Parasitologia Clínica: Estudo e Diagnóstico

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<p>W</p><p>BA</p><p>10</p><p>36</p><p>_V</p><p>1.</p><p>0</p><p>PARASITOLOGIA CLÍNICA</p><p>2</p><p>Chamberttan Souza Desidério</p><p>São Paulo</p><p>Platos Soluções Educacionais S.A</p><p>2022</p><p>PARASITOLOGIA CLÍNICA</p><p>1ª edição</p><p>3</p><p>2022</p><p>Platos Soluções Educacionais S.A</p><p>Alameda Santos, n° 960 – Cerqueira César</p><p>CEP: 01418-002— São Paulo — SP</p><p>Homepage: https://www.platosedu.com.br/</p><p>Head de Platos Soluções Educacionais S.A</p><p>Silvia Rodrigues Cima Bizatto</p><p>Conselho Acadêmico</p><p>Alessandra Cristina Fahl</p><p>Ana Carolina Gulelmo Staut</p><p>Camila Braga de Oliveira Higa</p><p>Camila Turchetti Bacan Gabiatti</p><p>Giani Vendramel de Oliveira</p><p>Gislaine Denisale Ferreira</p><p>Henrique Salustiano Silva</p><p>Mariana Gerardi Mello</p><p>Nirse Ruscheinsky Breternitz</p><p>Priscila Pereira Silva</p><p>Coordenador</p><p>Camila Braga de Oliveira Higa</p><p>Revisor</p><p>Tatiane Marques</p><p>Editorial</p><p>Beatriz Meloni Montefusco</p><p>Carolina Yaly</p><p>Márcia Regina Silva</p><p>Paola Andressa Machado Leal</p><p>Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)_____________________________________________________________________________</p><p>Desidério, Chamberttan Souza</p><p>Parasitologia clínica / Chamberttan Souza Desidério. –</p><p>São Paulo: Platos Soluções Educacionais S.A., 2022.</p><p>200 p.</p><p>ISBN 978-65-5356-367-4</p><p>1. Parasitologia. 2. Parasitologia clínica. 3. Análises</p><p>clínicas. I. Título.</p><p>3. Técnicas de speaking, listening e writing. I. Título.</p><p>CDD 616.96</p><p>_____________________________________________________________________________</p><p>Evelyn Moraes – CRB: 010289/O</p><p>D457p</p><p>© 2022 por Platos Soluções Educacionais S.A.</p><p>Todos os direitos reservados. Nenhuma parte desta publicação poderá ser reproduzida ou</p><p>transmitida de qualquer modo ou por qualquer outro meio, eletrônico ou mecânico, incluindo</p><p>fotocópia, gravação ou qualquer outro tipo de sistema de armazenamento e transmissão de</p><p>informação, sem prévia autorização, por escrito, da Platos Soluções Educacionais S.A.</p><p>https://www.platosedu.com.br/</p><p>4</p><p>SUMÁRIO</p><p>Apresentação da disciplina __________________________________ 05</p><p>Abordagem instrumental e prática da Parasitologia Clínica __ 07</p><p>Principais parasitoses intestinais, sanguíneas e sistêmicas de</p><p>interesse médico no Brasil ___________________________________ 17</p><p>Metodologias de investigação laboratorial usadas na</p><p>identificação dos principais parasitas humanos ______________ 30</p><p>Métodos avançados na identificação das parasitoses de maior</p><p>incidência no mundo atual ___________________________________ 42</p><p>PARASITOLOGIA CLÍNICA</p><p>5</p><p>Apresentação da disciplina</p><p>Seja bem-vindo à disciplina Parasitologia clínica! Essa é uma área em</p><p>saúde que trabalha para o diagnóstico e o tratamento de doenças,</p><p>principalmente aquelas doenças causadas por parasitos, sejam eles</p><p>intestinais, sanguíneos ou tissulares. O Laboratório de Análises Clínicas,</p><p>especificamente, realiza exames que possibilitam a confirmação</p><p>diagnóstica dessas parasitoses, através de pesquisa em amostras de</p><p>fezes, sangue e tecidos.</p><p>Inicialmente, você estudará os aspectos clínicos da parasitologia no</p><p>laboratório de Análises Clínicas, conhecendo as amostras biológicas que</p><p>podem ser testadas para exame clínico e as classes de doenças a serem</p><p>diagnosticadas. Posteriormente, aprenderá como esses exames podem</p><p>auxiliar no diagnóstico de parasitoses sanguíneas, teciduais e intestinais,</p><p>sejam elas causadas por protozoários ou helmintos.</p><p>Conhecer os principais exames em parasitologia clínica é muito</p><p>importante, porém estar atento às novas tecnologias existentes na área</p><p>também é extremamente necessário. Várias parasitoses são problemas</p><p>de saúde mundial, e algumas são extremamente negligenciadas, sendo,</p><p>portanto, os exames diagnósticos de suma importância para o controle</p><p>dessas doenças. Ao longo do tempo, podem surgir novas parasitoses,</p><p>bem como novas espécies relacionadas a elas.</p><p>Dessa forma, é essencial conhecer as inovações tecnológicas mais</p><p>recentes nesse setor e ser um exímio microscopista, visto que a maior</p><p>parte do diagnóstico parasitológico não é automatizado. Nesse contexto,</p><p>não podemos esquecer que novas técnicas resultam em maiores</p><p>sensibilidades e especificidades diagnósticas.</p><p>6</p><p>O setor de parasitologia clínica vivencia, em sua rotina diária, o desafio</p><p>de diagnosticar com precisão uma parasitose, superando os desafios</p><p>de ser um dos setores menos automatizados. Técnicas imunológicas e</p><p>moleculares auxiliam em um diagnóstico efetivo, porém, para a liberação</p><p>de um laudo preciso, você deve estar sempre atualizado e saber</p><p>interpretar essas técnicas e correlacionar os resultados encontrados com</p><p>a suposição diagnóstica.</p><p>Bons estudos!</p><p>7</p><p>Abordagem instrumental e</p><p>prática da Parasitologia Clínica</p><p>Autoria: Chamberttan Souza Desidério</p><p>Leitura crítica: Tatiane Marques</p><p>Objetivos</p><p>• Compreender a importância do setor de</p><p>Parasitologia no Laboratório Clínico para o</p><p>diagnóstico de enfermidades.</p><p>• Conhecer os principais instrumentos utilizados no</p><p>setor de Parasitologia Clínica.</p><p>• Correlacionar os exames realizados no setor de</p><p>Parasitologia Clínica indicando as técnicas mais</p><p>utilizadas e a amostra adequada.</p><p>8</p><p>1. Parasitologia clínica e sua importância</p><p>diagnóstica</p><p>A parasitologia é uma ciência da saúde preocupada com o estudo de</p><p>parasitos invertebrados, protozoários e alguns parasitos vertebrados.</p><p>Seus principais objetivos são tratar e desenvolver problemas causados</p><p>por parasitos e identificar os processos de origem das epidemias</p><p>parasitárias. É fundamental que os parasitologistas tenham uma boa</p><p>compreensão do ciclo de vida do parasito, das formas de infecção e dos</p><p>fatores que influenciam sua disseminação.</p><p>O estudo dessa ciência é muito importante, porque os parasitos causam</p><p>doenças complexas e que, muitas vezes, levam à morte dos indivíduos</p><p>afetados. O Laboratório de Parasitologia Clínica deve acompanhar as</p><p>mudanças em nível global, pois, embora seja uma ciência antiga, está</p><p>sujeita a constantes mudanças, seja pelos avanços nos diagnósticos</p><p>ou pela adaptação dos parasitos ao ambiente e a seus hospedeiros.</p><p>A pesquisa em Parasitologia também é de grande importância na</p><p>medicina, pois permite que profissionais médicos desenvolvam métodos</p><p>de prevenção, reabilitação e promoção da saúde.</p><p>1.1 Infecções parasitárias e a importância dos exames</p><p>laboratoriais</p><p>As infecções parasitárias são causadas por protozoários (tissulares</p><p>e sanguíneos) e helmintos e, por muitas vezes, acabam por afetar as</p><p>condições de vida do hospedeiro. Ainda são consideradas um problema</p><p>de saúde pública por serem prevalentes em diversas partes do País.</p><p>A maior parte dessas parasitoses é diagnosticada somente por exames</p><p>laboratoriais. Como os sintomas são altamente inespecíficos, os testes</p><p>laboratoriais são essenciais para obter resultados satisfatórios e ajudar</p><p>o especialista a fazer o diagnóstico. Na maioria dos casos, mostram as</p><p>9</p><p>espécies dos parasitos infectantes e ajudam os médicos a orientar o</p><p>tratamento com maior eficiência (ENGROFF et al., 2021).</p><p>Embora vários métodos imunológicos e moleculares permitam o</p><p>diagnóstico indireto de doenças parasitárias por meio da detecção de</p><p>produtos parasitários (antígenos ou material nuclear) ou respostas</p><p>específicas do hospedeiro (humorais ou celulares), a visualização direta</p><p>de parasitos continua sendo um recurso essencial em diagnósticos</p><p>de infecções específicas. O diagnóstico de parasitos consiste na</p><p>identificação direta de parasitos nos tecidos ou secreções de indivíduos</p><p>infectados, com ou sem o uso de métodos de enriquecimento,</p><p>isolamento ou cultura, que serão abordados posteriormente (FERREIRA,</p><p>2020).</p><p>Figura 1 – Representação esquemática da localização das principais</p><p>protozooses intestinais e helmintoses</p><p>Fonte: Shutterstock.com.</p><p>10</p><p>1.2 Amostras utilizadas em exames parasitológicos –</p><p>Coleta e processamento</p><p>Os laboratórios normalmente recebem uma variedade de materiais</p><p>biológicos que precisam ser rastreados para parasitos, como amostras</p><p>de sangue, urina e fezes. O diagnóstico laboratorial depende dos</p><p>achados parasitários na amostra testada. No entanto, os componentes</p><p>da</p><p>seu papel no arsenal diagnóstico da</p><p>leishmaniose. Porém, já foi descrito para o diagnóstico de malária</p><p>porque pode detectar várias espécies simultaneamente em um tempo</p><p>considerado curto (ENGROFF et al., 2021; REY, 2014; ZEIBIG, 2014).</p><p>Referências</p><p>ENGROFF, P. et al. Parasitologia Clínica. Porto Alegre: Grupo A, 2021.</p><p>FERREIRA, M. U. Parasitologia Contemporânea. Rio de Janeiro: Grupo GEN, 2020.</p><p>NEVES, D. P. Parasitologia humana. 13. ed. São Paulo: Atheneu, 2016.</p><p>OPAS. Organização Pan-Americana da Saúde. Plano de ação para a eliminação de</p><p>doenças infecciosas negligenciadas e pós-eliminação 2016-2022. Washington,</p><p>D.C.: OPAS, 2016.</p><p>REY, L. Parasitologia: parasitos e doenças parasitárias do homem nos trópicos</p><p>ocidentais. 4. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2014.</p><p>SIQUEIRA-BATISTA, R. Parasitologia – Fundamentos e Prática Clínica. Rio de</p><p>Janeiro: Grupo GEN, 2020.</p><p>WHO. World Health Organization. World Malaria Report. Geneva: WHO, 2021.</p><p>ZEIBIG, E. A. Parasitologia clínica: uma abordagem clínico-laboratorial. 2. ed. Rio de</p><p>Janeiro: Elsevier, 2014.</p><p>53</p><p>BONS ESTUDOS!</p><p>Sumário</p><p>Apresentação da disciplina</p><p>Abordagem instrumental e prática da Parasitologia Clínica</p><p>Objetivos</p><p>1. Parasitologia clínica e sua importância diagnóstica</p><p>Referências</p><p>Principais parasitoses intestinais, sanguíneas e sistêmicas de interesse médico no Brasil</p><p>Objetivos</p><p>1. Parasitismo</p><p>Referências</p><p>Metodologias de investigação laboratorial usadas na identificação dos principais parasitas humanos</p><p>Objetivos</p><p>1. Exame parasitológico de fezes</p><p>2. Método direto a fresco</p><p>Referências</p><p>Métodos avançados na identificação das parasitoses de maior incidência no mundo atual</p><p>Objetivos</p><p>1. Métodos imunológicos</p><p>Referências</p><p>amostra do hospedeiro (células, restos de comida) podem dificultar</p><p>ou impossibilitar a identificação desses parasitos, pois formam ruídos,</p><p>dificultando a identificação dos sinais expressos pelo parasito, cuja</p><p>detecção leva ao diagnóstico etiológico.</p><p>Nesse contexto, para dar aos estudos de parasitos a confiança</p><p>necessária, as técnicas utilizadas devem ser projetadas para aumentar</p><p>a relação sinal-ruído e reduzir as fontes de interferência na imagem</p><p>do parasito. Em algumas circunstâncias, as amostras de tecido em que</p><p>ocorre a migração do parasito são testadas para a forma de diagnóstico</p><p>do parasito. Um exemplo é o exame de segmentos de mucosa retal para</p><p>pesquisa de ovos de S. mansoni, abordagem diagnóstica que foi usada</p><p>até alguns anos atrás (FERREIRA, 2020).</p><p>A maior parte das amostras utilizadas em diagnósticos parasitológicos</p><p>são fezes, que podem ser utilizadas para diagnóstico laboratorial na</p><p>forma de amostras frescas ou conservadas. Se uma amostra fresca for</p><p>coletada, toda a massa fecal pode ser avaliada visualmente para uma</p><p>parte do material liberado, enquanto outra parte do material liberado</p><p>é submetida ao exame parasitológico. Geralmente, um recipiente com</p><p>uma média de 30-40 gramas de fezes é enviado ao laboratório para</p><p>exames macroscópico e microscópico (ENGROFF et al., 2021).</p><p>As fezes humanas são compostas, entre outras coisas, por água, muco,</p><p>gordura, flocos de células intestinais, bactérias e restos de origem</p><p>vegetal ou animal. Elas podem, sob certas condições patológicas, conter</p><p>sangue e pus, bem como helmintos e partes deles, como segmentos</p><p>11</p><p>de tênia. As bactérias compõem cerca de 30% das partículas e são a</p><p>principal causa da aparência turva observada em suspensões aquosas</p><p>de fezes humanas. Outras partículas sólidas de diferentes dimensões</p><p>também dificultam a observação de parasitos nas fezes, a menos que o</p><p>material esteja muito diluído. É o caso dos chamados testes diretos, que</p><p>se aplicam principalmente à busca de trofozoítos vivos de protozoários</p><p>intestinais em fezes recém-excretadas (FERREIRA, 2020).</p><p>O exame parasitológico fecal consiste em duas etapas: uma</p><p>macroscópica, que pode detectar e identificar macroparasitas</p><p>naturalmente excretados, e outra microscópica, que identifica a</p><p>presença de cistos e trofozoítos de protozoários, além de larvas e ovos</p><p>de helmintos. Deve-se ter cuidado na coleta de formas parasitárias em</p><p>amostras fecais, pois o método de coleta afeta diretamente o resultado</p><p>do estudo (SIQUEIRA-BATISTA, 2020).</p><p>As amostras fecais para teste devem ser coletadas em recipientes</p><p>limpos, de boca larga, sem vazamentos, livres de urina e sujeira.</p><p>Geralmente, amostras coletadas dentro de uma semana após a</p><p>administração de laxantes fortes não devem ser aceitas para teste.</p><p>Raramente, se houver suspeita de amebíase, giardíase ou nematose, são</p><p>usados laxantes salinos (fosfato de sódio ou sulfato de sódio). Primeiro,</p><p>a consistência das fezes deve ser observada, e, para isso, a quantidade</p><p>mínima necessária para um teste adequado é de 2-5 g. Elas não devem</p><p>ser incubadas ou congeladas, mas podem ser armazenado na geladeira</p><p>(FERREIRA, 2020).</p><p>As amostras fecais podem ser utilizadas para diagnóstico laboratorial na</p><p>forma de amostras frescas ou conservadas. Se uma amostra fresca for</p><p>coletada, toda a massa fecal pode ser avaliada visualmente para uma</p><p>parte do material liberado, enquanto outra parte do material liberado é</p><p>submetida a exame parasitológico. Geralmente, um recipiente com uma</p><p>média de 30-40 gramas de fezes é enviado ao laboratório para exame</p><p>macroscópico e microscópico. No caso dessas amostras, podem ser</p><p>12</p><p>um exame de única amostra ou de várias coletas (múltiplas). Amostras</p><p>individuais são retiradas diretamente do recipiente e entregues no</p><p>mesmo dia da coleta, enquanto amostras múltiplas ou únicas que</p><p>não sejam entregues no mesmo dia devem ser coletadas diretamente</p><p>ou transferidas para um recipiente contendo solução conservante</p><p>(ENGROFF et al., 2021).</p><p>Figura 2 – Recipiente para a coleta de amostra de fezes</p><p>Fonte: Shutterstock.com.</p><p>1.3 Abordagem instrumental da Parasitologia Clínica</p><p>O instrumento mais importante no laboratório de parasitologia é o</p><p>microscópio, que é um dos recursos mais utilizados e deve ter um</p><p>bom sistema óptico para detectar efetivamente os parasitos. Devido</p><p>ao pequeno tamanho das estruturas parasitárias, é importante que o</p><p>aparelho tenha uma ocular com escala de medição, a chamada ocular</p><p>micrométrica, e esteja muito bem calibrado para que o especialista</p><p>possa obter medições precisas do material analisado.</p><p>13</p><p>O exame microscópico das fezes deve ser realizado com o máximo</p><p>cuidado e qualidade. Nesse caso, é importante que o microscopista</p><p>saiba avaliar o exame e usar o microscópio corretamente. Ele deve</p><p>ser treinado para fornecer conhecimento suficiente e detalhado</p><p>da morfologia do parasito para poder identificar o parasito e seus</p><p>fragmentos nas amostras obtidas (ZEIBIG, 2014).</p><p>O estágio de diagnóstico de um parasito ao microscópio é sempre</p><p>medido em unidades chamadas micrômetros. Os profissionais que</p><p>operam microscópios usam o tamanho para poder distinguir os</p><p>parasitos. Uma ocular micrométrica consiste em um disco de vidro</p><p>que é inserido no microscópio, equipado com uma régua dividida</p><p>uniformemente em 50 ou 100 unidades representando várias medidas.</p><p>É importante saber calibrar a ocular milimétrica para determinar a</p><p>quantos mícrons corresponde cada divisão. Em laboratórios, o teste</p><p>mais comumente usado é o exame direto a fresco (ENGROFF et al.,</p><p>2021).</p><p>Para a microscopia, é obrigatório o uso de um micrômetro ocular</p><p>no diagnóstico de parasitos para que o tamanho do parasito, ovos,</p><p>cistos e oocistos de protozoários possam ser determinados. Ao</p><p>escolher o método, há algumas coisas a serem consideradas. A análise</p><p>microscópica direta ou úmida pode ser realizada em lâminas ou</p><p>lamínulas, o que é feito usando soluções fisiológicas, azul de metileno</p><p>tamponado ou Lugol para destacar a forma vegetativa. Em geral,</p><p>o teste de método direto pode ser facilmente realizado na rotina</p><p>laboratorial, permitindo ao microscopista observar estágios diagnósticos</p><p>em protozoários, como cistos, trofozoítos, oocistos e esporos, e em</p><p>helmintos, como ovos e larvas.</p><p>A microscopia fecal também pode identificar e revelar outras</p><p>anormalidades nas amostras submetidas e características diagnósticas</p><p>de parasitos e outras patologias relacionadas, como glóbulos vermelhos,</p><p>glóbulos brancos, eosinófilos, macrófagos, células epiteliais, cristais e</p><p>14</p><p>fungos. Ela pode exigir etapas diferentes a depender da consistência das</p><p>amostras enviadas ao laboratório. Além disso, é necessário considerar o</p><p>tipo de conservante utilizado para fixar as sementes e as manifestações</p><p>clínicas do paciente que indiquem a presença do parasito em particular</p><p>(ENGROFF et al., 2021).</p><p>Figura 3 – Microscópio para a análise de amostras de fezes</p><p>Fonte: Shutterstock.com.</p><p>1.4 Métodos de avaliação de parasitos que utilizam</p><p>outras amostras biológicas</p><p>Outras amostras, incluindo sangue, biópsia de tecido, LCR, escarro,</p><p>urina e material genital, também podem ser testadas quanto à</p><p>presença de parasitos. Em alguns casos, são tratadas essencialmente</p><p>da mesma forma que as fezes. Por outro lado, amostras de sangue</p><p>são tradicionalmente processadas de forma diferente. Por exemplo, a</p><p>microscopia seguida de coloração Giemsa é o procedimento de escolha</p><p>para amostras de sangue submetidas a estudos de parasitos.</p><p>15</p><p>Muitas outras técnicas tradicionais e novas estão disponíveis para o</p><p>diagnóstico de parasitos. Os testes tradicionais incluem o método da</p><p>fita gomada, a coleta de ovos de parasitos Enterobius vermicularis e o</p><p>enteroteste (método da cápsula duodenal), para coletar vários tipos de</p><p>parasitos (ZEIBIG, 2014).</p><p>Existem várias formas ou estágios de parasitos na circulação que</p><p>podem ser diagnosticadas com precisão com exames de sangue, como</p><p>Plasmodium, Microfilaria e Leishmania e o gênero Trypanosoma. Os</p><p>estudos</p><p>desses tipos de parasitos podem ser realizados em amostras</p><p>frescas ou em esfregaços espessos com posterior coloração, o que</p><p>facilita a visualização no microscópio.</p><p>O método direto é feito na hora, realizado imediatamente após a coleta</p><p>de sangue. No teste direto ou fresco, uma pequena quantidade de</p><p>sangue é colocada em uma lâmina e examinada ao microscópio usando</p><p>uma lente de aumento (NEVES, 2016). Já o método indireto consiste em</p><p>um método de esfregaço, também conhecido como dilatação do sangue,</p><p>e é feito para contar e identificar anormalidades nas células do sangue.</p><p>O diagnóstico heterólogo é realizado com o uso de triatomíneos na</p><p>área infectada do paciente para que seja retirado o máximo de sangue</p><p>possível. Os insetos devem estar limpos e ser produzidos em laboratório</p><p>para que o teste funcione bem. Para serem usados nesse estudo, devem</p><p>jejuar por várias semanas, e seis ninfas devem ser colocadas em caixas</p><p>de papelão, fechadas com filo e presas com elásticos (NEVES, 2016).</p><p>Essa caixa é então fixada na pele do paciente e o inseto a penetra.</p><p>Esse processo ocorre em 30 minutos. Para coletar o sangue sugado,</p><p>é importante massagear o abdômen do inseto e apertá-lo para que</p><p>as gotas de fezes saiam. Essas fezes são colocadas em lâminas de</p><p>microscópio com solução salina e cobertas com lamínulas para exame</p><p>sob um microscópio.</p><p>16</p><p>Um esfregaço justaposto é realizado comprimindo um fragmento</p><p>de tecido obtido por biópsia, que é colocado em uma lâmina de</p><p>microscópio. Um especialista deve remover pedaços de pele onde o</p><p>procedimento de esfregaço é realizado por aposição para cada lâmina.</p><p>Os exames de impressão e swab devem ser realizados em lâminas de</p><p>vidro secas. O material deve ser fixado em metanol por três minutos e</p><p>corado pelo método de Giemsa ou Leishman (NEVES, 2016).</p><p>Neste Tema, falamos sobre Parasitologia Clínica; materiais biológicos</p><p>que podem ser utilizados para a pesquisa de parasitos; amostras fecais</p><p>e seus componentes; e as maneiras corretas de armazenamento e</p><p>processamento dessas amostras. Além disso, estudamos sobre outros</p><p>materiais que podem ser utilizados para o diagnóstico laboratorial de</p><p>parasitoses e algumas técnicas que são utilizadas com esses materiais,</p><p>bem como os principais instrumentos utilizados na Parasitologia Clínica.</p><p>Como isso, foi possível entender a importância de um profissional de</p><p>excelência na avaliação desses exames.</p><p>Agora que você já sabe as principais aplicações da Parasitologia</p><p>Clínica, lembre-se de que são de extrema importância e quase sempre</p><p>primordiais para a detecção de infecções parasitárias.</p><p>Referências</p><p>ENGROFF, P. et al. Parasitologia Clínica. Porto Alegre: Grupo A, 2021.</p><p>FERREIRA, M. U. Parasitologia Contemporânea. Rio de Janeiro: Grupo GEN, 2020.</p><p>NEVES, D. P. Parasitologia humana. 13. ed. São Paulo: Atheneu, 2016.</p><p>SIQUEIRA-BATISTA, R. Parasitologia – Fundamentos e Prática Clínica. Rio de</p><p>Janeiro: Grupo GEN, 2020.</p><p>ZEIBIG, E. A. Parasitologia clínica: uma abordagem clínico-laboratorial. 2. ed. Rio de</p><p>Janeiro: Elsevier, 2014.</p><p>17</p><p>Principais parasitoses intestinais,</p><p>sanguíneas e sistêmicas de</p><p>interesse médico no Brasil</p><p>Autoria: Chamberttan Souza Desidério</p><p>Leitura crítica: Tatiane Marques</p><p>Objetivos</p><p>• Compreender os conceitos do parasitismo e das</p><p>parasitoses.</p><p>• Conhecer as principais parasitoses intestinais,</p><p>sanguíneas e sistêmicas existentes.</p><p>• Abordar o diagnóstico de algumas das principais</p><p>parasitoses intestinais.</p><p>18</p><p>1. Parasitismo</p><p>É uma relação ecológica desenvolvida entre indivíduos de diferentes</p><p>espécies, na qual se observam relações próximas e duradouras, bem</p><p>como graus variados de dependência metabólica. Na maioria dos casos,</p><p>um organismo (o parasito) recebe nutrientes de outro organismo (o</p><p>hospedeiro) e causa lesão, mas não a morte (SIQUEIRA-BATISTA, 2020).</p><p>No entanto, dependendo do tempo e das circunstâncias específicas,</p><p>as adaptações que ocorrem no parasito e no hospedeiro podem dar</p><p>errado, o que pode levar à extinção do hospedeiro, que muitas vezes é o</p><p>humano.</p><p>Em geral, as interações entre parasitos tornam-se menos negativas</p><p>ao longo do tempo quando o ambiente é equilibrado e diversificado o</p><p>suficiente para que ambos os organismos se adaptem. No início das</p><p>coalizões parasitárias, as populações de parasitos e hospedeiros tendem</p><p>a se comportar de maneira semelhante às espécies que interagem como</p><p>predadores e presas. Depois de um tempo, no entanto, o potencial de</p><p>adaptação tende a equilibrá-las. Significa uma alimentação lateral, isto é,</p><p>refere-se a uma comunidade em que um dos parceiros, geralmente um</p><p>pequeno parasito, beneficia-se em detrimento de outro parasito maior,</p><p>conhecido como hospedeiro. Entre os organismos, isso é geralmente</p><p>expresso em termos quantitativos; porém, na Parasitologia Humana, o</p><p>dano ao hospedeiro é caracterizado mais subjetivamente como doença.</p><p>A definição de parasitos é menos precisa quando se trata de relevância</p><p>para o ser humano, pois o conceito de doença não é apenas biológico,</p><p>mas inclui características culturais e psicológicas, nem sempre sendo</p><p>acompanhada de sinais e sintomas graves, como lesões cutâneas</p><p>evidentes. Muitos sintomas clínicos são insidiosos e sutis. Além disso,</p><p>infecções livres de doença não são incomuns, situação em que alguns</p><p>hospedeiros parecem suportar a presença de parasitos sem apresentar</p><p>sinais ou sintomas de infecção. Diferenças na susceptibilidade da</p><p>população hospedeira, carga parasitária e virulência parasitária são</p><p>19</p><p>algumas das explicações mais comuns para essa heterogeneidade na</p><p>apresentação clínica da infecção parasitária. Hospedeiros parasitários</p><p>assintomáticos são frequentemente importantes reservatórios de</p><p>infecção e permanecem por muito tempo não reconhecidos e não</p><p>tratados. Plasmodium e amebas intestinais são exemplos de parasitas</p><p>frequentemente associados a grandes reservatórios assintomáticos</p><p>(NEVES, 2016; SIQUEIRA-BATISTA, 2020).</p><p>1.1 Infecções parasitárias e a importância dos exames</p><p>laboratoriais</p><p>Em nosso ecossistema, ocorre a presença de diferentes tipos de</p><p>parasitos que podem exercer função em uma relação parasito-</p><p>hospedeiro. Sobre o parasitismo, inúmeros organismos podem exercer</p><p>o papel de parasita obrigatório ou de parasita facultativo, e ainda ficar</p><p>fora (ectoparasita) ou dentro do hospedeiro (endoparasita). Da mesma</p><p>forma, muitos hospedeiros diferentes podem participar dessa relação</p><p>parasito-hospedeiro, incluindo hospedeiros acidentais, definitivos,</p><p>intermediários, reservatórios, de transporte e portadores.</p><p>Uma vez que o parasito infecta o hospedeiro, a principal função deste</p><p>é abrigar o ciclo biológico do parasito. Esse relacionamento recém-</p><p>formado pode evoluir para simbiose, mutualismo ou parasitismo.</p><p>Algumas dessas associações existem em formas simbióticas em algumas</p><p>situações e em formas patogênicas em outras.</p><p>Os parasitos têm uma incrível capacidade de se adaptar ao ambiente</p><p>de seu hospedeiro. Além de várias adaptações morfológicas, podem</p><p>se defender contra o sistema imunológico deste, pois modificam os</p><p>componentes antigênicos para que o hospedeiro não os reconheça</p><p>como estranhos e, portanto, não inicie uma resposta imune. Uma</p><p>investigação mais profunda das relações parasito-hospedeiro não está</p><p>incluída neste Tema, mas considerações e discussões sobre esse ponto</p><p>20</p><p>são apresentadas no próximo Tema, mais especificamente para alguns</p><p>parasitos (ZEIBIG, 2014).</p><p>1.2 Diagnóstico das principais parasitoses intestinais</p><p>O exame parasitológico de fezes (EPF) é um procedimento de exame de</p><p>rotina para doenças suspeitas de serem causadas por parasitos cujas</p><p>estruturas são encontradas nas fezes. Não existe nenhuma tecnologia</p><p>moderna para detectar todas as formas parasitárias encontradas nas</p><p>fezes, mas existem métodos amplos e mais específicos que podem</p><p>revelar um grande número de patógenos. Nesse contexto, temos os</p><p>seguintes parasitos fecais encontrados no sistema digestivo de humanos</p><p>ou animais não humanos: protozoários patogênicos, como Balantidium</p><p>coli,</p><p>Entamoeba histolytica e Giardia lamblia; e alguns helmintos, como</p><p>Ascaris lumbricoides, Ancylostoma duodenale, Necator americanus,</p><p>Strongyloides stercoralis, Trichuris trichiura, Enterobius vermicularis,</p><p>Taenia saginata, Taenia solium, Hymenolepis nana e Schistosoma mansoni</p><p>(ENGROFF et al., 2021).</p><p>1.3 Principais parasitoses e seus diagnósticos</p><p>As amebas são protozoários pertencentes a Ordens e Famílias que os</p><p>histologistas agrupam e reagrupam de várias maneiras com resultados</p><p>insatisfatórios. Como o aparelho flagelar pode ter existido apenas</p><p>temporariamente (como parte do ciclo de vida da espécie, apresentado</p><p>na Figura 1), a mera separação de rizópodes e flagelados com base na</p><p>presença ou ausência de um flagelo não é possível em detalhes, e pode</p><p>ter sido parcial ou completamente perdido por certas espécies.</p><p>É de interesse médico a divisão da Entamoebita, que inclui formas de</p><p>vida livre de comensais, bem como parasitos amebianos do sistema</p><p>digestivo ou tecidos de vertebrados. São pequenos, geralmente</p><p>desprovidos de vacúolos pulsáteis, e formam cistos mononucleares</p><p>21</p><p>ou multinucleados. Três gêneros, Entamoeba, Iodamoeba e Endolimax</p><p>(esta última pertencente à divisão Mastigamoebidae), são clinicamente</p><p>importantes para o diagnóstico atual da amebíase, em especial o gênero</p><p>Entamoeba. Trofozoítos de ameba, bem como cistos, são encontrados</p><p>em amostras fecais rastreadas para parasitos, principalmente em</p><p>amostras com consistência líquida, mole ou pastosa. É mais provável</p><p>que uma amostra de fezes formadas contenha cistos.</p><p>No diagnóstico, é importante considerar a presença de uma ou ambas as</p><p>formas morfológicas. A determinação precisa do tamanho do organismo</p><p>usando uma ocular micrométrica é essencial para a identificação de</p><p>amebas. A aparência das principais características nucleares, como o</p><p>número de núcleos presentes e a localização das estruturas nucleares,</p><p>é importante para distinguir corretamente as amebas patogênicas</p><p>das não patogênicas. A presença de outras estruturas e características</p><p>ameboides, como inclusões citoplasmáticas e motilidade, também ajuda</p><p>a distinguir esses organismos.</p><p>As lâminas com solução salina permitem a visualização da motilidade</p><p>ameboide, enquanto as montagens com Lugol permitem a visualização</p><p>de estruturas citoplasmáticas e nucleares internas. É importante notar</p><p>que um procedimento de coloração permanente deve ser realizado</p><p>para confirmar a identificação de parasitos. Na maioria dos casos,</p><p>características de identificação importantes não podem ser claramente</p><p>distinguidas sem coloração permanente. Com a coloração permanente,</p><p>muitas das estruturas refrativas e invisíveis são mais claramente visíveis</p><p>e, portanto, mais fáceis de identificar. No entanto, esse procedimento</p><p>reduz o tamanho de trofozoítos ameboides, resultando em medições</p><p>menores do que as normalmente observadas em preparações úmidas</p><p>(NEVES, 2016; ZEIBIG, 2014).</p><p>22</p><p>Figura 1 – Ciclo de vida da Entamoeba histolytica</p><p>Fonte: adaptada de Shutterstock.com.</p><p>A giardíase é uma doença com distribuição mundial, porém é</p><p>predominante em locais com clima temperado e tem como população</p><p>mais atingida as crianças em seus primeiros anos de vida. É causada</p><p>por um protozoário flagelado chamado de Giardia intestinalis (alguns</p><p>também consideram o termo Giardia duodenalis como sinônimo).</p><p>Inicialmente chamado de Cercomonas intestinalis, esse importante</p><p>flagelado foi descoberto em 1859 pelo cientista francês F. Lambl. Em</p><p>homenagem às significativas contribuições do Dr. Lambl e do cientista</p><p>tcheco Dr. Giard ao campo da Parasitologia, Stiles criou o termo Giardia</p><p>lamblia em 1915.</p><p>Esse parasito pode ter ambas as formas excretadas nas fezes,</p><p>trofozoítos são encontrados nas fezes diarreicas e cistos são</p><p>encontrados nas fezes formadas. Cistos são as formas infecciosas.</p><p>Os cistos ou trofozoítos são ingeridos pelo homem por meio de água</p><p>ou alimentos contaminados, e o desencistamento é desencadeado</p><p>pela ação de enzimas digestivas, de modo que os trofozoítos podem</p><p>23</p><p>permanecer livres na luz intestinal ou entrar no duodeno por meio de</p><p>discos de sucção, podendo aderir à parede. A fixação de protozoários</p><p>na mucosa intestinal prejudica a absorção de nutrientes, principalmente</p><p>gorduras e vitaminas lipossolúveis.</p><p>Os parasitos se multiplicam no intestino delgado por fissão binária</p><p>(Figura 2), sendo a gravidade da doença proporcional ao número de</p><p>parasitos. Os trofozoítos vivem no duodeno e na primeira parte do</p><p>jejuno, onde a atividade flagelar causa migração rápida e errática.</p><p>Quando ocorre o desencistamento, o trofozoíto reduz seu metabolismo</p><p>e tamanho, torna-se esférico, perde seu disco de sucção e flagelos e</p><p>secreta uma parede de cisto ao seu redor. A ingestão de cistos gera a</p><p>infecção com dois trofozoítos (NEVES, 2016; ZEIBIG, 2014).</p><p>Figura 2 – Ciclo de vida da Giardia lamblia</p><p>Fonte: adaptada de Shutterstock.com.</p><p>Parasitos hemoflagelados são aqueles que viajam via flagelos e</p><p>residem no sangue e nos tecidos. Os que determinam doença</p><p>clinicamente significativa no homem pertencem aos gêneros Leishmania</p><p>24</p><p>e Trypanosoma. Existem quatro formas clinicamente importantes</p><p>associadas a esses hemoflagelados: amastigotas, promastigotas,</p><p>epimastigotas e tripomastigotas. Todos os organismos desses dois</p><p>gêneros têm pelo menos duas dessas quatro formas, embora seus</p><p>ciclos de vida específicos possam diferir. Toda transmissão por</p><p>hemoflagelados ocorre através de picadas de vetores artrópodes. A</p><p>diferença diagnóstica mais importante entre os dois gêneros é a forma</p><p>morfológica predominante encontrada em humanos; para Leishmania é</p><p>amastigota e para Trypanosoma é tripomastigota (ZEIBIG, 2014).</p><p>A Leishmaniose é um grupo de doenças causadas por protozoários</p><p>do gênero Leishmania, que pertence ao subgrupo taxonômico</p><p>Kinetoplastida. Mais de 20 espécies desse gênero foram descritas como</p><p>patógenos de doenças humanas. Dos nove países da Comunidade dos</p><p>Estados de Língua Portuguesa (CPLP), apenas Brasil e Portugal têm casos</p><p>documentados de leishmaniose em humanos. No entanto, também</p><p>pode ocorrer em Angola, Moçambique e Guiné-Bissau. São países que</p><p>atualmente carecem de sistemas de saúde e regiões fronteiriças onde a</p><p>doença já foi identificada (Namíbia, fronteira com Angola e Moçambique)</p><p>ou é endêmica (Senegal, fronteira com Guiné-Bissau) (FERREIRA, 2020).</p><p>As várias formas clínicas podem ser divididas em Leishmaniose Cutânea</p><p>e Visceral. Apenas sete países (Brasil, Etiópia, Índia, Quênia, Somália,</p><p>Sudão e Sudão do Sul) apresentam altas concentrações de casos de</p><p>Leishmaniose Visceral. Os países com maior incidência de Leishmaniose</p><p>Tegumentar nos últimos anos são Afeganistão, Argélia, Brasil, Colômbia,</p><p>Irã e Síria. Diferentes estágios de diferenciação do parasito ocupam</p><p>diferentes habitats dentro do inseto (FERREIRA, 2020).</p><p>Imediatamente após a diferenciação em protoflagelados, os</p><p>protozoários são encontrados no interior do trofoblasto peritoneal</p><p>misturados com o conteúdo do repasto sanguíneo. Para escapar das</p><p>enzimas digestivas secretadas no saco alimentar, o protomastigota</p><p>escapa de seu interior e forma uma interface entre uma molécula</p><p>25</p><p>(lipofosfoglicano, GLP) na parte externa da membrana plasmática e uma</p><p>lectina no epitélio digestivo do inseto vetor. Promastigotas ligados ao</p><p>epitélio gastrointestinal propagam-se extensivamente. Após alguns dias,</p><p>ocorre a diferenciação das promastigotas metacíclicas com teor reduzido</p><p>de nutrientes no intestino. Moléculas presentes na superfície do parasito</p><p>são modificadas, resultando na perda de sua capacidade específica de</p><p>aderir às lectinas epiteliais (FERREIRA, 2020).</p><p>O método mais utilizado para o diagnóstico da Leishmaniose humana</p><p>baseia-se na detecção de amastigotas em tecidos infectados. Na</p><p>Leishmaniose Cutânea, o material a ser testado é obtido por biópsia,</p><p>punção ou cicatrização de lesões de pele ou mucosas. Na Visceral, é</p><p>obtido por aspiração da medula óssea e, raramente, do fígado ou baço.</p><p>As lesões</p><p>cutâneas devem ser puncionadas, cicatrizadas ou biopsiadas</p><p>nas bordas da lesão, em áreas com melhor preservação tecidual e maior</p><p>número de parasitos (FERREIRA, 2020).</p><p>A Tripanossomíase Americana (também conhecida como doença de</p><p>Chagas) foi descrita em 1909 pelo médico e cientista brasileiro Carlos</p><p>Chagas, após sua estadia em Lassance, no norte de Minas Gerais. O</p><p>professor havia recebido a tarefa de controlar a Malária na região,</p><p>onde se encontravam os trabalhadores da Estrada de Ferro Central</p><p>do Brasil. Entretanto, teve sua curiosidade despertada pela presença</p><p>de um inseto, comum na área, que picava os indivíduos durante as</p><p>horas de sono e que podia ser encontrado nas frestas das casas cujas</p><p>paredes eram, em sua maioria, de pau a pique. Devido a esse fato e</p><p>à frequente sintomatologia cardíaca e gastrintestinal, que ainda não</p><p>estava elucidada entre os habitantes locais naquela época, iniciou</p><p>uma pesquisa envolvendo o inseto e os residentes da cidade, com o</p><p>propósito de desvendar possíveis associações entre tais ocorrências.</p><p>Como consequência de sua pesquisa, descobriu um novo protozoário,</p><p>ao qual deu o nome de Trypanosoma cruzi, e demonstrou seu potencial</p><p>de infectar animais não humanos domésticos e de laboratório, bem</p><p>como o homem (REY, 2014; NEVES, 2016; SIQUEIRA-BATISTA, 2020).</p><p>26</p><p>O diagnóstico da doença pode ser realizado por métodos parasitológicos</p><p>e sorológicos. Os métodos parasitológicos baseiam sua investigação na</p><p>pesquisa do parasito nos fluidos e nos tecidos do hospedeiro, sendo</p><p>particularmente úteis para o diagnóstico da doença aguda, dada sua</p><p>elevada parasitemia. Investigações parasitológicas diretas ou indiretas</p><p>podem ser realizadas para esse fim. O ensaio parasitológico direto inclui</p><p>exames de sangue fresco usando um microscópio de luz, análise de</p><p>esfregaços de sangue por coloração de Giemsa, exame de precipitados</p><p>após centrifugação do soro ou líquido cefalorraquidiano (este último</p><p>se houver suspeita de meningoencefalite chagásica) e biópsia de</p><p>linfonodo ou chagoma de inoculação (com exame histopatológico para</p><p>amastigotas). Uma das técnicas mais úteis para estudar a doença de</p><p>Chagas congênita é o microhematócrito, que analisa o sangue do cordão</p><p>umbilical para a pesquisa de parasitos.</p><p>Já os métodos indiretos incluem hemoculturas realizadas com meio de</p><p>triptose com infusão de fígado (LIT) e xenodiagnóstico. Nesse ensaio,</p><p>triatomíneos não infectados conhecidos ingerem o sangue de pacientes</p><p>que estão sendo avaliados para a doença de Chagas (REY, 2014; NEVES,</p><p>2016; SIQUEIRA-BATISTA, 2020). Se o xenodiagnóstico for positivo,</p><p>os insetos excretam fezes carregadas de parasitos 30 a 40 dias após</p><p>o repasto sanguíneo. Acontece que tanto a hemocultura quanto o</p><p>xenodiagnóstico têm a desvantagem de resultados tardios.</p><p>Existem também os métodos sorológicos, que são de grande relevância</p><p>para o diagnóstico na fase crônica, pois a parasitemia pode ser baixa</p><p>ou ausente. Entre os mais utilizados estão: Hemaglutinação Indireta</p><p>(HAI), Imunofluorescência Indireta (IFI) e Ensaio Imunoenzimático</p><p>(ELISA). Realizando a pesquisa de IgG e IgM, esta última pode resultar</p><p>em falsos positivos em algumas doenças febris. De fato, a IgM anti-T.</p><p>cruzi tem baixa sensibilidade, dificultando a padronização do ensaio e o</p><p>estabelecimento de controles. A reação em cadeia da polimerase (PCR)</p><p>mostrou-se promissora como um ensaio para estudos de fase aguda. No</p><p>entanto, não é considerado um teste diagnóstico isolado para confirmar</p><p>27</p><p>ou descartar a tripanossomíase aguda na América, porque não há</p><p>protocolo definido (REY, 2014; NEVES, 2016; SIQUEIRA-BATISTA, 2020).</p><p>Os membros da família Filariidae são vermes filamentosos pontiagudos</p><p>de 2 a 50 cm de comprimento. Em geral, as fêmeas são duas vezes</p><p>maiores do que os machos e dão à luz formas pré-larvais mais longas,</p><p>chamadas de microfilárias. Microfilárias de Wuchereria bancrofti e de</p><p>outras espécies de interesse médico, como Brugia malayi, Brugia timori e</p><p>Loa loa) têm uma bainha que se assemelham a delicadas cascas de ovos</p><p>que envolvem as larvas.</p><p>O ciclo de vida da maioria das filárias envolve três estágios básicos:</p><p>I. Ingestão de microfilárias por insetos hematófagos.</p><p>II. Conversão de microfilárias em vetores para larvas de primeiro</p><p>estágio (L1), ou rabditiformes, e depois para larvas infectantes de</p><p>terceiro estágio (L3), ou filarióides.</p><p>III. Infecção de novos hospedeiros por picadas de vetores portadores</p><p>de larvas semelhantes a filárias na probóscide.</p><p>Larvas de W. bancrofti se desenvolvem em adultos na circulação linfática,</p><p>enquanto os adultos de Onchocerca volvulus e L. loa são encontrados</p><p>no tecido conjuntivo subcutâneo. Vários meses após a infecção do</p><p>hospedeiro definitivo, as fêmeas começam a eliminar as microfilárias</p><p>encontradas no sangue periférico ou nas lesões cutâneas. A suspeita</p><p>diagnóstica de filariose linfática é baseada em achados clínicos (REY,</p><p>2014; NEVES, 2016; SIQUEIRA-BATISTA, 2020).</p><p>As microfilárias são geralmente encontradas no sangue periférico de</p><p>pacientes com edema, indicando a presença de infecção ativa. O oposto</p><p>ocorre em pacientes com linfedema crônico, nos quais as microfilárias</p><p>circulantes são raras. Não há ferramentas suficientes para o diagnóstico</p><p>laboratorial da filariose linfática, o qual baseia-se na detecção de</p><p>28</p><p>microfilárias no exame microscópico de amostras de sangue periférico</p><p>ou na detecção de vermes adultos em linfonodos na ultrassonografia.</p><p>As microfilárias são rastreadas com esfregaços espessos corados com</p><p>Giemsa preparados de 20 a 60 µl de sangue coletado durante a noite</p><p>entre 22h e 2h. Também é utilizado o método de Knott, que se baseia</p><p>na centrifugação, bem como um método de concentração em que</p><p>uma amostra de 1-5 ml de sangue venoso é filtrada através de uma</p><p>membrana de policarbonato com poros de 3 μm (REY, 2014; NEVES,</p><p>2016; SIQUEIRA-BATISTA, 2020).</p><p>Essas membranas são coradas com Giemsa e montadas em lâminas</p><p>para exame microscópico. Indivíduos infectados, especialmente aqueles</p><p>com sintomas clínicos, nem sempre apresentam microfilárias em seu</p><p>sangue periférico, e por isso a detecção de antígenos é mais sensível.</p><p>Há várias alternativas, visto que várias formas de produtos comerciais</p><p>foram desenvolvidas para essa finalidade. O mais popular é o ensaio</p><p>imunocromatográfico ICT BinaxNOW®, fabricado pela Alere, que</p><p>consiste em cartões impregnados com anticorpos monoclonais</p><p>desenvolvidos contra antígenos de W. bancrofti secretados e excretados.</p><p>Apresenta mais de 70% de sensibilidade quando comparado à filtração</p><p>por membrana, mas mostra reatividade cruzada em pessoas com alta</p><p>microfilaremia de L. loa.</p><p>O teste TropBio OgC3 Ag em formato de Imunoensaio Enzimático em</p><p>microplaca também detecta W. bancrofti. O verme adulto reside em</p><p>vasos linfáticos aumentados de linfonodos do hospedeiro. É raramente</p><p>revelado por biópsia da extremidade afetada, mas pode ser detectado</p><p>nos vasos linfáticos por ultrassonografia. Dessa forma, você pode</p><p>saber se eles estão vivos ou mortos. Esse é um parâmetro útil no</p><p>acompanhamento clínico pós-tratamento (FERREIRA, 2020; REY, 2014).</p><p>29</p><p>Referências</p><p>ENGROFF, P. et al. Parasitologia Clínica. Porto Alegre: Grupo A, 2021.</p><p>FERREIRA, M. U. Parasitologia Contemporânea. Rio de Janeiro: Grupo GEN, 2020.</p><p>NEVES, D. P. Parasitologia humana. 13. ed. São Paulo: Atheneu, 2016.</p><p>REY, L. Parasitologia: parasitos e doenças parasitárias do homem nos trópicos</p><p>ocidentais. 4. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2014.</p><p>SIQUEIRA-BATISTA, R. Parasitologia – Fundamentos e Prática Clínica. Rio de</p><p>Janeiro: Grupo GEN, 2020.</p><p>ZEIBIG, E. A. Parasitologia clínica: uma abordagem clínico-laboratorial. 2. ed. Rio de</p><p>Janeiro: Elsevier, 2014.</p><p>30</p><p>Metodologias de investigação</p><p>laboratorial usadas na</p><p>identificação dos principais</p><p>parasitas humanos</p><p>Autoria: Chamberttan Souza Desidério</p><p>Leitura crítica: Tatiane Marques</p><p>Objetivos</p><p>• Compreender os conceitos do parasitismo e das</p><p>parasitoses.</p><p>• Conhecer as principais parasitoses intestinais,</p><p>sanguíneas e sistêmicas existentes.</p><p>• Abordar o diagnóstico de algumas das principais</p><p>parasitoses intestinais.</p><p>31</p><p>1. Exame parasitológico de fezes</p><p>Talvez o procedimento mais realizado no campo da Parasitologia seja o</p><p>exame de amostras fecais para ovos e parasitos (abreviado EPF – Exame</p><p>Parasitológico de Fezes). Esse procedimento parasitológico de rotina tem</p><p>duas etapas gerais: exame macroscópico e microscópico de amostras</p><p>fecais. Como em todas as áreas de testes laboratoriais, a qualidade</p><p>dos resultados depende da coleta adequada de amostras. As análises</p><p>fecais e sanguíneas são etapas importantes no diagnóstico de doenças</p><p>parasitárias, pois diversos protozoários e helmintos representam formas</p><p>ou estágios evolutivos nos biomateriais de seus hospedeiros (animais</p><p>humanos ou não humanos).</p><p>Os componentes que podem ser analisados nessas áreas são dados</p><p>macroscópicos, microscópicos e bioquímicos obtidos a partir de diversos</p><p>métodos que permitem a recuperação e a identificação de morfologias</p><p>parasitárias nas amostras. Isso permite a observação precoce de</p><p>alterações no fígado e nas vias biliares, sangramento gastrointestinal,</p><p>síndrome de reabsorção decorrente de relações parasito-hospedeiro e</p><p>doenças parasitárias de estágio sanguíneo (Malária, Filariose, Doença do</p><p>Sono, doença de Chagas).</p><p>Ao testar e detectar patógenos em amostras biológicas, é necessário</p><p>considerar as orientações de coleta de material de cada paciente, pois</p><p>o objetivo da análise depende da correta execução do procedimento e</p><p>do manuseio adequado da amostra. Este Tema descreve brevemente</p><p>as principais técnicas de Exame Parasitológico de Fezes e sangue e sua</p><p>utilização na prática clínica de rotina para o diagnóstico de doenças</p><p>causadas por protozoários e helmintos.</p><p>2. Método direto a fresco</p><p>O exame direto de uma pequena porção (aproximadamente 2 mg)</p><p>de fezes recém-evacuadas aplicadas em lâmina e emulsificadas com</p><p>32</p><p>soro fisiológico revela trofozoítos móveis de ameba em amostras de</p><p>consistência pastosa ou líquida. No entanto, tem menos sensibilidade</p><p>para identificar cistos de protozoários, ovos de helmintos e larvas.</p><p>Amostras armazenadas também podem ser usadas à custa da perda</p><p>da mobilidade do trofozoíto. A coloração com solução de Lugol facilita</p><p>a identificação de cistos de protozoários, permitindo a visualização do</p><p>núcleo e corando os vacúolos de glicogênio que podem estar presentes</p><p>em seu interior. As características morfológicas dos trofozoítos podem</p><p>ser bem caracterizadas pela coloração com uma solução tampão de</p><p>azul de metileno. As amostras devem ser examinadas dentro de 5-10</p><p>minutos após a coloração para permitir a penetração adequada do</p><p>corante no trofozoíto. O tempo máximo recomendado para a análise é</p><p>de 30 minutos (FERREIRA, 2020).</p><p>Figura 1 – Exame direto a fresco</p><p>Fonte: Shutterstock.com.</p><p>33</p><p>2.1 Técnicas de concentração de amostras</p><p>Métodos para sondar as propriedades físicas de elementos parasitários,</p><p>como massa e tamanho específicos, são necessários para separar os</p><p>parasitos de partículas interferentes em amostras fecais e tornar a</p><p>relação sinal-ruído mais favorável aos microscopistas. Por exemplo,</p><p>a viscosidade das suspensões fecais é um dos fatores que determina</p><p>a taxa de variação do elemento parasito ou da sedimentação. As</p><p>técnicas de enriquecimento visam separar elementos parasitários de</p><p>outros elementos interferentes nas fezes usando etapas adicionais,</p><p>como sedimentação, flutuação e centrifugação. Geralmente, essa</p><p>técnica aumenta a sensibilidade diagnóstica na detecção de cistos de</p><p>protozoários e ovos de vermes (ENGROFF et al., 2021).</p><p>2.2 Método de sedimentação espontânea</p><p>O método de concentração simples ou sedimentação espontânea</p><p>também é conhecido como Método de Lutz, que utilizou pela primeira</p><p>vez a técnica, ou Método de Hoffman, Pons e Janer, que são os autores</p><p>que divulgaram posteriormente a técnica. Devido à sua simplicidade</p><p>e baixo custo, é amplamente utilizado em inquéritos epidemiológicos</p><p>de rotina, principalmente em áreas esquistossomóticas. Usada para</p><p>estudos de larvas, ovos e cistos, a técnica consiste na dissolução de</p><p>2 g de fezes em 100 ml de água. Após esse procedimento, a filtração</p><p>com gaze é realizada com copos fecais. O processo final baseia-se na</p><p>decantação de 2 a 24 horas. Após a decantação, uma ou duas gotas do</p><p>sedimento são coletadas com a ajuda de uma pipeta Pasteur, colocadas</p><p>em lâmina e coradas com Lugol, para posterior análise ao microscópio.</p><p>Entre as vantagens desse método, destaca-se a necessidade mínima</p><p>de vidraria. Por outro lado, apresenta como desvantagens a grande</p><p>quantidade de resíduo fecal que resta nessa amostra mesmo após a</p><p>34</p><p>decantação, o que pode dificultar o preparo para o exame em lâminas</p><p>(ENGROFF et al., 2021; REY, 2014).</p><p>2.3 Método de flutuação com sulfato de zinco</p><p>Também conhecido como Técnica de Faust, é utilizado desde 1938. É um</p><p>método de flutuação amplamente utilizado para a análise de ovos de</p><p>peso leve, mas é menos comum para larvas e ovos de helmintos e cistos</p><p>de protozoários. Para seu estudo, dissolve parte das fezes em nove</p><p>porções iguais de água limpa e homogeneíza bem. Após essa etapa, a</p><p>amostra é peneirada com gaze, e o filtrado é coletado e centrifugado a</p><p>2.500 RPM por 2 minutos. Após a centrifugação, decanta-se a amostra</p><p>e a centrifuga novamente. O processo deve ser repetido até que o</p><p>sobrenadante esteja incolor, momento em que se adiciona 10 ml de</p><p>sulfato de zinco com densidade de 1,18. Em seguida, centrifuga-se por 1</p><p>minuto a 2.500 RPM. A amostra é depositada em uma lâmina e adiciona-</p><p>se Lugol forte para análise.</p><p>Uma vantagem do método faustiano é a necessidade mínima de</p><p>vidraria. Porém, como desvantagem temos que a forma parasitária</p><p>pode ser deformada quando a amostra entra em contato com sulfato</p><p>de zinco, e por isso o material deve ser avaliado imediatamente (NEVES,</p><p>2016; ZEIBIG, 2014).</p><p>2.4 Técnica de Willis</p><p>O Método de Willis, muito utilizado em Portugal, é um método</p><p>de flutuação para triagem de ovos de Ancilostomídeos de baixa</p><p>densidade que consiste em dissolver uma pequena amostra fecal</p><p>(aproximadamente 1 g) em uma solução saturada de Cloreto de Sódio</p><p>(gravidade específica 1.200), transferindo-a para um recipiente com</p><p>cerca de 3 cm de diâmetro e volume aproximado de 20 ml, para que</p><p>o nível do líquido atinja a borda do recipiente. Para coletar os ovos,</p><p>35</p><p>uma lâmina de microscópio é colocada sobre a abertura do recipiente</p><p>e em seguida em contato com o menisco líquido, levantada por 5 a</p><p>20 minutos e depois invertida rapidamente. As amostras anexadas</p><p>às lâminas e cobertas com lamínulas são examinadas sem coloração.</p><p>Esse método não é recomendado para a recuperação de cistos de</p><p>protozoários, larvas de helmintos, ovos de S. mansoni ou ovos de Ascaris</p><p>lumbricoides não fertilizados.</p><p>Convenientemente, o método de Willis é considerado um método</p><p>simples de implementar. Como desvantagem, temos que não é</p><p>adequada para diagnosticar cistos de protozoários, pois estes encolhem</p><p>quando concentrados. A técnica de flutuação Caesar usada para</p><p>concentrar oocistos de coccídios intestinais, como os de Cryptosporidium</p><p>spp., é baseada em um princípio semelhante, mas usa uma solução</p><p>saturada de sacarose, conhecida em alguns países europeus sob o</p><p>nome de Mini-FLOTAC®. Usa-se 1 g de fezes diluídas em formol a 5% e</p><p>SF2 (solução saturada de cloreto de sódio com gravidade específica de</p><p>1.200, exatamente como descrito no método de Willis) ou SF7 (sulfato</p><p>de zinco) fluido de flotação (SF), solução com massa específica de 1.350.</p><p>A suspensão deve ser transferida para uma câmara de plástico e a</p><p>leitura realizada após 5-10 minutos. Foi relatada uma boa sensibilidade</p><p>para a detecção de ovos de helmintos, como ovos de Strongyloides spp.,</p><p>mas apresentou resultados insatisfatórios para cistos de protozoários</p><p>(FERREIRA, 2020; REY, 2014).</p><p>2.5 Método de Ritchie</p><p>O Método de Ritchie é um método de duas etapas para a análise de</p><p>cistos e ovos. Para sua realização,</p><p>dissolve-se 2 g de fezes em 20ml de</p><p>água e, em seguida, realiza-se a filtração em gaze utilizando em média</p><p>15 ml de fezes diluídas e filtradas. A amostra deve ser centrifugada a</p><p>2000 RPM por 1 minuto. Após essa etapa, adiciona-se 10 ml de água,</p><p>homogeneíza-se a amostra, seguida de uma nova centrifugação, para</p><p>36</p><p>depois descartar o sobrenadante. Deixa-se a amostra descansar por 30</p><p>minutos, adiciona-se 3 ml de éter (pode ser substituído por igual volume</p><p>de acetato de etila–CH3COOCH2CH3) e centrifuga-se a 1500RPM por 1</p><p>minuto. Após a centrifugação, decanta-se a mistura, onde se formam</p><p>4 camadas: (1) sedimento contendo elementos parasitários; (2) uma</p><p>camada de formalina; (3) uma camada rica em detritos fecais; e (4) uma</p><p>camada de éter superficial. Descartam-se as três camadas superiores,</p><p>e as paredes do tubo devem ser limpas com um cotonete ou swab.</p><p>Após a limpeza, o sedimento é recolhido e examinado ao microscópio,</p><p>usando pipeta Pasteur para adicionar 2 gotas de Lugol para análise</p><p>microscópica.</p><p>Como vantagem, temos que o diagnóstico dos cistos é simples e</p><p>eficiente. Por outro lado, a principal desvantagem é o custo, pois a</p><p>compra de uma centrífuga é imprescindível, além de utilizar éter,</p><p>substância volátil e de acesso limitado. Como o éter e o acetato de etila</p><p>são substâncias tóxicas e de uso restrito, o método tradicional de Ritchie</p><p>não é mais utilizado em laboratórios de referência clínica (ENGROFF et</p><p>al., 2014; SIQUEIRA-BATISTA, 2020).</p><p>2.6 Técnicas de quantificação de cargas parasitárias</p><p>A carga parasitária geralmente é quantificada indiretamente pela</p><p>contagem de ovos de parasitos encontrados em amostras fecais.</p><p>Embora os métodos de contagem de ovos de protozoários fecais sejam</p><p>raramente utilizados na prática clínica, a estimativa indireta da carga</p><p>parasitária pode ser útil em certas situações clínicas e epidemiológicas.</p><p>Os métodos quantitativos baseiam-se em diferentes estratégias para</p><p>estimar a massa ou o volume da amostra de fezes a ser testada e para</p><p>contar os ovos nela contidos. Os resultados são geralmente expressos</p><p>como “ovos por grama de fezes”.</p><p>37</p><p>O método de quantificação mais utilizado mundialmente é o método</p><p>Kato-Katz, que utiliza lâminas ou cartões perfurados para determinar</p><p>a quantidade de amostra a ser analisada. Os orifícios na placa ou</p><p>no cartão têm normalmente 6 mm de diâmetro, o que corresponde,</p><p>aproximadamente, a 41,7 mg de massa de fezes. A metodologia inicial</p><p>da técnica de Kato-Katz envolve passagem da amostra através de uma</p><p>peneira de metal (60 a 80 malhas/cm2) ou nylon (105 malhas/cm2) para</p><p>remover impurezas grosseiras; em seguida, é transferida para o orifício</p><p>ou cartão medidor.</p><p>Uma amostra de fezes retirada do orifício (e, portanto, de volume</p><p>conhecido) é comprimida entre uma lâmina de microscópio e uma</p><p>lâmina de papel celofane pré-embebida em uma solução de Glicerina</p><p>e Verde de Malaquita e examinada ao microscópio em um período de</p><p>30 min a 2 horas ou de aproximadamente 24 horas, recomendação</p><p>específica para o diagnóstico de esquistossomose. Se a intenção é</p><p>encontrar ovos de Ancilostomídeos, a leitura deve ser feita dentro</p><p>de 4 horas após a preparação da lâmina. Existe um kit disponível</p><p>comercialmente (Helm-Test® by Biomanguinhos) que contém todos os</p><p>materiais necessários para sua realização. No entanto, existem duas</p><p>etapas no método Kato-Katz original que podem ser omitidas sem afetar</p><p>a relação sinal-ruído para o microscopista: (1) usar Verde Malaquita</p><p>para coloração de fundo das amostras, o que é desnecessário se o</p><p>microscópio estiver bem iluminado; e (2) passar a amostra pela malha</p><p>metálica ou de nylon, a fim de retirar os detritos da amostra (FERREIRA,</p><p>2020; REY, 2016).</p><p>2.7 Pesquisa de larvas de helmintos nas fezes</p><p>Larvas de helmintos, especialmente Ancilostomídeos e Strongyloides</p><p>stercoralis, são pesquisadas em amostras de fezes frescas usando</p><p>uma técnica descrita por Baermann e posteriormente simplificada por</p><p>Rugai, Mattos e Brisola no Brasil. A estratégia é atrair larvas contidas</p><p>38</p><p>em amostras fecais para o fundo de um recipiente de água aquecida,</p><p>usando suas propriedades hidrotrópicas e termotrópicas. No método</p><p>de Baermann, 8-10 g de fezes são passados por um coador de metal ou</p><p>plástico e protegidos com uma aba de gaze dobrada. A peneira deve ser</p><p>colocada no topo de um funil com 10-12 cm de diâmetro contendo água</p><p>aquecida de 40 a 42°C. Submergindo-se parcialmente a amostra, deverá</p><p>ocorrer a migração de quaisquer larvas presentes nas fezes para a parte</p><p>inferior do funil com água morna.</p><p>Após 1-2 horas, removem-se 3-5 ml do conteúdo líquido no fundo do</p><p>funil através de um tubo de borracha, após a abertura da pinça da</p><p>rolha. O material coletado deve ser examinado em vidro de relógio ou</p><p>tubo cônico e corado com solução de Lugol ao microscópio. Também é</p><p>possível procurar larvas em um tubo cônico, centrifugando (500 g por 2</p><p>minutos) e examinando o sedimento corado com solução de Lugol.</p><p>O método que foi adaptado por Rugai, Mattos e Brisola utiliza um</p><p>vaso cônico com capacidade de 125 ml ou 250 ml. Nesse recipiente, a</p><p>gaze envolve um recipiente de plástico ou metal contendo fezes com a</p><p>abertura para baixo e levemente inclinada. Adiciona-se água aquecida</p><p>a 40-42°C ao recipiente cônico até que a amostra esteja parcialmente</p><p>submersa. A amostra retida em gaze entra em contato com a água</p><p>aquecida sem se misturar. Após 90-120 minutos, uma amostra de</p><p>sedimento é coletada, de preferência mantendo-se o recipiente com</p><p>a amostra no recipiente cônico, e corada com solução de Lugol para</p><p>análise ao microscópico.</p><p>As larvas Nematoides mais comuns encontradas em amostras de fezes</p><p>humanas frescas são larvas rabditoides de S. stercoralis. No entanto, as</p><p>amostras mantidas em temperatura ambiente por vários dias antes da</p><p>análise também podem conter larvas rabditoides de Ancilostomídeos</p><p>eclodidas de ovos fecais. Portanto, a distinção entre larvas de</p><p>Ancilostomídeos e Strongyloides é essencial para o diagnóstico. As</p><p>características morfológicas mais úteis para distinguir essas larvas estão</p><p>39</p><p>na cavidade oral e no primórdio genital (ENGROFF et al., 2014; FERREIRA,</p><p>2020).</p><p>2.8 Método de Graham (método da fita gomada)</p><p>Consiste em estudos parasitológicos que procuram Taenia solium, Taenia</p><p>saginata e principalmente ovos de Enterobius vermicularis. A amostra</p><p>de escolha para detectar E. vermicularis é retirada da área perianal do</p><p>suspeito. Os ovos são a forma predominantemente observada, mas as</p><p>fêmeas adultas também podem estar presentes se as amostras forem</p><p>coletadas quando a fêmea estiver na área perianal para oviposição.</p><p>Raramente, ovos e/ou fêmeas adultas podem ser vistos em amostras</p><p>fecais. O procedimento consiste em colocar a fita adesiva de forma que</p><p>esta toque as dobras anais.</p><p>Após esse primeiro passo, coloca-se a fita em uma lâmina no</p><p>microscópio. O ovo gruda na parte adesiva e a própria fita funciona</p><p>como uma cobertura de vidro. À noite, a fêmea carregada de ovos sai</p><p>do hospedeiro pelo reto e põe vários ovos ao redor do ânus. Portanto,</p><p>é importante coletar essa amostra pela manhã, antes que o paciente se</p><p>lave ou evacue.</p><p>É importante notar que o protocolo padrão fornece análises negativas</p><p>de cinco amostras coletadas a cada dia para descartar infecções</p><p>enteróbicas. Os técnicos de laboratório devem estar cientes dos</p><p>procedimentos de coleta dessa amostra, pois podem precisar explicá-</p><p>los aos pacientes, a seus familiares e/ou outros profissionais de saúde.</p><p>Isso é especialmente necessário quando os pais precisam coletar as</p><p>amostras de seus filhos em casa. Nesses casos, é importante enfatizar</p><p>a importância da higiene e as precauções adequadas durante a</p><p>amostragem para evitar a disseminação de ovos infectados no ambiente</p><p>(ENGROFF et al., 2020; REY, 2016; ZEIBIG, 2014).</p><p>40</p><p>2.9 Técnica de Sheather</p><p>Esta é uma técnica recomendada para encontrar oocistos de</p><p>Cryptosporidium spp. em amostras fecais frescas em solução de</p><p>conservação de formaldeído. Consiste em ferver</p><p>uma solução de 500 g</p><p>de sacarose até ficar límpida, adicionar fenol e colocar 1 ou 2 g de fezes</p><p>contendo igual volume de solução fisiológica de cloreto de sódio. A</p><p>amostra fecal deve ser filtrada através de gaze e colocada em um tubo</p><p>de centrífuga de 15 ml. Logo em seguida, adicionam-se 3/4 do volume do</p><p>tubo de solução de sacarose de Sheather e homogeneíza-se a amostra</p><p>suavemente. O material é centrifugado e examinado ao microscópio a</p><p>fresco sem adição de Lugol (ZEIBIG, 2014).</p><p>2.10 Técnicas de coloração</p><p>As técnicas de coloração são de grande importância para a identificação</p><p>e a diferenciação de algumas espécies de cistos de protozoários,</p><p>principalmente quando o material não oferece um reconhecimento</p><p>fidedigno. Também facilitam a identificação de trofozoítos de amebas e</p><p>de flagelados, possibilitando a identificação com precisão das infecções</p><p>intestinais e dos protozoários. Apesar de o Lugol ser amplamente</p><p>utilizado em laboratório, sofre com a incapacidade de diferenciar</p><p>morfologicamente cistos e trofozoítos de protozoários.</p><p>Os esfregaços são expostos ao fixador de Schaudinn e corados com</p><p>tricrômio, hematoxilina ferrosa ou variações da Técnica de Kinyoun. A</p><p>coloração com hematoxilina de ferro é comumente usada para preservar</p><p>as características morfológicas dos trofozoítos de amebas. É importante</p><p>que a fixação da amostra ocorra logo após a coleta do material, nos</p><p>primeiros 20 minutos após a evacuação, para que o material seja</p><p>aproveitado da melhor forma possível. A coloração tricrômica é usada</p><p>para diagnosticar a maioria dos cistos nos protozoários presentes</p><p>fixados com Schaudinn; o citoplasma do trofozoíto é corado com</p><p>41</p><p>manchas azuis, verdes ou violetas, e a cromatina, os eritrócitos e as</p><p>bactérias são corados com manchas vermelhas (NEVES, 2016; ZEIBIG,</p><p>2014).</p><p>Referências</p><p>ENGROFF, P. et al. Parasitologia Clínica. Porto Alegre: Grupo A, 2021.</p><p>FERREIRA, M. U. Parasitologia Contemporânea. Rio de Janeiro: Grupo GEN, 2020.</p><p>NEVES, D. P. Parasitologia humana. 13. ed. São Paulo: Atheneu, 2016.</p><p>REY, L. Parasitologia: parasitos e doenças parasitárias do homem nos trópicos</p><p>ocidentais. 4. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2014.</p><p>SIQUEIRA-BATISTA, R. Parasitologia – Fundamentos e Prática Clínica. Rio de</p><p>Janeiro: Grupo GEN, 2020.</p><p>ZEIBIG, E. A. Parasitologia clínica: uma abordagem clínico-laboratorial. 2. ed. Rio de</p><p>Janeiro: Elsevier, 2014.</p><p>42</p><p>Métodos avançados na</p><p>identificação das parasitoses de</p><p>maior incidência no mundo atual</p><p>Autoria: Chamberttan Souza Desidério</p><p>Leitura crítica: Tatiane Marques</p><p>Objetivos</p><p>• Conhecer os principais métodos complementares</p><p>aos parasitológicos.</p><p>• Entender o funcionamento dos principais métodos</p><p>imunológicos usados no diagnóstico de parasitoses</p><p>e quais parasitoses podem ser detectadas por essas</p><p>técnicas.</p><p>• Entender o funcionamento dos principais métodos</p><p>moleculares usados no diagnóstico de parasitoses e</p><p>quais parasitoses podem ser detectadas por essas</p><p>técnicas.</p><p>43</p><p>1. Métodos imunológicos</p><p>O diagnóstico de doenças parasitárias geralmente depende da</p><p>identificação do patógeno em amostras devidamente coletadas e</p><p>processadas. Às vezes, porém, os exames parasitológicos não são</p><p>suficientes para diagnosticar a parasitose. Em algumas doenças,</p><p>o parasito reside profundamente nos tecidos do hospedeiro e</p><p>sua presença pode não ser detectável, ou o acesso a ele pode ser</p><p>perigosamente invasivo. Testes imunológicos e testes moleculares</p><p>podem ser usados em tais situações, sendo geralmente considerados</p><p>métodos adicionais ou complementares aos padrões de laboratório</p><p>(ZEIBIG, 2014).</p><p>1.1 ELISA</p><p>O nome do método ELISA é uma abreviatura derivada do termo inglês</p><p>Enzyme Linked Immunosorbent Assay (que alguns autores traduzem</p><p>como Enzima Imunoensaio) e refere-se ao fato de que o sinal de uma</p><p>reação imunológica é uma molécula de enzima que se liga a ambos,</p><p>antígeno ou anticorpo (Figura 1). A reação imunológica é capaz de</p><p>formar um complexo imune diretamente visível, dando uma reação de</p><p>cor na segunda etapa do processo e indicando se o teste foi positivo</p><p>ou negativo. O teste fornece resultados objetivos e é muito sensível e</p><p>adequado tanto para exame visual simples quanto para vários sistemas</p><p>de detecção fotométrica com substratos coloridos, fluorescentes ou</p><p>luminescentes. Suas vantagens inegáveis são a facilidade de leitura</p><p>visual ou o uso de espectrofotômetros simples, a estabilidade dos</p><p>materiais utilizados e a ausência de riscos à saúde, além de baixo custo e</p><p>possibilidade de uso externo.</p><p>O método ELISA visa substituir outros métodos, como reação de</p><p>Fixação do Complemento, Hemaglutinação e Imunofluorescência. Essa</p><p>mudança de cor visível indica a presença de um antígeno e, portanto,</p><p>44</p><p>de um patógeno, o que também permite uma avaliação qualitativa</p><p>e quantitativa. Entre as parasitoses existentes, várias podem ser</p><p>diagnosticadas com essa técnica, como: amebíase, doença de Chagas,</p><p>criptosporidíase, cisticercose, hidatidose, fasciolíase, filariose, giardíase,</p><p>leishmaniose, paragonimíase, esquistossomíase, estrongiloidíase,</p><p>toxocaríase, toxoplasmose e triquinelose (SIQUEIRA-BATISTA, 2020,</p><p>ENGROFF et al., 2021).</p><p>Figura 1 – Tipos de ELISA</p><p>Fonte: adaptada de Shutterstock.com.</p><p>1.1 Imunofluorescência</p><p>Para visualizar a formação dos imunocomplexos, os anticorpos são</p><p>marcados com substâncias fluorescentes (fluorocromos) que possuem</p><p>uma ligação covalente que não interfere nas propriedades imunológicas</p><p>da molécula. Os mais importantes desses agentes são o Isotiocianato de</p><p>Fluoresceína e a Rodamina B. O anticorpo a ser marcado deve ser uma</p><p>preparação de imunoglobulina purificada para aumentar a eficiência da</p><p>coloração e evitar fluorescência não específica (porque os fluorocromos</p><p>também marcam albuminas e alfa e beta-frações de globulina).</p><p>O principal princípio do método é o contato de anticorpos marcados e</p><p>um antígeno estruturado (o próprio parasito ou uma estrutura contendo</p><p>45</p><p>seu material antigênico) em contato (Figura 2). Pode ser utilizado para</p><p>o diagnóstico de diversas parasitoses, como: tripanossomíase africana,</p><p>amebíase, babesiose, doença de Chagas, criptosporidíase, giardíase,</p><p>leishmaniose, malária, microsporidiose, toxoplasmose e tricomoníase</p><p>(ZEIBIG, 2014; ENGROFF et al., 2021; REY, 2014).</p><p>Figura 2 – Tipos de Imunofluorescência</p><p>Fonte: adaptada de Shutterstock.com.</p><p>1.3 Método de hemaglutinação</p><p>A aglutinina produz agregados (antígenos e anticorpos) visíveis a</p><p>olho nu. Essa abordagem tem sido utilizada para detectar respostas</p><p>inflamatórias agudas causadas por bactérias e vírus ou proteínas</p><p>produzidas por esses agentes infecciosos. Essa técnica também pode</p><p>ser utilizada em grupos sanguíneos de rotina utilizando determinantes</p><p>antigênicos na superfície dos eritrócitos. Pode ser tanto qualitativa</p><p>quanto quantitativa, pois pode medir títulos de anticorpos em diluições</p><p>seriadas, além de ser importante na avaliação da gravidade de várias</p><p>doenças.</p><p>46</p><p>Pode ainda ser dividida em direta e indireta. A técnica direta utiliza</p><p>propriedades antigênicas naturalmente presentes nas células, como</p><p>antígenos na superfície das hemácias ou parasitos. Já a técnica indireta</p><p>é utilizada quando tais características antigênicas não estão presentes e</p><p>são comuns entre Treponema pallidum e Trypanosoma cruzi (SIQUEIRA-</p><p>BATISTA, 2020, ENGROFF et al., 2021).</p><p>1.4 Técnicas de Biologia Molecular</p><p>As doenças parasitárias causadas por protozoários, helmintos e</p><p>artrópodes continuam sendo um grande problema de Saúde Pública</p><p>devido a sua ampla distribuição geográfica, alta prevalência e impactos</p><p>clínicos e sociais. Segundo dados da Organização Mundial da Saúde</p><p>(OMS), cerca de uma em cada seis pessoas no mundo sofrem de uma</p><p>doença parasitária infecciosa, e de todas essas condições clínicas, a</p><p>malária é a mais mortal. Em 2021, havia cerca de 241 milhões de casos</p><p>de malária em todo o mundo. O número estimado de mortes pela</p><p>doença foi de 627 mil em 2020 (WHO, 2021).</p><p>Helmintíases e doenças tropicais negligenciadas</p><p>afetam mais de um</p><p>bilhão de pessoas em todo o mundo. De acordo com a Organização</p><p>Pan-Americana da Saúde (OPAS), pelo menos 46 milhões de crianças na</p><p>América Latina e no Caribe vivem em áreas com alto risco de infecção</p><p>ou reinfecção por helmintos transmitidos pelo solo; aproximadamente</p><p>70,2 milhões estão em áreas de risco de doença de Chagas; 25 milhões</p><p>sofrem de esquistossomose; e 12,6 milhões sofrem de filariose linfática.</p><p>As doenças parasitárias endêmicas no Brasil são malária, doença de</p><p>Chagas, leishmaniose e esquistossomose mansônica (OPAS, 2016).</p><p>Dessa forma, ainda é necessário que se tenha um diagnóstico rápido</p><p>e confiável de doenças infecciosas e parasitárias, sendo este essencial</p><p>para seu adequado tratamento e acompanhamento clínico, bem como</p><p>para vigilância epidemiológica de doenças, estudos populacionais,</p><p>47</p><p>monitoramento ambiental e apoio a programas de controle de</p><p>endoparasitos. Além disso, ferramentas moleculares possibilitam</p><p>o diagnóstico de doenças infecciosas e parasitárias em hospitais,</p><p>laboratórios e bancos de sangue de referência.</p><p>Em geral, os métodos moleculares são usados em adição aos métodos</p><p>laboratoriais tradicionais (baseados na detecção de parasitos em</p><p>amostras clínicas por identificação microscópica direta) em situações</p><p>em que a detecção por métodos estabelecidos é difícil pelos seguintes</p><p>motivos: baixa carga parasitária; semelhanças na morfologia e na</p><p>morfometria; baixa sensibilidade de testes baseados em antígenos e</p><p>de testes baseados em anticorpos; e falha de testes para determinar</p><p>infecção ativa ou infecções múltiplas. Porém, ainda são inacessíveis à</p><p>parte da população, por requererem equipamento e equipe técnica</p><p>treinados e por seu alto custo de execução.</p><p>As técnicas moleculares são baseadas na detecção de ácidos nucleicos</p><p>e têm se mostrado muito sensíveis e específicas no diagnóstico</p><p>laboratorial de doenças infecciosas e parasitárias. A indicação e a</p><p>eficácia dessas ferramentas no diagnóstico individual de diversos</p><p>parasitos humanos dependem da sensibilidade, da especificidade e da</p><p>confiabilidade da metodologia utilizada. Atualmente, a maior limitação</p><p>ao uso generalizado de métodos moleculares em Parasitologia é a</p><p>necessidade de infraestrutura laboratorial e custos associados. No</p><p>entanto, o diagnóstico molecular de doenças infecciosas é um campo</p><p>emergente nas Ciências da Saúde e tem significativa importância clínica</p><p>e econômica. Novas tecnologias dependentes de análise de ácidos</p><p>nucleicos estão sendo desenvolvidas e sua crescente otimização de</p><p>custos tende a aumentar ainda mais esse segmento (SIQUEIRA-BATISTA,</p><p>2020).</p><p>48</p><p>1.5 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)</p><p>A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) é baseada na amplificação</p><p>de uma região específica de uma molécula de DNA através de ciclos de</p><p>mudanças repetidas de temperatura, resultando na amplificação da</p><p>sequência-alvo de milhares a milhões de vezes. Ela requer: 1. primers</p><p>oligonucleotídeos, também chamados de primers (pequenas sequências</p><p>de DNA sintetizadas complementares às sequências conhecidas do</p><p>DNA-alvo); 2. trifosfatos de desoxirribonucleotídeos (dATP, dCTP, dGTP e</p><p>dTTP); 3. enzima termoestável Taq DNA polimerase; e 4. solução-tampão</p><p>de magnésio. A partir daí, a reação é submetida a ciclos repetidos e</p><p>alternados de aquecimento e resfriamento em um ciclo térmico.</p><p>A PCR é realizada em três etapas. Primeiro, ocorre a desnaturação (a</p><p>95°C) para abrir a cadeia de DNA. Em seguida, ocorre a hibridização ou</p><p>hibridização (55° a 65°C) para emparelhar os primers com a fita molde</p><p>complementar do fragmento-alvo. Por fim, ocorre a extensão da cadeia</p><p>de DNA, também chamada de polimerização (a 72°C). Nessa etapa final,</p><p>um aumento na temperatura permite que a enzima Taq polimerase</p><p>realize a inserção de nucleotídeos, resultando na formação de uma nova</p><p>fita dupla do fragmento de DNA desejado. Cada cópia do fragmento de</p><p>DNA sintetizado serve como molde para um novo ciclo de amplificação.</p><p>Ao final de vários ciclos, geralmente repetidos 25-35 vezes, várias cópias</p><p>(106-109 vezes) do fragmento de interesse são obtidas em 2-4 h. A</p><p>Figura 3 descreve as etapas de PCR.</p><p>Os parasitos humanos mais importantes encontrados na prática</p><p>clínica que podem ser diagnosticados por PCR são Plasmodium</p><p>spp., Trypanosoma cruzi, Leishmania spp. e Toxoplasma gondii.</p><p>Além da Entamoeba histolytica, as enteropatias Giardia intestinalis,</p><p>Cryptosporidium spp., Cystoisospora belli, Cyclospora, E. microsporidia e,</p><p>menos frequentemente, Balantidium coli também são diagnosticadas</p><p>por PCR. Para a amebíase, a técnica é usada em amostras de fezes</p><p>para E. histolytica, para as quais tem alta sensibilidade e ajuda a</p><p>49</p><p>distinguir as espécies, pois os cistos de quatro núcleos de E. histolytica</p><p>são morfologicamente semelhantes a outras amebas que não são</p><p>associadas a doenças gastrointestinais (E. dispar/ E. moshkovskii). Entre</p><p>as helmintíases, Strongyloides stercoralis, Schistosoma spp. e Taenia</p><p>spp. também são diagnosticados por PCR (SIQUEIRA-BATISTA, 2020;</p><p>FERREIRA, 2020).</p><p>Figura 3 – Etapas da Reação em Cadeia da Polimerase</p><p>Fonte: adaptada de Shutterstock.com.</p><p>1.6 RT-PCR</p><p>A PCR com a enzima Transcriptase Reversa (RT-PCR) é um método</p><p>para sintetizar cDNA (fita de DNA complementar) a partir de DNA por</p><p>50</p><p>transcrição reversa seguida de PCR específica. O RT-PCR é muito útil e</p><p>sensível para detecção e quantificação de mRNA. A transcrição reversa</p><p>também pode ser combinada com PCR em tempo real (RT-qPCR),</p><p>tornando a quantificação de mRNA (RNA mensageiro) ainda mais fácil e</p><p>precisa. RT-PCR é usado principalmente para detectar a viabilidade de</p><p>células microbianas e vírus latentes e integrados. Esta variante de PCR</p><p>é usada para avaliar a viabilidade de E. histolytica, que é mais sensível</p><p>e eficiente que o ELISA e apresenta menor reatividade cruzada com</p><p>outras Entamoeba spp. Esta técnica também é utilizada como ferramenta</p><p>diagnóstica para detectar G. intestinalis nas fezes (ENGROFF et al., 2021;</p><p>FERREIRA, 2020).</p><p>Figura 4 – Etapas da Reação em Cadeia da Polimerase com</p><p>Transcriptase Reversa</p><p>Fonte: adaptada de Shutterstock.com.</p><p>51</p><p>1.7 PCR-ELISA</p><p>O sistema PCR-ELISA combina PCR com um Ensaio Imunoenzimático</p><p>(ELISA) para detectar DNA amplificado. Essa técnica tem sido utilizada</p><p>principalmente para detectar a esquistossomose, a leishmaniose</p><p>e a malária. Sua vantagem sobre a PCR convencional é que usa</p><p>equipamento padrão comumente usado no processamento de ELISA e</p><p>os reagentes estão prontamente disponíveis para compra.</p><p>Com a PCR-ELISA, podemos identificar as diferentes espécies de</p><p>Schistosoma spp. que podem causam a esquistossomose. Para o</p><p>diagnóstico de infecções do lúmen intestinal, o DNA de S. mansoni é</p><p>extraído de amostras de fezes suspeitas e a sequência repetida de 121</p><p>pb do patógeno é amplificada com primers biotinilados específicos.</p><p>As amplificações são detectadas em uma placa de ELISA sensibilizada</p><p>com Estreptavidina usando uma sonda 5’ marcada com fluoresceína.</p><p>Controles positivos extraídos de ovos de S. mansoni são adicionados</p><p>a cada teste PCR-ELISA. Os resultados obtidos são promissores e</p><p>estimulam o desenvolvimento de um método diagnóstico simples que</p><p>utiliza apenas uma amostra de fezes. É uma técnica importante para</p><p>estudos epidemiológicos e controle de doenças.</p><p>A tecnologia PCR-ELISA também é usada para o diagnóstico de</p><p>leishmaniose visceral humana a partir de amostras de sangue</p><p>periférico. Na esquistossomose, esse sistema permite a detecção de</p><p>DNA amplificado por PCR usando uma plataforma de ELISA que mede</p><p>a intensidade colorimétrica em um leitor de microplacas. Essa técnica</p><p>é potencialmente útil para identificar e rastrear indivíduos infectados</p><p>assintomáticos, o que é importante para mapear contatos e controlar</p><p>áreas infectadas para monitoramento de programas de controle de</p><p>doenças.</p><p>Como o método PCR-ELISA da leishmaniose foi desenvolvido</p><p>recentemente, estudos de campo mais extensos são necessários</p><p>52</p><p>para definir definitivamente</p>