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Universidade Federal Rural do Semiárido – UFERSA Programa de Pós-graduação em Ciência Animal – PPGCA Disciplina: Tópicos Avançados em Microbiologia de Alimentos de Origem Animal Docente: Jean Berg, Alunos: Heider Ferreira, Hiagos Lima, Thiago coelho Microrganismos indicadores em alimentos de origem animal 19 DE MAIO DE 2014 Microrganismos Indicadores em Alimentos de Origem Animal Introdução Microrganismos indicadores são grupos ou espécies de microrganismos que, quando presentes e um alimento, podem fornecer informações sobre a ocorrência de contaminação de origem fecal, sobre a provável presença de patógenos ou sobre a deterioração potencial do alimento, além de poderem indicar condições sanitárias inadequadas durante o processamento, produção ou armazenamento (FRANCO & LANDGRAF, 1996). Esses microrganismos indicadores podem ser utilizados para refletir a qualidade microbiológica dos alimentos em relação à vida de prateleira ou à segurança, neste ultimo caso, devido à presença de patógenos alimentares. Em geral, microrganismos indicadores são utilizados para avaliar aspectos de qualidade a sanificação dos alimentos. Alguns critérios devem ser considerados na definição de um microrganismo ou grupo de microrganismos indicadores: devem ser facilmente detectável, quantificado, claramente distinguido de outros microrganismos da microbiota do alimento; não deve estar presente como contaminante natural do alimento; deve estar presente quando o patógeno associado estiver; deve estar ausente no alimento livre do patógeno de interesse ou presente em quantidade mínima; taxa de crescimento equivalente às dos patógenos; taxa de morte paralela a dos patógenos de interesse; ter com habitat exclusivo o trato intestinal do homem e outros animais; deveria ocorrer em números muito altos nas fezes; apresentar alta resistência ao ambiente extra-enteral; deveria haver técnicas rápidas, simples e precisas para sua detecção e/ou contagem (DOYLE, BEUCHAT, MONTIVILLE, 1997). Segundo a ICMSF (International Commission on Microbiological Specifications for Foods), microrganismos indicadores podem ser agrupados em: microrganismos que não oferecem riscos à saúde (mesófilos, psicrotróficos, termófilos, bolores e leveduras) e microrganismos que oferecem um risco baixo ou indireto à saúde (coliformes totais, coliformes fecais enterococos, enterobactérias totais, Escherichia coli). Mesófilas As bactérias mesófilas constituem um grupo capaz de se multiplicar entre 10ºC e 45ºC, sendo a temperatura ideal em torno de 30ºC. Esse grupo é importante porque inclui a maioria dos contaminantes dos alimentos de origem animal, podendo atingir altas contagens quando o alimento é mantido à temperatura ambiente. Segundo ICMS o número de microrganismos aeróbios mesófilos encontrados em um alimento tem sido um dos indicadores microbiológicos da qualidade dos alimentos mais comumente utilizados, indicando se a limpeza, a desinfecção e o controle da temperatura durante os processos de tratamento industrial, transporte e armazenamento foram realizados de forma adequada. Esta determinação permite também obter informação sobre a alteração incipiente dos alimentos, sua provável vida útil, a falta de controle no descongelamento dos alimentos ou desvios na temperatura de refrigeração estabelecida (SILVA, 2002). Psicrotróficos Bactérias psicrotróficas se multiplicam em baixas temperaturas, abaixo de 7ºC, embora a temperatura ótima de crescimento se situe entre 20 e 30ºC (Furtado, 2005). Os principais gêneros de bactérias psicrotróficas encontrados no leite são a Achromobacter, Acinetobacter, Alcaligenes, Flavobacterium e Pseudomonas (Gram-negativos) e Bacillus e Clostridium (Gram-positivos). Essas bactérias são eliminadas pela pasteurização, mas algumas enzimas produzidas pelas bactérias Gram-negativas e os esporos, produzidos pelas Gram-positivas, são termo-resistentes provocando reações bioquímicas nos constituintes do leite resultando em alterações das características normais do produto. Os dois grupos de enzimas mais importantes produzidos pelas bactérias psicrotróficas são a protease e a lípase. Elas podem atuar no leite cru, enquanto estocado, as bactérias psicrotróficas estão se multiplicando, e, também, no leite que foi pasteurizado e nos derivados lácteos, causando alterações físicas e sabores indesejáveis ao leite. Essas bactérias são normalmente encontradas na água e em vasilhames que não foram lavados adequadamente (OLIVEIRA ET AL., 2012) Termófilos As bactérias termófilas são definidas como aquelas cuja temperatura ótima de crescimento situa-se entre 45 a 65ºC, e para algumas espécies consideradas como termófilos extremos as temperaturas de crescimento podem atingir 90ºC e o mínimo em torno de 35ºC (ICMSF, 1994). O leite cru normalmente contém poucas bactérias termófilas, embora elas possam estar presentes em número suficiente para se desenvolverem no leite mantido a temperaturas elevadas, acarretando grande número desses microrganismos no produto. Essas bactérias constituem problema no leite pasteurizado quando algumas porções são mantidas, por algum tempo, entre 50ºC a 70ºC (ICMSF, 1994). Bolores e Leveduras Os fungos são microrganismos eucariotas, heterotróficos, caracteristicamente micelares, que se dividem em bolores e leveduras, com interesse não só do ponto de vista da deterioração dos alimentos, mas também pelas múltiplas utilizações industriais em que participam como agentes fermentativos (MOSS, 2000). A grande dispersão dos bolores e leveduras no ambiente justifica a sua frequente aparição como contaminantes nos produtos alimentares, visto que estes, em virtude da sua composição, constituem um excelente meio para a fixação e reprodução de grande número de espécies fúngicas, cuja proliferação ocorre com facilidade por serem mais tolerantes a factores extremos que limitam o desenvolvimento bacteriano, como baixos valores de aw, pH e temperatura (ROSS & NICHOLS, 2000). Porém, a capacidade de desenvolvimento dos bolores a baixas temperaturas constitui um problema na conservação dos produtos cárneos quando estes, após o processamento térmico, são contaminados com esporos destes microrganismos que, desenvolvendo-se, vão alterar o aspecto e as características nutricionais e organolépticas dos produtos, abreviar a sua conservação e eventualmente contaminá-los com micotoxinas. São frequentes os géneros Aspergillus spp., Penicillium spp. e Fusarium spp. (GUERRERO & CHABELA, 2000). Neste tipo de produtos, para além da qualidade das matérias-primas, o controlo do desenvolvimento dos bolores e leveduras passarão pelos cuidados a ter com a qualidade do ar nas zonas de alto risco em que o produto permanece após o processamento térmico e antes de ser embalado, na utilização de embalagens adequadas, a vácuo ou com atmosfera modificada, visto que são aeróbios estritos, ou pelo eventual recurso a conservantes (GUERRERO & CHABELA, 2000). Na ausência de cuidados após o processamento térmico, desenvolvem-se geralmente leveduras pertencentes aos géneros Candida spp., Rhodotorula spp., Saccharomyces spp., Torulaspora spp. e Tricosporon spp., que por serem microaerófilas crescem em ambientes onde existem quantidades residuais de oxigénio como pode acontecer nas embalagens a vácuo ou em atmosfera modificada, passando nestes casos o seu controlo pela utilização de conservantes (GUERRERO & CHABELA,2000). Coliformes totais Este grupo é composto por bactérias da família Enterobacteriaceae, capazes de fermentar a lactose com produção de gás, quando incubados a 35-37ºC, por 48 horas. São bacilos gram-negativos e não formadores de esporos; fazem parte desse grupo predominantemente bactérias pertencentes aos gêneros Escherichia, Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella. Destes, apenas a Escherichia coli tem como hábitat primário o trato intestinal do homem e animais homeotérmicos. O Citrobacter, Enterobacter e Klebsiella, além de serem encontrados nas fezes, também estão presentes em outros ambientes como na vegetação e no solo, onde persistem por tempo superior ao de bactérias patogênicas de origem intestinal como Samonella e Shigella. Conseqüentemente, a presença de coliformes totais no alimento não indica, necessariamente, contaminação fecal recente ou ocorrência de enteropatógenos (CUNHA,2006). Coliformes fecais e Escherichia coli De acordo com FRANCO (2003) as bactérias pertencentes a este grupo correspondem aos coliformes totais que apresentam a capacidade de continuar fermentando lactose com produção de gás, quando incubadas a temperaturas de 44- 45ºC. Os critérios microbiológicos que envolvem E.coli são úteis quando é desejável determinar se houve contaminação fecal. Atualmente, ao invés de enumerar os coliformes fecais e E.coli alguns laboratórios estão preferindo enumerar as bactérias pertencentes à família Enterobacteriaceae como um todo, isto é, as fermentadoras e não fermentadoras de lactose, pois números falsos seriam obtidos ao se verificar apenas a presença de microrganismos fermentadores de lactose, quando a população fosse constituída, na sua maioria, por microrganismos não fermentadores, incluindo-se aqui as salmonelas lactose-negativas ou outros fermentadores tardios desses açúcares (CUNHA, 2006). Enterococcus Essas bactérias, antes um subgrupo do gênero Streptococcus, a partir de 1984 passaram a pertencer ao gênero Enterococcus, com 19 espécies reconhecidas atualmente. Antes de 1984, os Estreptococcus fecais eram chamados genericamente de enterococos, e consistiam de duas espécies: Streptococcus faecalis e Streptococcus faecium. São atualmente denominados Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium. São relativamente resistentes ao calor e podem sobreviver as pasteurizações do leite. Algumas restrições quanto a utilização dos Enterococcus como indicadores de contaminação fecal dos alimentos são feitas, uma delas seria de encontrarmos em outros ambientes além do trato intestinal e apresentarem uma sobrevivência maior em relação aos enteropatógenos encontrados no solo, nos vegetais e em alimentos, principalmente naqueles submetidos à desidratação, ação de desinfetantes e a flutuações de temperatura por serem mais resistentes. Apesar das limitações do uso desses microrganismos como indicadores de contaminação fecal, sua presença em números elevados em alimentos indica práticas sanitárias inadequadas ou exposição do alimento a condições que permitiram a multiplicação de microrganismos indesejáveis (DOYLE et al., 1997) Análise microbiológica A análise microbiológica é fundamental para se conhecer as condições de higiene em que o alimento foi processado, os riscos que o alimento podem oferecer à saúde do consumidor e se o alimento terá ou não a vida útil pretendida; também se torna indispensável para verificar se os padrões de especificações microbiológicos para alimentos nacionais ou internacionais, estão sendo atendidos adequadamente. Essa pode ser qualitativa ou quantitativa, sendo utilizados muitos e variados métodos, entretanto, é recomendado a utilização de métodos aprovados por órgãos reguladores; os quais podem ser convencionais ou rápidos. O tipo de alimento analisado determina o procedimento a ser empregado e o propósito da análise; essa escolha também pode ser determinada pela suspeita de um microrganismo ser suspeito de estar causando uma enfermidade. Os métodos rápidos são utilizados apenas para controle, onde os resultados negativos prevalecem e os positivos são considerados presuntivos e confirmados por métodos padrões. Esses métodos podem ser por contagem em placas e por número mais provável (NMP). O método de contagem em placas é um método geral, que pode ser utilizado para contagem de grandes grupos microbianos, como aeróbios mesófilos, aeróbios psicrotróficos, termófilos, bolores e leveduras, variando-se do tipo de meio, a temperatura e o tempo de incubação. Na metodologia da contagem as amostras são homogeneizadas, diluídas em série, em diluente apropriado, plaqueadas com ou sobre um meio ágar apropriado e incubadas, após o que todas as colônias visíveis são contadas; o procedimento baseia-se nas premissa de que cada célula microbiana presente em uma amostra irá formar uma colônia separada e visível. A relação da contagem é feita entre o número de unidades formadoras de colônias (UFC), que podem tanto ser células individuais como agrupamentos característicos de certos microrganismos, por mililitro ou gramas de amostra. Essa metodologia é a mais empregada nos laboratórios de análises de alimentos, pois diferentes grupos de microrganismos podem ser enumerados de acordo com o meio de cultura e condições de incubação utilizadas. Os números de mesófilos aeróbios contados indicam se a limpeza, a desinfecção e o controle da temperatura durante os processos de tratamento industrial, transporte e armazenamento foram realizados de forma adequada; também permite obter informação sobre a alteração incipiente dos alimentos, sua provável vida útil, a falta de controle no descongelamento dos alimentos ou desvios na temperatura de refrigeração. A contagem de microrganismo psicrotróficos e termófilos avalia o grau de deterioração de alimentos refrigerados ou daqueles submetidos a tratamento térmico. Segundo SILVA (2002) a análise microbiológica é fundamental para se conhecer as condições de higiene em que o alimento foi processado, os riscos que o alimento podem oferecer à saúde do consumidor e se o alimento terá ou não a vida útil pretendida; também se torna indispensável para verificar se os padrões de especificações microbiológicos para alimentos nacionais ou internacionais, estão sendo atendidos adequadamente. Essa pode ser qualitativa ou quantitativa, sendo utilizados muitos e variados métodos, entretanto, é recomendado a utilização de métodos aprovados por órgãos reguladores; os quais podem ser convencionais ou rápidos. O tipo de alimento analisado determina o procedimento a ser empregado e o propósito da análise; essa escolha também pode ser determinada pela suspeita de um microrganismo ser suspeito de estar causando uma enfermidade. Os métodos rápidos são utilizados apenas para controle, onde os resultados negativos prevalecem e os positivos são considerados presuntivos e confirmados por métodos padrões. Esses métodos podem ser por contagem em placas e por número mais provável (NMP). O método de contagem em placas é um método geral, que pode ser utilizado para contagem de grandes grupos microbianos, como aeróbios mesófilos, aeróbios psicrotróficos, termófilos, bolores e leveduras, variando-se do tipo de meio, a temperatura e o tempo de incubação. Na metodologia da contagem as amostras são homogeneizadas, diluídas em série, em diluente apropriado, plaqueadas com ou sobre um meio ágar apropriado e incubadas, após o que todas as colôniasvisíveis são contadas; o procedimento baseia-se na premissa de que cada célula microbiana presente em uma amostra irá formar uma colônia separada e visível. A relação da contagem é feita entre o número de unidades formadoras de colônias (UFC), que podem tanto ser células individuais como agrupamentos característicos de certos microrganismos, por mililitro ou gramas de amostra. Essa metodologia é a mais empregada nos laboratórios de análises de alimentos, pois diferentes grupos de microrganismos podem ser enumerados de acordo com o meio de cultura e condições de incubação utilizadas. Contagem de bolores e leveduras Bolores são fungos filamentosos, multicelulares, podendo estar presente no solo, no ar, na água e em matéria orgânica em decomposição, em quanto que as leveduras são fungos não filamentosos (SIQUEIRA, 1995). Esses microrganismos apresentam um crescimento mais lento do que as bactéria nos alimentos de baixa acidez e alta atividade de água, sendo por isso causa pouco provável da deterioração desses alimentos. No entanto em alimentos ácidos e de baixa atividade de água, o crescimento de fungos é maior, provocando deterioração e contaminação dos produtos destinados a alimentação. De acordo com Dias (2014), esses microrganismos são amplamente distribuídos no ambiente, podendo ser encontrados no ar e nos alimentos nos quais constituem uma importante fonte de contaminação. A temperatura, a taxa de ventilação, o número de pessoas que ocupam o ambiente, a natureza e grau de atividade desempenhada por esses indivíduos, bem como a matéria-prima utilizada, são fatores que favorecem o desenvolvimento desses fungos. Oliveira; Lyra e Esteves (2013), avaliando iogurtes de morango industrializados e comercializados no município de linhares – ES, encontraram valores na contagem de leveduras e bolores superiores a 103 UFC/g, valor acima do permitido pela legislação brasileira. Segundo os mesmos autores, a presença de leveduras e fungos filamentosos em iogurte é um indicativo de práticas sanitárias insatisfatórias na fabricação ou na embalagem do produto. Sendo assim, a presença de leveduras e bolores em um índice elevado nos alimentos pode fornecer várias informações, tais como, condições higiênicas deficientes de equipamentos, falha no processamento ou armazenamento e matéria prima com contaminação excessiva. A contagem de bolores e leveduras é aplicada principalmente para alimentos ácidos com PH menor que 4.5, alimentos desidratados e farinhas (SIQUEIRA, 1995). Técnica do Número Mais Provável (NMP) A técnica do Número Mais Provável, também chamada de técnica dos tubos múltiplos, é bastante utilizada pelos laboratórios de microbiologia de alimentos para estimar a contagem de alguns tipos de microrganismos, como coliformes fecais, coliformes totais, E.coli e Staphylococcus aureus (CUNHA e SILVA, 2006). É considerada uma técnica de baixo custo, que permite estimar a densidade da população empregando-se diferentes meios de cultivo, analisando-se o crescimento celular microbiano através da leitura da turvação do meio e determinação de produtos metabólicos no meio, como gases, ácidos e álcoois (VAZZOLLER, 1995), podendo ser utilizada para estimar a população total ou um grupo específico de microrganismos em uma amostra. Giaj-Levra (1991) cita que o NMP é um método muito simples para quantificar microrganismos anaeróbios, apesar da leitura dos resultados exigir, às vezes, exames microscópios e análises cromatográficas de gases para complementação dos resultados. Na técnica do Número Mais Provável, o produto a ser analisado, após homogeneização, é submetido a, pelo menos, três diluições decimais seriadas. De cada uma dessas diluições, alíquotas iguais são transferidas para três ou para cinco tubos contendo o meio de cultura escolhido e um tubo coletor de gás (tubo de Durhan). Todos os tubos são incubados, e em seguida, os positivos são identificados. Pelo número de tubos positivos em cada uma das diluições empregada determina-se o Número Mais Provável por grama de produto, tendo como base a tabela estatística de Hoskins para três ou para cinco tubos. (Franco, 2003) Métodos rápidos e automatizados para enumeração de microrganismos indicadores Petrifilm O sistema Petrifilm é composto por um sistema de filme duplo: um filme que serve de base, recoberto com nutrientes desidratados e agentes geleificantes solúveis à frio, e um filme superior, de polietileno, que contém um indicador de cor e agentes geleificantes. A amostra, diluída ou não, é inoculada na superfície do filme base e o filme superior é sobreposto. Com o auxilio de um difusor plástico, a amostra é espalhada em uma área determinada. Após solidificação da substância geleificante, o conjunto é incubado na temperatura e tempo indicados pelo fabricante. Após a incubação, as colônias visíveis são enumeradas e o resultado é expresso em UFC/mL (NERO; BELOTI; BARROS, 2000). SimPlate Osistema SimPlate foi desenvolvido pela IDEXX Lab. Inc.,Westbrook, MA, EUA . com o objetivo de oferecer um diagnóstico rápido e pratico na detecção de diversos microrganismos presentes em alimentos, fornecendo resultados em Número Mais Provável (NMP ) baseado na positividade de 84 cavidades de uma placa especialmente desenvolvida. A amostra a ser analisada é adicionada ao meio de cultura e a mistura é transferida para a placa de SimPlate. Após a retirada do excesso de liquido, a placa é invertida e incubada a 35 °C por 24h. O total de microrganismos viáveis é determinado pelo número de cavidades com resultado positivo que corresponde a um valor de NMP de UFC, conforme uma tabela de equivalência fornecida pelo fabricante (NERO; BELOTI; BARROS, 2000). ColiSure O sistema ColiSure foi desenvolvido para a detecção qualitativa de coliformes totais e E. coli em água. O meio desidratado é reconstituído em 100 ml de amostra de água e incubado á 35°C por 24h. A presença de coliformes é observada pela coloração vermelha e a presença de E. coli é identificada Pela fluorescência à luz ultravioleta (NERO; BELOTI; BARROS, 2000). Plaqueamento em espiral O plaqueamento em espiral é realizado por um equipamento que permite a automatização na semeadura de amostras de alimentos. Nesse sistema, a amostra do alimento, previamente homogeneizada, é depositada automaticamente, de forma uniforme e contínua, em quantidades decrescentes sobre uma placa com meio de cultura solidificado, obedecendo ao formato de um espiral de Archimedes, do centro para a borda da placa. Após a semeadura, a placa é incubada e as colônias crescem ao longo da trilha espiral formada pelo processo. De acordo com a quantidade de amostra dispensada, a placa é dividida em setores correlacionados com diluições, que poderão ser escolhidos para contagem, já que uma mesma placa apresenta diluições decimais em duplicata (NERO; BELOTI; BARROS, 2000). Referências CUNHA, M. A. DA; SILVA, M. 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OLIVEIRA, D.T.; MOREIRA, A.; URNAU, L.; NOSKOSKI, L.; CERESER, N. D. Psicrotróficos na indústria de laticínios. XV Amostra de Iniciação Científica. UNICRUZ, RS. 2012. OLIVEIRA, F. M. de; LYRA, I.N.; ESTEVES, G. S. G. Avaliação microbiológica e físico-química de iogurtes de morango industrializados e comercializados no município de linhares – ES. Revista Brasileira de Produtos Agroindustriais. v.15, n.2, p.147-155. Campina Grande, 2013. ROSS, T. & NICHOLS, D. (2000). Ecology of bacteria and fungi in foods. Influence of temperature. In: Robinson, R.; Batt, C. & Patel, P. Encyclopedia of food microbiology. Bath: Academic Press. SILVA, M. C. Avaliação da qualidade microbiológica de alimentos com a utilização de metodologias convencionais e do sistema SimPlate. São Paulo. Dissertação (Mestrado)- Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, Universidade de São Paulo, 2012. SIQUEIRA, R. S. Manual de microbiologia de alimentos. Brasília : EMBRAPA, SPI, Rio de Janeiro: EMBRAPA, CTAA, 1995. 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