Slide: Sequenciamento de Nova Geração

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Sequenciamento 
de DNA de 
Nova Geração
Equipe: Bruna Lages Veloso, Gabriele Alves 
Cantanhede, Helen Susany Melo da Silva, Jeyce 
Kelly Ferreira Sirqueira, João Victor dos Santos 
de Oliveira e Pedro Jonas Machado Reis.
NGS: O que é Sequenciamento de
Nova Geração? 
NGS
Next-Generati
on Sequencing 
DNA
Estrutura química foi 
desvendada em 1953 
DNA 
A molécula DNA é composta 
por nucleotídeos ligados em 
combinações específicas e 
únicas. 
04
03
02
01
Era Pós Genômica
Fácil acesso a diversos 
bancos de dados;
Em um curto tempo e 
por um preço acessível; 
Avanço das tecnologias 
de sequenciamento de 
nova geração;
Finalização do Projeto 
Genoma Humano;
O sequenciamento do DNA
Geram um arquivo 
eletrônico com símbolos das 
Bases Nitrogenadas
É a determinação da 
ordem exata em que os 
nucleotídeos se encontram 
Conceito:
São equipamentos que leem 
uma amostra de DNA
Sequenciadores:
 Primeiro Método Popular de Sequenciamento 
Terminação de Cadeia
 Método de Sanger
 1977, por Frederik Sanger
O sequenciamento do DNA
Método de Sanger
● É um método de sequenciamento de primeira geração.
● Utilizado para sequenciar pequenas porções de DNA (500 - 900 
pares de base).
● O método de Sanger foi crucial para o desenvolvimento do 
projeto genoma humano.
Automação do 
método
● Os avanços tecnológicos trouxeram 
melhorias para o método de Sanger.
● Em 1986 foi lançado o primeiro sequenciador 
automático de DNA, o ABI 370, e em 1998, o 
primeiro sequenciador de eletroforese 
capilar, o ABI 3700.
● Porém ainda é um método caro e ineficiente para 
ser usado em larga escala.
O que é o sequenciamento de nova geração, 
afinal? 
Pode ser caracterizado como um sequenciamento 
automatizado, paralelo e de alto rendimento.
Sequenci
amento M
assivo 
em Paral
elo
Sequenciamento de Alta 
Performance
Sequenciamento de Próxima ou 
Nova Geração 
Essas tecnologias permitem sequenciar o DNA de forma 
muito mais rápida e barata.
Enquanto um sequenciador de eletroforese capilar 
processa, no máximo, 96 fragmentos por vez, os 
sequenciadores de nova geração podem ler até bilhões 
de fragmentos ao mesmo tempo. 
Revolucionaram o estudo da genômica e da biologia 
molecular.
O que é o sequenciamento de nova geração, 
afinal? 
Com o NGS pode-se sequenciar o genoma inteiro ou 
apenas áreas específicas de interesse.
O resultado de um NGS é um arquivo contendo a posição 
exata de cada nucleotídeo do DNA, e a partir dele é 
possível analisar as mudanças nas sequências do DNA do 
indivíduo. 
O NGS é altamente eficiente no diagnóstico molecular de 
doenças genéticas e cânceres hereditários ou não 
hereditário.
Existem diversas plataformas online que estimam o 
possível dano de alterações. 
Quais os tipos de NGS? 
Sequenciamento de Genoma Completo (WGS):
● Sequenciamento de todo material genético do 
indivíduo.Irá incluir tanto a parte codificante 
quanto a não codificante
● Apresenta um custo maior para processamento e 
armazenamento do resultado.
● Permite a análise de muitas variantes em um único 
método.
Quais os tipos de NGS? 
Sequenciamento do Exoma Completo (WES):
● Sequenciamento apenas da parte codificante do material genético.
● WES eficiente e mais indicado para o diagnóstico clínico principalmente 
em casos em que existe hipótese diagnóstica de mais de uma doença
específica, ou ainda, que não se tem hipótese diagnóstica específica.
Sequenciamento de genes alvo ou Painel de genes
É o sequenciamento de 
Nova Geração realizado 
de apenas um grupo de 
interesse
Esse número de 
genes específicos 
são associados a 
uma ou mais 
doenças. 
É semelhante ao WES, 
porém, em vez de 
sequenciar todos os 
genes do indivíduo, é 
realizado somente em 
um número de genes
Técnicas de Sequenciamento de DNA 
de Nova Geração
Fluxo de Trabalho
Geração de cópias 
de cada fragmento 
a ser sequenciado.
 Geração de fragmentos 
de tamanhos 
compatíveis com a 
tecnologia. Adição de 
adaptadores e 
marcadores.
Processo de leitura 
da sequência.
Alinhamento, 
montagem, 
quantificação, 
chamada de bases, 
chamada de 
variantes.
Amplificação Biblioteca Sequenciamento Análise de dados
01 02 03 04
454 - Roche
▪ O pirosequenciamento, foi a primeira plataforma de 
sequenciamento de nova geração disponibilizada 
para o mercado em meados de 2005.
▪ Esta tecnologia causou bastante impacto, pois 
dispensava a necessidade de clonagem prévia de 
fragmentos e proporciona o sequenciamento de 
milhares de sequenciamentos de DNA e amostras em 
paralelo.
Formação da Biblioteca
 O processo de formação 
da biblioteca da 
metodologia 454 - Roche e o 
da metodologia Illumina 
seguem a mesma ideia.
▪ Uma das primeiras etapas que devemos 
nos atentar para fazer o sequenciamento.
▪ Ela tem como os 3 objetivos principais:
 Gerar fragmento de tamanho adequado
▪ Necessário gerar fragmentos com um tamanho 
que seja possível fazer o procedimento, uns 150 
a 300 pares de base.
Digestão enzimática
Quebra mecânica
PCR
Formação da Biblioteca
 Adicionar adaptadores nas extremidades do fragmento
▪ Essencial que se saiba as extremidades dos fragmentos
 Fragmentos separados aleatoriamente, 
desconhecidos
▪ Ligar fragmentos dupla-fita de sequência conhecida 
nas extremidades dos outros fragmentos
Formação da Biblioteca
 Adicionar marcadores de amostra
▪ Permite que se sequenci-e várias amostras 
de DNA ao mesmo tempo
▪ Adiciona um marcador que o equipamento 
vai conseguir detectar no fragmento
▪ Fazer várias bibliotecas separadamente e 
colocar marcadores diferentes para cada
▪ No máximo, 384 amostras diferentes
Amplificação 
▪ Necessário que vários fragmentos fiquem juntos
▪ O sinal não é uma florescência, mas sim uma variação de 
Ph
▪ PCR em emulsão 
 Uma micela, bolha envolta em óleo
 Solução com todos os ingredientes para a PCR
 Um Bead, esfera com primer complementares a 
um único adaptador presos
 Dentro do tubo com o óleo há uma quantidade 
enorme de micelas
 Um fragmento por micela
▪ Os fragmentos se ligam a esfera durante a PCR
▪ Finalizado, as micelas são retiradas do óleo e selecionadas
▪ Esferas são colocadas em um “chip”
 Possui milhões de minúsculos poços, clusters
 Cada poço só consegue comportar uma única esfera
Amplificação 
Sequenciamento 
▪ PCR em emulsão
▪ Processo acontece com a esfera dentro do poço
▪ No poço:
Bead com a fita simples de sequência 
desconhecida
DNA polimerase
▪ O equipamento libera um dos quatro 
nucleotídeos de cada vez e depois o retira dos 
poços, continuamente em um ciclo
Sequenciamento 
▪ Um nucleotídeo correspondente incorpora na fita
Libera pirofosfato e um átomo de hidrogênio (H+)
A solução tem uma queda no Ph
▪ O equipamento detecta a menor alteração de Ph no 
poço
▪ Ao ocorrer uma alteração no Ph, a máquina 
reconhece que o nucleotídeo lançado foi incorporado 
e registra a informação
Analise de dados 
1
2
3
4▪ Após a finalização, os dados são 
computados e expressos em um gráfico
▪ As informações são analisadas como 
frequência, variação do Ph no momento, 
nucleotídeos, amostra.
Illumina
▪ Período de 1998 a 2006 - Uma das 
tecnologias mais usadas atualmente 
começou a ser desenvolvida.
▪ Genome Analyser.
▪ Em 2007, a Solexa foi adquirida pela 
Illumina, juntamente com a sua 
metodologia de sequenciamento de 
ácidos nucléicos.
Amplificação 
▪ Qual a necessidade dos fragmentos de DNA 
passarem pelo processo de amplificação? 
▪ Quanto maior for o número de fragmentos, 
maior será a fluorescência.
▪ Como é esse processo de amplificação?
 Flow Cel
l
Amplificação 
▪ O que acontece nessa flow cell?
Amplificação 
▪ A placa tem que ser formada por vários fragmentos, então esse 
processo, esse ciclo, vai ser feito várias e várias vezes.
▪ O alinhamento de fragmentos é chamado de "Cluster."
Sequenciamento 
Sequenciamento 
▪ Ao serem capturados, os nucleotídeos emitem a fluorescência e a máquina, por sua 
vez,capta essa fluorescência e vai armazenando os dados.
Analise de dados 
▪ Por fim, depois dessa captação, tem-se a formação da foto chip. 
▪ Ela pode ter várias cores (azul, verde, amarelo) e é a partir dela que a máquina vai 
fazer a leitura e identificação das sequências registradas.
Illumina
▪ O sequenciamento Illumina é o mais utilizado 
no mundo atualmente, sendo que a cada ano, a 
metodologia passa por otimizações.
▪ Vantagens e Desvantagens.
▪ Aplicações.
▪ Com relação ao portfólio de recomendações 
Illumina, atualmente ele é composto por 8 tipos 
de equipamentos.
Iseq 100 MiniSeq MiSeq Series
Nextseq 550 Series
Novaseq 6000
HelisCope 
▪ Plataforma desenvolvida pela empresa 
Helicos Biosciences
▪ Primeira a usar a metodología 
sequenciamento fluorescente de molécula 
única
Formação da Biblioteca
▪ No preparo da biblioteca, os adaptadores colocados geralmente são 
sequências sintéticas poli-A.
Eles fixam os fragmentos em uma placa de vidro que possui 
moléculas poli-T na superfície.
▪ Não possui ampliação, pôs utiliza uma única molécula de cada tipo
Sequenciamento 
▪ Semelhante ao ciclo de sequenciamento da 454 – Roche, 
mas tendo como diferença:
Não está em um Beads, mas sim uma placa de vidro
Os nucleotídeos são marcados com um fluoróforo
▪ Em cada ciclo, após o nucleotídeo ser colocado na 
substância
Sequenciamento 
▪ A placa é escaneada com um laser que excita o fluoróforo e o sinal de 
cada molécula é detectado individualmente por um sensor de alta 
resolução
 A varredura é extremamente demorado
▪ Ao final de cada ciclo a placa é lavada
▪ O ciclo se repete continuamente até todos os poços estarem 
terminados
▪ Mas essa tecnologia foi um fracasso comercial, devido ao alto custo 
dos reagentes e o baixo tamanho das leituras
 Aplicação na biologia: 
Sequenciamento de DNA de Nova Geração nas Plantas 
Codigo genético
 A diversidade genética
Por meio do sequenciamento é possível obter informações sobre a linha de evolução de um 
organismo, ou seja, saber quais indivíduos ou espécies possuem o genoma mais parecido. 
Foi isso que ajudou a descobrir que nosso DNA é 98,5% igual ao dos chimpanzés.
Melhoramento vegetal
Com a introdução recente de diversas técnicas avançadas de sequenciamento, o 
investimento em tempo e custos para execução de projetos foram otimizados, permitindo a 
realização de trabalhos que eram antes considerados quase impossíveis. 
Os estudos em Sistemática de Plantas vêm utilizando sequências de DNA para caracterizar e 
classificar a diversidade de plantas há mais de duas décadas.
Nos vegetais essa premissa é a mesma. Também é possível identificar os pais de uma 
determinada planta, de onde ela veio e como está a sua base genética. Assim 
conhecemos a diversidade genética dos organismos vivos.
Para espécies vegetais com genomas desconhecidos, a utilização das novas 
plataformas de sequenciamento é ainda limitada. O tamanho das leituras 
produzidas é incompatível com a montagem dos genomas nucleares 
gigantescos e altamente repetitivos das plantas. Os poucos trabalhos 
realizados têm sido destinados ao sequenciamento de transcritos, 
ressequenciamento e sequenciamento de novo de genomas plastidiais, os 
quais são menores (~150Kb) e contêm pouca quantidade de DNA repetitivo. 
Importância do melhoramento 
Conhecer a diversidade genética é fundamental para o sucesso 
do cultivo, e ter acesso a essas informações serve de base para 
os melhoristas de plantas selecionar variedades com 
desempenho e alto rendimento. 
O melhoramento genético de plantas é a ciência que tem 
como objetivo aumentar a frequência de bons alelos nas 
populações dos vegetais, para que sejam desenvolvidas suas 
qualidades ou para adicionar características que vão 
desempenhar uma função benéfica à produção agrícola.
Importância do melhoramento
Geralmente, a escolha dos alelos favoráveis 
permite que as espécies de cultivares sejam 
mais produtivas e resistentes ou tolerantes às 
pragas, doenças, estresses climáticos e outros.
A atividade é desenvolvida de modo 
contínuo e pode ser considerada como 
uma forma ecologicamente responsável 
de aumento da produção com 
qualidade além de gerar uma maior 
variabilidade dos alimentos.
O melhoramento de plantas engloba todas as técnicas, os métodos, as estratégias ou os 
recursos utilizados para que algum progresso seja incorporado a uma espécie vegetal.
Metodologias do Melhoramento de Plantas
Melhoramento convencional 
● Mutações ou cruzamentos para introduzir variabilidade 
● Seleção baseada em caracteres morfológicos
● Sementeira de sementes selecionadas
Ferramentas Modernas de Melhoramento
04
03
02
01
Resistência a doenças e pragas
Aumento da qualidade
Obtenção de variedade
Aumento da produtividade
Objetivos do melhoramento de plantas
04
03
02
01
Foco em qualidade e saúde
Aumento da urbanização - planejamento do crescimento - menos mão de obra disponível 
Redução de insumos, proteção do meio ambiente- Protocolo de Kyoto
Fontes de energia renovável- álcool e biodiesel
Novos objetivos do MP
Importância do sequenciamento dos genomas:
Parece muito abstrato quando falamos em sequenciamento de genomas, e por 
qual motivo descobrir a ordem das letras do DNA ?
● Planta de grande valor econômico para os Estados Unidos
● Mudanças climáticas devem comprometer as condições 
de cultivo.
● A noz-inglesa, não é inglesa
● Ao identificar os parentes mais próximos é possível 
recuperar genes que possam ser utilizados em variedades 
mais adaptadas a novas condições climáticas
Objetivo ornamental: 
Adaptação ao clima brasileiro
Objetivo Visando 
nicho de mercado: 
Algodão colorido
Bancos genéticos
Quando tratamos de um organismo 
(ou micro), temos um local físico 
para guardar esse material, e impedir 
que a biodiversidade se perca no 
decorrer do tempo
Existem bancos de germoplasma no 
mundo todo, e são nesses cofres que a 
diversidade genética fica protegida.
Bancos genéticos
 GenBank (Estados Unidos)
European Nucleotide Archive (Reino Unido).
Todos os dias os dados de DNA e RNA e 
outras informações genéticas são 
sincronizados entre esses três bancos, tendo 
uma interação total entre as organizações.
Nesses bancos, são colocadas informações de 
todos os organismos sequenciados. Além de 
informações sobre os genes, suas funções, 
como estão formadas as proteínas
Bancos de dados genéticos de plantas
Phytozome
 Projeto de Anotação do Genoma do Arroz (Rice ice 
Annotation Project Database , RAP-DB)
 Avanço científico histórico 
 Avanço científico histórico 
● Publicado dia 19 de junho de 2014 pela revista 
britânica Nature, uma das mais importantes do 
mundo em divulgação científica. Trata-se do 
sequenciamento completo do genoma do eucalipto.
● O projeto, iniciado em 2008 pela rede internacional 
EUCAGEN (Eucalyptus Genome Network), foi liderado por 
cientistas de três países: Alexander Myburg da 
Universidade de Pretória (África do Sul); Dario 
Grattapaglia, da Embrapa Recursos Genéticos e 
Biotecnologia (Brasil), e Gerald Tuskan, do Joint Genome 
Institute – JGI do Departamento de Energia dos Estados 
Unidos (DOE).
Foto: Zander Myburg/África do Sul
Rede brasileira de pesquisa teve papel central no 
sucesso do projeto
Eucalipto é uma árvore essencial para o meio 
ambiente e para a economia
O genoma vai potencializar a produtividade e 
sustentabilidade das florestas plantadas frente 
às mudanças climáticas
1
2
3
Resultado de mais 
de 30 anos de 
estudos 
desenvolvidos por 
instituições públicas 
e privadas.
O Brasil, que tem se 
destacado no cenário 
mundial de 
melhoramento 
genético pesquisa 
genômica aplicada do 
eucalipto
e da biologia 
adaptativa de 
plantas perenes, o 
maior repositório 
terrestre de 
carbono no 
planeta.
O sequenciamento 
deste genoma é um 
passo determinante 
para que a ciência 
possa expandir seu 
conhecimento a 
respeito da evolução
Destaque no cenário mundial
Visão geraldo genoma do Eucalyptus grandis
Referências 
CARVALHO, Mayra; SILVA, Daniele. Sequenciamento de DNA de Nova Geração e suas aplicações 
na genômica das plantas. Ciência Rural, Santa Maria, v.40, n.3, p. 735-744, mar, 2010. 
Disponível em: 
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FIETTO, Juliana; MACIEL, Talles. Ciências genômicas: fundamentos e aplicações. Disponível em:
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Referências 
KREMER, Frederico. Medium: Entendendo o NGS (parte 1): Plataformas de Sequenciamento. 
Disponível em: 
https://medium.com/omixdata/entendendo-o-ngs-parte-i-plataformas-de-sequenciamento-6
6017d6d38d3. Acesso em: 8 Mar. 2021.
VERSATION: O que é Sequenciamento de DNA de Nova Geração? Disponível em:
https://www.google.com/amp/s/varstation.com/pt/blog/artigos/o-que-e-sequenciamento-d
e-nova-geracao-ngs/. Acesso em: 8 Mar. 2021.
Aprenda os fundamentos do sequenciamento de nova geração, 2020. 1 vídeo (49 min 21 seg). 
Publicado pelo canal Universo da Biologia Molecular. YouTube. Disponível em:
https://youtu.be/uKCCIAhLFrU. Acesso em: 8 Mar. 2021.
Sequenciamento de Nova Geração - Illumina, 2020. 1 vídeo (13 min 53 seg). Publicado pelo 
canal Mara Viana Silva. YouTube. Disponível em:
https://youtu.be/G6RsurIrqx8. Acesso em: 10 Mar. 2021.
https://medium.com/omixdata/entendendo-o-ngs-parte-i-plataformas-de-sequenciamento-66017d6d38d3
https://medium.com/omixdata/entendendo-o-ngs-parte-i-plataformas-de-sequenciamento-66017d6d38d3
https://www.google.com/amp/s/varstation.com/pt/blog/artigos/o-que-e-sequenciamento-de-nova-geracao-ngs/
https://www.google.com/amp/s/varstation.com/pt/blog/artigos/o-que-e-sequenciamento-de-nova-geracao-ngs/
https://youtu.be/uKCCIAhLFrU
https://youtu.be/G6RsurIrqx8
Obrigado pela atenção!