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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ CENTRO DE CIÊNCIAS DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA E BIOLOGIA MOLECULAR RELATÓRIO DE AULAS PRÁTICAS DE BIOFÍSICA PRÁTICA II – DIFUSÃO/OSMOSE GABRIELA ALVES VALENTIM FORTALEZA OUTUBRO DE 2017 1. INTRODUÇÃO Em sistemas biológicos a água é a molécula mais abundante, chegando a constituir 75% do corpo de um humano adulto (HENEINE, 2010). Um sistema biológico necessita da manutenção da homeostase para se manter vivo (SILVERTHORN, 2010). As células, por exemplo, precisam selecionar quais substâncias podem atravessar sua membrana, tanto em direção ao seu interior, como saindo dela. Esse controle é realizada por meio de uma membrana plasmática semipermeável. As membranas plasmáticas possuem maior permeabilidade a água que a maioria das moléculas e íons. O transporte de moléculas através da camada lipídica pode ser realizado de forma passiva, sem gasto de energia, ou ativamente, por meio de proteínas transportadoras, necessitando de uma fonte de energia. A difusão e a osmose são exemplos de transporte passivo (SILVERTHORN, 2010). O movimento de água ou solvente, através de uma membrana com permeabilidade seletiva, entre soluções com diferentes concentrações de soluto é conhecido como osmose (DURAN, 2003). A diferença de concentração entre as duas soluções gera uma pressão osmótica. A pressão osmótica é determinada pelo seu equilíbrio com a pressão hidrostática. Assim, quanto maior for a concentração da solução, maior será a pressão osmótica. Essa diferença ocasiona um fluxo de água da solução de menor concentração para a solução de maior concentração. O cálculo da pressão osmótica pode ser expresso na equação , onde M é a concentração, em mol/L, R é a constante universal dos gases, T é a temperatura absoluta, em kelvin, e i é o número de íons liberados, ou fator de Van’t Hoff (NELSON & COX, 2014). O movimento resultante de partículas saídas de um compartimento com alta concentração, ou hipertônico, para um compartimento com baixa concentração, ou hipotônico, separados por uma divisória permeável, é chamado de difusão. A difusão ocorre como uma resposta a um gradiente de concentração, até atingir um estado de equilíbrio onde os dois compartimentos possuam concentrações iguais de soluto (DURAN, 2003). Os processos de difusão e osmose são extremamente importantes para a absorção de nutrientes pela célula através da membrana celular e manutenção da homeostase interna. Assim, o conhecimento e entendimento a respeito destes dois processos são de importância fundamental para o estudo da biologia. 2. OBJETIVOS Familiarizar o estudante com o processo de difusão; Capacitar o estudante a construir sistemas artificiais de geração de pressão osmótica e hidrostática; Relacionar a velocidade de difusão com a concentração e tamanho de partículas. 3. MATERIAIS E MÉTODOS No dia 28 de setembro de 2017, a prática aqui relatada foi realizada no Laboratório N1, localizado no bloco 907, Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, na Universidade Federal do Ceará (UFC), durante as aulas da disciplina de Biofísica, lecionadas pelo Prof. Dr. José Tadeu Abreu de Oliveira. Os materiais utilizados foram solução de cloreto de sódio 20% colorida com azul de bromofenol, solução de sacarose 20% colorida com fucsina, membrana para diálise, suporte para garras, pipeta de vidro de 10mL, água destilada e erlenmeyer de 250mL. Primeiramente, foram preparadas duas membranas de diálise pipetando- se 15mL da solução de cloreto de sódio na primeira e 15mL da solução de sacarose na segunda. Então, uma pipeta de 10mL foi introduzida cerca de 1 centímetro dentro da solução de cloreto de sódio. A membrana foi amarrada a uma pipeta, já fixada em um suporte utilizando-se um cordão, de forma a evitar vazamentos e sem deixar nenhum espaço vazio dentro da membrana. Um pouco da solução entrou na pipeta formando um menisco. Tomou-se cuidado para que a visibilidade do volume dentro da pipeta não fosse prejudicada em nenhum momento durante o experimento. O mesmo procedimento foi realizado com a membrana contendo a solução de sacarose. Com as membranas e pipetas já fixadas, formando dois sistemas independentes, cada membrana foi mergulhada, ao mesmo tempo, em um erlenmeyer contendo 250mL de água destilada até a altura do cordão. O volume do conteúdo dentro de cada uma das pipetas foi anotado, marcando o tempo zero. A cada três minutos o volume, limitado pelo menisco, era conferido e anotado para as duas soluções, sendo obtidos por fim dez valores de volume para cada solução. 4. RESULTADOS O volume inicial do sistema contendo a solução de cloreto de sódio 20% foi 2,5mL e a final foi 6,7mL. No sistema contendo a solução de sacarose 20% o volume inicial foi de 1,5mL e o volume final foi 3,8mL. Os valores de volume em ambos os sistemas podem ser encontrados na tabela 01. As variações no volume ao longo do experimento estão destacadas na figura 01. Tabela 1 – Volumes mensurados de soluções de cloreto de sódio 20% e sacarose 20% ao longo de diálise em erlenmeyer. Tempo (em minutos) Cloreto de Sódio 20% (em mL) Sacarose 20% (em mL) 0 2,5 1,5 3 4,5 2 6 6,25 2,3 9 7,1 2,6 12 7,5 2,9 15 7,6 3,2 18 7,6 3,3 21 7,4 3,6 24 7,0 3,7 27 6,7 3,8 Figura 1 - Variação de volume de soluções de cloreto de sódio 20% (em azul) e sacarose 20% (em rosa) ao longo de diálise em erlenmeyer. 5. DISCUSSÃO Durante a prática puderam ser observados os fenômenos de difusão e osmose. As diferenças na concentração de soluto das soluções de cloreto de sódio 20% e sacarose 20% e da água destilada tem como consequência o surgimento de pressão osmótica. A pressão osmótica gera a entrada de água no sistema, atravessando a membrana em direção as soluções. Assim, ocorre uma elevação do volume dentro da pipeta. Essa elevação é percebida através da variação da altura do menisco na pipeta, demonstrando a ocorrência da osmose no sistema. O fenômeno da difusão simples é percebido através da lenta aquisição de pigmento da água destilada. Ao longo do experimento a água destilada começa a ser colorida pelo pigmento presente nas soluções, o que indica a passagem dos solutos de um meio mais concentrado para um meio menos concentrado. Foi possível observar que a partir dos 15 minutos de experimento o volume da solução de cloreto de sódio na pipeta se estabilizou e começou a diminuir em seguida. Isso foi motivado pelo vazamento do sistema, onde o volume da solução escapou para além do cordão e começou a vazar para fora da pipeta. No 2,5 4,5 6,25 7,1 7,5 7,6 7,6 7,4 7 6,7 1,5 2 2,3 2,6 2,9 3,2 3,3 3,6 3,7 3,8 0 1 2 3 4 5 6 7 8 0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 V o lu m e ( m L) Tempo (minutos) Cloreto de Sódio 20% Sacarose 20% entanto, até a marca dos 15 minutos foi possível observar um aumento rápido do volume de solução na pipeta. Uma posterior conferência dos resultados obtidos por outras equipes confirmou a tendência de aumento do volume. Dessa forma, os resultados não foram comprometidos. Foi observado que o menisco da solução de NaCl na pipeta se elevou mais rápido que na solução de sacarose. Esse fenômeno ocorre devido a osmolaridade, que é a quantidade de partículas dissolvidas em um solvente. A glicose não se dissocia em solução, mas o cloreto de sódio é dissociado em Na+ e Cl-. Assim, um mol de NaCl contem contém o dobrode partículas que um mol de sacarose, e consequentemente o dobro de osmolaridade (OLIVEIRA et al., 2002). Já que quanto maior a osmolaridade, maior é a pressão osmótica do soluto sobre o solvente, a pressão osmótica na solução de NaCl 20% foi maior que na solução de sacarose 20%, ocasionando uma elevação de volume mais rápida na primeira solução. Comparada a sistemas biológicos, a membrana de diálise pode ser comparada com a membrana plasmática de uma célula. O processo pelo qual moléculas em solução são separadas através de uma membrana seletiva ao tamanho das partículas é chamado de diálise (OLIVEIRA et al., 2002). A membrana plasmática permite que algumas substâncias atravessem mais facilmente do que outras (REECE, 2015). Alguns compostos podem se dissolver na membrana e outros atravessam a bicamada lipídica com o auxílio de proteínas transmembranas (NELSON & COX, 2014). A água, no entanto, é uma molécula polar e pode atravessar a membrana celular mais facilmente. Além disso, proteínas chamadas de aquaporinas permitem a passagem mais rápida da molécula de agia pela membrana (SILVERTHORN, 2010). Dentro da pipeta pode ser observada uma variação na altura da coluna formada pela solução. A pressão gerada no sistema é chamada de pressão hidrostática, representada pela fórmula , onde d=densidade do líquido, em kg/m³, g=aceleração da gravidade, em m/s², e ∆h= variação de altura da coluna líquida, em metros (OLIVEIRA et al., 2002). A coluna de solução formada dentro da pipeta é transiente para as duas soluções, pois o volume varia com o tempo. Caso as condições do experimento fossem alteradas e as soluções de sacarose e cloreto de sódio fossem colocadas em erlenmeyer e a água dentro das membranas, presas também em pipetas, o movimento de osmose seria invertido. As moléculas de água moveriam-se em direção as soluções e o volume dentro da pipeta iria diminuir gradualmente. 6. CONCLUSÃO Os sistemas constituídos pelas pipetas e membranas permitiram a observação do fenômeno da osmose e difusão simples, proporcionando aos estudantes a familiarização com estes processos. A partir do experimento foi possível relacionar os fenômenos observados com o tamanho das partículas e características de cada molécula, demonstrando a eficiência da prática. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS DURÁN, J. E. R. Biofísica: Fundamentos e Aplicações. São Paulo: Prentice Hall, 2003. HENEINE, I. F. Biofísica Básica. São Paulo: Editora Atheneu, 2010. NELSON, D. L. & COX, M. M. Princípios de Bioquímica de Lehninger. 6. ed. Porto Alegre: Artmed, 2014. OLIVEIRA, J. R., WACHTER, P. H., AZAMBUJA, A. A. Biofísica para Ciências Biomédicas. Porto Alegre: EDIPUCRS, 2002. REECE, J. B. et al. Biologia de Campbell. 10. ed. Porto Alegre: Artmed, 2015. SILVERTHORN, D. U. Fisiologia Humana. Uma Abordagem Integrada. 5. ed. Porto Alegre: Artmed, 2010.