seu mecanismo de ação é semelhante ao albendazol. Comercializado pelos nomes; Necamin® e Pantelmin®. OXAMNIQUINA A atual droga de escolha para o tratamento da esquitossomose mansônica no Brasil, um derivado da tetraidroquinoleína. A oxamniquina é uma droga esquitossomicida que age inicialmente deslocando os vermes para o fígado, onde eles morrem. Parece que a ação esquitossomicida é mais pronunciada sobre vermes machos. Entretanto o verdadeiro mecanismo de ação da droga não é conhecido. Comercializado pelo nome de; Mansil®. Outros fármacos anti-helmínticos; CLOROSSALICOLAMIDA – ATENASE DICLOROFENO – DIFENTAN DIETILCARBAMAZINA – HETRAZAN HIDROXINAFTOATO DE BEFÊNIO – DEBEFENIUM PAMOATO DE PIRANTEL – PIRANVER PAMOATO DE PIRVÍNIO – PYR-PAM PIPERAZINA – UVILON PRAZIQUANTEL – CESTOX TETRAMISOL/LEVAMISOL – ASCARIDIL TIABENDAZOL – THIABEN Fármacos Amebicidas, Tricomonicidas, Giardicidas, Tripanosomicidas, Leishmanicidas IODO-CLORO-HIDROXIQUINOLEÍNA – VIOFÍRMIO DIIODO-HIDROQUINOLEÍNA – DIODOQUINA GLICOLILARSENILATO DE BISMUTO – WINTODON CLOBETAMIDA – DIANTIL ETOFAMIDA – KITNOS PENTAMIDINA SURAMINA TRIPARSAMIDA NIFURTIMOX – LAMPIT ANTIMONIATO DE N-METIL-GLUCAMINA – GLUCANTINE PAMOATO DE CLICOQUANIL – CAMOLAR ARTIGO CIENT Uma abordagem histórica da trajetória da parasitologia RESUMO O texto relata os caminhos trilhados pela parasitologia, uma ciência que emergiu no século 19 com o surgimento e o estabelecimento de várias áreas da medicina, entre elas, a medicina tropical. Essa ciência, segundo o sumário bibliográfico, foi indicada inicialmente como um ramo da história natural, sendo construída com a descoberta e posterior descrição de vários agentes patogênicos, responsáveis por alguns processos mórbidos, até então não atribuíveis a organismos externos ao indivíduo. Alguns parasitologistas ao redor do mundo começaram a descrever, além dos agentes patogênicos, os vetores e os mecanismos de transmissão das diversas doenças causadas pelos parasitas. No Brasil, o histórico da parasitologia margeia o trajeto da medicina tropical, com o constante embate entre os médicos da Sociedade de Medicina e Cirurgia do Rio de Janeiro e da Escola Tropicalista Baiana. Já em 1900, renomados médicos parasitologistas surgem no cenário brasileiro: Oswaldo Cruz e Carlos Chagas que, através de suas descobertas, impulsionaram a parasitologia até os dias atuais. Uma abordagem histórica da trajetória da parasitologia A história nos mostra que ao invés de existir um processo linear e relativamente simples de transição epidemiológica, no qual as chamadas doenças de pobreza são substituídas pelos males da modernidade,o que se observa é um quadro complexo de alterações, mudanças, adaptações e emergências típicas dos fenômenos vivos. A relação entre as populações de homens, vetores e agentes etiológicos é bastante complexa e não parece estar no horizonte, para os próximos anos, a miragem de uma vida livre de infecções (Barata, 2000). Entre as doenças decorrentes da "pobreza", destacamos as parasitárias, ou as parasitoses. Entende-se que parasitismo é apenas um dentre muitos tipos de associação de dois organismos e não há um caráter único possível para rotular um animal como parasita (Wilson, 1980). O parasita obtém alimento às expensas de seu hospedeiro, consumindo-lhe os tecidos e humores ou o conteúdo intestinal, sendo que o relacionamento do parasita com seu hospedeiro tem base nutricional não podendo lesar drasticamente o hospedeiro, evitando alterações comprometedoras, o que o faria perder o seu hospedeiro. O parasitismo ideal é aquele que não causa dano ao hospedeiro e, por conseguinte, não provoca doença. Isso é o que acontece com alguns parasitas que, ao longo de milhares de anos, se adaptaram de tal forma aos seus hospedeiros que passaram a viver outro tipo de relação entre dois organismos denominada simbiose. Por volta de 1860, os fundamentos da ciência chamada de parasitologia foram estabelecidos e os parasitas se tornaram então os responsáveis por importantes doenças do homem e dos seus animais domésticos. Apesar de muitos parasitologistas terem qualificações médicas, a parasitologia se estabeleceu como um ramo da história natural na metade do século 19; muitos dos personagens que se distinguiram na parasitologia eram médicos, zoólogos, ou de outros ramos da história natural. Embora houvesse muita especulação se os parasitas seriam os responsáveis pelas sérias condições patológicas apresentadas pelas doenças, foi nesse período que se constatou que a hidatidose e a trichinelose tinham como agentes patogênicos os parasitas (Foster, 1965). Segundo Foster, a história da parasitologia não é uma história de grandes eventos; ela se desenrolou ao longo dos séculos 19 e 20 nos laboratórios das universidades, na grande maioria das vezes, em precárias condições. Os maiores avanços e descobertas da parasitologia tropical foram realizados por homens isoladamente ao redor do mundo pertencentes a algumas universidades: Army e Laveran, na Argélia; Bunch, na África do Sul; Ross, na Índia; Manson, na China; e Bancroft, Queensland e Wucherer, no Brasil. Na Europa, podemos destacar Rudolphi, Von Siebold e Leuckhart, apoiados por grandes universidades e Kcheinmeister e Cobbold, indivíduos independentes, que nunca tiveram posição acadêmica de muita importância. Em 1872, Timoty Lewis localizou o nematóide causador da filariose no sangue de hematúricos, denominando-o Filaria sanguinis hominis. Os primeiros relatos dos parasitas adultos apareceriam anos depois em um abscesso linfático examinado por Bancroft. Manson, atento a essas observações, desvendou grande parte do ciclo da filária, entre 1877 e 1878. Conseguiu comprovar o mecanismo de infecção pelo mosquito Culex e a "periodicidade" que a filária realizava invadindo a circulação periférica ao cair da tarde e refluindo durante o dia, de acordo com o ciclo de vida do vetor, através da dissecação progressiva dos mosquitos (Foster, 1965). A descoberta de Manson consagrou um novo modelo de experiência e reformulou uma série de questões no campo da patologia. Questões que requeriam novos saberes e dinâmicas de pesquisa para dar conta dos complexos ciclos de vida dos parasitos patogênicos, envolvendo mudança de hospedeiros e numerosas adaptações e metamorfoses nos organismos parasitados e no meio externo (Benchimol, 2000) Inspirado nas idéias de Patrick Manson, Ronald Ross, médico do serviço inglês na Índia, identificou, em 1897, o parasito da malária desenvolvendo-se nas paredes do estômago de um mosquito do gênero Anopheles. Em 1898, estudando malária aviária, Ross estabeleceu, de maneira definitiva, seu mecanismo de transmissão (Matos, 2000). As oportunidades de desenvolvimento da parasitologia aumentaram com a criação e o estabelecimento das escolas de medicina e hospitais nos trópicos, fato que só ocorreu no final do século 19, criando assim oportunidade de estudar os parasitas tropicais. Embora não houvesse clara distinção entre a medicina dos trópicos e das regiões temperadas, a maioria dos trabalhos de parasitologia no final do século foi realizada nos trópicos (Lacaz, 1972). A primeira escola de medicina tropical em clima temperado foi inaugurada em Liverpool em 1899, com Boyce como professor de patologia e chefe organizador, e Ross como conferencista convidado. Os maiores trabalhos da escola foram inicialmente testar as idéias de Ross na erradicação da malária através da destruição do vetor, e foi também nessa escola que Dutton identificou o primeiro tripanossomo humano, Trypanossoma gambiense, no sangue de um paciente e descrevendo logo após o segundo, o T. rhodesiense. A London School of Tropical Medicine desenvolveu dois ramos de atividade sob a direção de Manson: a "muck-room", ou sala de fezes, como o laboratório ficou conhecido e o Seaman's Hospital, em Greenwich. Nessa escola foram descritos pela primeira vez, pelo médico inglês George Low, embriões de Wuchereria bancroft na probóscide dos mosquitos (Foster, 1965). A exemplo da Inglaterra, outras escolas de medicina tropical e de parasitologia se estabeleceram: o French Institute de Médicine Coloniale, em 1902 e o original Pasteur Institute, fundado em 1888, em Paris, que encorajava seus alunos a saírem da França e alçar vôos, fundando outros institutos. O primeiro Pasteur Institute no Norte da África francesa foi fundado em 1893 em Tunis. Dentre os trabalhos desses institutos destacavam-se os de investigação na área da biologia e da medicina tropical, mas inevitavelmente muitos dos trabalhos eram sobre parasitologia médica. Outro importante centro de pesquisa foi o de Cambridge, fundado em 1906, responsável pela editoração da segunda revista científica de parasitologia Parasitology que, juntamente com o primeiro periódico de parasitologia Archives de Parasitologie , editado em 1898, constitui os primeiros traços da história da parasitologia. Parasitologistas de renome deixaram neles seus artigos: Davaine, Cobbold, Nuttall, Blanchard e Hoeppli (Foster, 1965). O estudo da parasitologia iniciou-se nos EUA em 1850 com Joseph Leidy, que ficou sozinho por aproximadamente 20 anos, publicando, entre outros trabalhos relevantes, a descrição, em 1860, do parasita Trichinella spirallis. Em 1910 foi fundada a Helmintological Society e em 1952 a American Society of Parasitology. As descobertas de Laveran, Ross e Bruce, no final do século 19, expandiram a protozoologia como importante ramificação da parasitologia. Em 1903, o Imperial Health Office, em Berlim, fundou a divisão de protozoologia e Schaudinn foi chamado para dirigi-la, sendo que em 1906 nascia a primeira escola de protozoologia, estabelecida em Londres em conexão com o Listen Institute. No Brasil, o histórico da parasitologia margeia o caminhar da medicina tropical, quando em 1829, foi criada a Sociedade de Medicina e Cirurgia do Rio de Janeiro que, através de um amplo programa, se estendeu desde a adoção de medidas de higiene pela população até a medicina legal, passando pela educação física das crianças, enterro nas igrejas, denúncias da carência em hospitais, estabelecimento de regulamentos sobre as farmácias, elaboração de medidas para melhor atendimento aos doentesmentais, alerta da insalubridade dos prostíbulos, destacando o saneamento básico. Foi a época da medicalização das instituições hospitais, cemitérios, escolas, quartéis e prostíbulos , quando o projeto de medicina procurou destacar o saneamento (Nunes, 2000). A Escola Tropicalista Baiana, integrada por vários parasitologistas de renome, designava inicialmente um conjunto de médicos que se organizavam ao redor de um periódico fundado em 1866 A Gazeta Médica da Bahia à margem da Faculdade de Medicina existente na antiga capital do Brasil Colônia. Os tropicalistas permaneceram na fronteira entre o paradigma miasmático/ambientalista e a Teoria dos Germes, sendo que a escola estava preocupada em refutar o preconceito historiográfico de que a medicina brasileira era imitação da européia, produzindo investigações originais sobre as patologias nativas da Bahia e se posicionando independentemente face à medicina acadêmica européia e a classe médica local (Benchimol, 2000). Peard (1992) enfatiza o antagonismo entre os integrantes dessa escola e os médicos da capital do Império, encastelados na academia e na Faculdade de Medicina do Rio de Janeiro. A Sociedade Médica de Cirurgia do Rio de Janeiro encarava o progresso como imitação da ciência e das instituições européias; os tropicalistas baianos investigavam a singularidade das doenças dos trópicos, a influência do clima sobre as raças e sobre a geração ou multiplicação de miasmas e germes, com interesse crescente pelo papel dos parasitas como produtores de doenças. Segundo esse mesmo autor, foi o modelo científico, que deslocava a atenção do meio ambiente para as etiologias parasitárias específicas, que deu "clara e poderosa" identidade aos tropicalistas baianos. Essa identidade adveio principalmente das investigações de Wucherer, relacionadas à ancilostomíase, à filariose e à malária. Segundo Benchimol (2000), as contribuições brasileiras ao programa de controle das filarioses seriam dadas pelas pesquisas embriológicas e patogênicas de Júlio de Moura e Pedro Severiano de Magalhães, destacando os trabalhos de Adolfo Lutz, o mais preparado para implementar o modelo mansoniano em áreas ainda não exploradas pelos helmintologistas brasileiros, inclusive no campo da veterinária. A Escola Tropicalista Baiana tinha como membro, em 1841, José Cruz Jobim que elaborou trabalho sobre as doenças que mais afligiam escravos e indigentes do Rio de Janeiro. Entre elas, sobressaía uma doença vulgarmente conhecida como opilação, cansação, caquexia africana e, na literatura estrangeira, "tropical chlorosis", "mal de coen", etc. Baseando-se nos trabalhos de Jobim, Otto Wucherer diagnosticou, em 1865, um caso adiantado de hipoemia em um escravo que faleceu em seguida. Na autópsia, encontrou vermes da espécie Anchylostomum duodenale, identificado por Angelo Dubini, em 1838. As investigações sobre essa doença prosseguiram na Bahia e no Rio de Janeiro, após a morte prematura de Wucherer em 1873, porém as questões fundamentais relativas à biologia e aos hábitos dos parasitas só seriam retomadas, num patamar bem mais sofisticado, em meados de 1880 por Adolfo Lutz (Benchimol, 2000). Cerca de 20 anos depois do surgimento da Escola Tropicalista Baiana, Oswaldo Cruz criaria uma nova escola de medicina, voltada para a saúde pública. Em 1902, ele assume a direção da área de saúde pública no governo de Rodrigues Alves, propondo ao congresso que o Instituto Soroterápico Federal fosse transformado "num instituto para estudo das doenças infecciosas tropicais, segundo as linhas do Instituto Pasteur de Paris" (Benchimol, 2000). Ele não foi atendido, porém destinou verbas próprias para elevar a categoria do então Instituto de Manguinhos. As fronteiras de Manguinhos se alargaram e seus cientistas se embrenharam pelos sertões do Brasil para estudar e combater doenças, principalmente a malária. O instituto chefiado por Oswaldo Cruz foi a única instituição sul- americana a participar do 14o Congresso Internacional de Higiene e Demografia, realizado em Berlim em 1907. Nesse evento, Oswaldo Cruz recebeu medalha de ouro pela sua atuação em Manguinhos, tendo essa condecoração uma enorme repercussão no Brasil. Em 1906 foi inaugurada, em Belo Horizonte, a primeira filial do antigo Instituto de Manguinhos e Carlos Chagas executou a primeira campanha antipalúdica, em Itatinga, interior de São Paulo, onde se construía uma hidrelétrica. Em 1908, o então denominado Instituto de Manguinhos foi renomeado de Instituto Oswaldo Cruz. O modelo de médico da época do campanhismo era Oswaldo Cruz, que sustentava que o saber assentava- se na pesquisa e na experimentação com o objetivo de combater as endemias e as epidemias (Nunes, 2000). Em 1909, Carlos Chagas, médico e pesquisador do Instituto Oswaldo Cruz, descobriria uma nova doença em Lassance, interior de Minas Gerais, a tripanossomíase americana, ou doença de Chagas. Pela primeira vez na história da medicina, um mesmo pesquisador identificaria o vetor (inseto conhecido como "barbeiro"), o agente etiológico (o protozoário Trypanossoma cruzi) e a doença causada por esse parasita. A ênfase dada à originalidade científica da descoberta de Carlos Chagas expressou a importância assumida no processo de institucionalização da ciência biomédica no Brasil (Kropf et al., 2000). No ano seguinte, 1910, Chagas obteve o prêmio Shaudinn, conferido pelo Instituto Naval de Medicina de Hamburgo, por uma comissão que reunia a nata da microbiologia e da medicina tropical mundial. A doença de Chagas consolidou a protozoologia como área de concentração das pesquisas, assim como a inserção de Manguinhos (IOC) na comunidade científica internacional como importante centro de estudos sobre as doenças tropicais (Benchimol, 2000) Segundo Barata (2000), a forma de ocupação do espaço agrário e do espaço urbano em São Paulo em meados do século 20 determinou as condições extremamente favoráveis à ocorrência de doenças transmitidas por vetores, doenças de transmissão hídrica e doenças de transmissão respiratória. Dentre as doenças transmitidas por vetores, destacaram-se nesse período a febre amarela, a peste, a malária, as leishmanioses cutâneo-mucosas e a doença de Chagas. Em meados do século 20, eclodiu em São Paulo a epidemia de leishmaniose tegumentar durante a construção da Estrada de Ferro Noroeste, disseminando-se por toda a Alta Sorocabana, Alta Paulista e região noroeste do Estado, seguindo a penetração do homem e a derrubada das matas. A designação "úlcera de Bauru" surgiu em decorrência desse surto, visto que o acampamento dos trabalhadores localizava-se nessa cidade. Outros surtos ocorreram em cidades da região (Pirajuí, Birigui, Penápolis, Araçatuba), sendo que os casos ocorreram entre trabalhadores que derrubavam matas, moradores de vilas e povoados recém-instalados bem como sitiantes e fazendeiros (Pessôa, 1949). No final do século, a endemia retornou ao Estado, apresentando-se agora como doença de áreas periurbanas submetidas a processos de desmatamento para loteamento, nas quais os vetores apresentariam variação domiciliar. A doença, considerada inexistente no Estado, se manifestou em área que sofreu grande transformação econômica substituindo a criação de gado pelo plantio da cana, na qual se emprega, temporariamente, grande contingente de mão de obra migrante durante a colheita (Barata, 2000). As características epidemiológicas da ocorrência de malária em São Paulo refletem as condições de desenvolvimento socioeconômico do Estado. O início da cultura cafeeira, no século 19, começa a modificar
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