Relatorio Reação de sequenciamento

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Reação de sequenciamento
	Os produtos de PCR foram purificados com o uso da enzima ExoProstar 1-Step (GE Healthcare) de acordo com o protocolo do fabricante e foram submetidos à reação de sequenciamento de DNA segundo o método de Sanger et al. (1977). Para a reação de sequência foram utilizados: 1,87μl de H2O, 0,13μl da enzima ExoProStar 1-Step em cada amostra da placa, foram adicionados 3 μl de PCR das amostras que iram compor a placa de sequenciamento. As reações de sequenciamento foram realizadas em uma com 96 poços, utilizando-se de um termociclador e um programa com os seguintes parâmetros: xx ciclos de 37°C por 15 min, 80°C por 15 min e 20°C por 3 min.
Após a purificação as amostras foram submetidas a reação de sequenciamento usando o método de didesoxitermial (SANGER et al., 1977) com o kit BigDye Terminator 3.1 (Applied Biosystems). Onde foram utilizados os seguintes reagentes e procedimentos: Adicionou-se 3,9 μl de H2O; 1,05 μl de buffer; Adiciona-se 0,35 μl de primer; Adiciona-se 1 μl de DNA; Adiciona-se 0,7 μl de Big Dye; em seguida a placa foi submetida a um programa de sequenciamento no termociclador, onde constava os seguintes dados: Desnaturação inicial a 96ºC por 1 min, 30 ciclos de 96ºC por 15s (desnaturação), 50ºC por 15s (hibridização), 60º C por 4 min (extensão) e 4ºC - ∞.
 Após a reação de sequência as amostras foram precipitadas para a retirada do excesso de reagentes não incorporado de acordo com o protocolo descrito abaixo:
Submeteu-se a placa a um spin (centrífuga de placa);
Adicionou-se 2,5μl de EDTA (125 mM);
Vedou-se a placa e submeteu-se a um spin;
Adicionou-se 30μl de Etanol 100%;
Vedou-se a placa e misturou-se invertendo 4-5x;
Envolveu-se a placa em papel alumínio e deixou-se em repouso à temperatura ambiente por 15 minutos;
Centrifugou-se a 4.000 rpm por 30 minutos;
Inverteu-se bruscamente a placa para descartar o álcool e secar sobre o papel absorvente;
Centrifugou-se a placa invertida por 15 segundos a 1.150 rpm;
Adicionou-se 30μl de Etanol a 70%;
Vedou-se a placa;
Centrifugou-se a 3.440 rpm por 15 segundos (centrífuga refrigerada 4º C);
Inverteu-se bruscamente para descartar o álcool e secar sobre o papel absorvente;
Centrifugou-se a placa invertida por 1 minuto a 1.150 rpm;
Deixou-se a placa na estufa a 37º C por aproximadamente 10 minutos para evaporar o excesso de álcool;
Adicionou-se Formamida (10μl), levou-se a placa a 94º C por cerca de 3 minutos e colocou-se a mesma no sequenciador automático de DNA (ABI 3500/Life Technologies) onde ocorreu a eletroforese.
3. 6 Análises dos dados
	As sequências foram editadas e alinhadas no programa BIOEDIT 7.0 (HALL, 1999) e a matriz de distância genética gerada através do modelo Tamura 3- parâmetros por meio do programa MEGA 6.0 (TAMURA et al., 2013). Foram utilizadas as espécies Glossophaga soricina e Sturnira lilium da família Phyllostomidae como grupos externos baseado em Baker et al. (2003) e Freygang (2006). As plataformas bioinformáticas BOLDSystemsv3 (www.boldsystems.org) e BLAST (www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) foram utilizadas para averiguar o grau de similaridade das sequências com o intuito de fornecer maior suporte a identificação molecular das espécies 
INTRODUÇÃO
O marco principal do uso de marcadores moleculares foi quando WOESE e colaboradores, em 1987, descreveram o uso do gene 16S rDNA na filogenia de bactérias (Woese et al., 1987). O gene 16S rDNA codifica para a subunidade ribossômica menor, que é parte do sítio de ocorrência da síntese protéica e, portanto, está presente em todas as bactérias. Esse gene apresenta características conservativas ao longo da evolução e pode servir como indicador de como os microrganismos estão intimamente relacionados durante a evolução em milhares de anos. A utilização do gene 16S rDNA revolucionou o campo da ecologia microbiana, e com seu uso, é possível investigar e determinar posições filogenéticas de comunidades bacterianas de meio ambiente (Ludwig, et al., 1997; Hentschel et al., 2002). Os estudos com o gene 16S rDNA foram iniciados por Carl Woese, que relataram que esta molécula era um excelente marcador molecular (Atlas e Bartha, 1998).
Os genes ribossomais RNA (rDNA) apresentam uma série de características favoráveis a sua utilização em filogenia: i) são encontrados em todos os organismos vivos, uma vez que a síntese de proteínas ribossomais é obrigatória; ii) expressam estruturas secundárias altamente conservadas, que são consideradas para o alinhamento correto das seqüências destes genes; iii) são componentes principais da estrutura dos ribossomos e, portanto, abundantes nas células, facilitando a sua identificação; iv) posições diferentes das sequências nesses genes evoluíram em taxas diferentes, permitindo que análises filogenéticas sejam realizadas em vários níveis de resolução taxonômica (Woese, 1987; Weisburg et al., 1991; Willems e Collins, 1993; Olsen et al., 1994; Vandamme et al., 1996; Martínez-Romero e Caballero- Mellado, 1996; Pace, 1997; van Berkum et al., 1998; Garrity e Holl, 2001). Devido a essas propriedades, as seqüências do gene 16S rDNA passaram a ser consideradas como boas escolhas para comparar organismos e para inferir filogenias e, por isso, vêm sendo utilizados para derivar filogenias universais da vida.
REFENCIAS (INTRODUÇÃO)
WOESE, C. R. Bacterial Evolution. Microbiology Reviews, v. 51, n. 2, p. 221-271, 1987.
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HENTSCHEL, U. et al. Molecular evidence for a uniform microbial community in sponges from different oceans. Applied and Enviromental Microbiology, Washington, v. 68, n. 9, p. 4431-40, 2002.
ATLAS, M.; BARTHA, R. Microbial evolution and Biodiversity. In: ATLAS, M. ; BARTHA, R. Microbial Ecology. Menlo Park: Benjamin/ Cummings Science, p. 27-57, 1998.
WEISBURG, W.G.; BARNS, S.M.; PELLETIER, D.J. 16S ribosomal DNA amplification for philogenetic study . J.Bacteriol.,v. 173, p. 697-703,1991.
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PACE, N.R. (1997) A molecular view of microbial diversity and the biosphere. Science, v. 276: p. 734–740, 1997.
VAN BERKUM, P.; BEYENE, D.; BAO, G.; CAMPBELL, T. A.; EARDLY, B. D. Rhizobium mongolense sp. nov. is one of three rhizobial genotypes identified which nodulate and form nitrogen-fixing symbioses with Medicago ruthenica [(L.) Ledebour]. Int J Syst Bacteriol, v. 48, p.13-22, 1998.
GARRITY, G. M. & HOLT, J. G. The road map to the Manual. In: BOONE, D.R. &
CATENHOLZ, R.W., eds. Bergey´s manual of systematic bacteriology. New York, Springer-
Verlag, v.1., p.119-166, 2001.