Aula 11 CL 08 07 14

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Aula 11 – Cromatografia Líquida de 
Alta Eficiência (CLAE) 
Julio C. J. Silva 
Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF) 
Instituto de Ciências Exatas 
Depto. de Química 
Juiz de Fora, 2014 
QUI 070 – Química Analítica V 
Análise Instrumental 
Introdução 
• Cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) é o tipo mais versátil e 
mais amplamente empregado de cromatografia por eluição. 
 
• Na cromatografia líquida, a fase móvel é um solvente líquido, o qual 
contém a amostra na forma de uma mistura de solutos. 
 
• O tipo de cromatografia líquida de alta eficiência é geralmente definido 
pelo mecanismo de separação ou pelo tipo de fase estacionária: 
• (1) partição ou cromatografia líquido-líquido; 
• (2) adsorção ou cromatografia líquido-sólido; 
• (3) troca iônica ou cromatografia de íons; 
• (4) cromatografia por exclusão; 
• (5) cromatografia por afinidade; 
• (6) cromatografia quiral. 
 
• A cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE) tornou-se uma 
ferramenta analítica indispensável. Os laboratórios 
• criminais e os programas de televisão policiais e forenses, como CSI, 
CSI Miami, Crossing Jordan e Law and Order, freqüentemente 
empregam a CLAE no processo de obtenção de evidências criminais. 
Introdução 
• Nos anos de 1960 que se desenvolveu a tecnologia para 
produzir e utilizar recheios com diâmetros de partículas tão 
pequenos como 3 a 10 µm. 
 
• O termo cromatografia líquida de alta eficiência é sempre 
empregado para distinguir essa tecnologia dos procedimentos 
cromatográficos realizados em colunas simples que os 
precederam. 
 
• A cromatografia de coluna simples, contudo, ainda encontra 
considerável uso para propósitos preparativos. 
Instrumentação 
• Cromatografia líquida moderna: 
 
– Altas pressões de bombeamento  velocidades 
razoáveis por recheios de partículas muito 
pequenas (3 – 10 µm) 
 
– Equipamentos mais complexos 
 
– Equipamentos mais caros 
 
Instrumentação 
 
Instrumentação 
 
Instrumentação 
• Reservatório de fase móvel 
• Sistemas de tratamento de solventes 
 
– Gases dissolvidos e material particulado  devem ser retirados 
 
– Desgaseificadores  vácuo, sistemas de destilação, 
aquecimento e agitação e sistema de “sparging” 
 
– Sparging  sistema pelo qual os gases dissolvidos são 
arrastados para fora de um solvente por pequenas bolhas de um 
gás inerte e solúvel 
 
• Sistema de Eluição: 
 
– Isocrático  constituição do solvente permanece constante 
 
– Gradiente  composição do solvente é alterada 
 
Instrumentação 
 
Instrumentação 
Sistema de Bombeamento 
• Requisitos: 
– Habilidade de gerar pressões altas (até 6.000 psi) 
 
– Saída livre de pulsação 
 
– Vazões na faixa 0,1 – 10 mL/min 
 
– Reprodutibilidade relativa da vazão de 0,5% ou melhor 
 
– Resistência a corrosão 
 
• Tipos de bomba: 
– De seringa 
 
– Bomba recíproca 
 
– Bomba pneumática de pressão 
 
 
Instrumentação 
Sistema de Bombeamento 
• Bomba de seringa (rosca): 
– Saída livre de pulsação 
– Pequena capacidade de volume ( ± 250 mL) 
– Troca de solventes  difícil 
 
• Bomba recíproca: 
– Fluxo pulsado que deve ser atenuado 
– Pequeno volume interno 
– Alta pressão de saída (10.000 spi) 
– Eluição por gradiente 
– Vazões constantes 
 
• Bomba pneumática de pressão 
– Barata 
– Simples 
– Livres de pulsação 
– Eluição por gradiente  não permite 
 
 
Instrumentação 
 
 
 
 
 
 
Instrumentação 
Sistema de Injeção da Amostra 
• Alça de amostragem 
– Permite a escolha do volume (5 a 500 µL) 
– Boa precisão 
– Auto-amostradores 
 
 
 
 
 
 
Instrumentação 
Colunas para cromatografia 
• Aço inoxidável 
 
• Comprimento  10 a 30 cm 
 
• Diâmetro  2 a 5 mm 
 
• Recheio  partículas de 3 – 10 µm 
 
• Microcolunas  d.i = 0,1-5 mm, l = 3 – 8 cm, recheio = 3 – 5 µm 
 
• Vantagens: 
– Maior eficiência da coluna 
– Menor consumo de solventes 
– Maior velocidade de eluição 
Instrumentação 
Colunas para cromatografia 
 
• Microcolunas  exemplo: 
 
Instrumentação 
Colunas para cromatografia 
 
• Recheio 
 
– Sílica (suporte)  partículas com diâmetros altamente uniformes 
 
– Fase estacionário  composto orgânico química ou fisicamente ligados a 
superfície do suporte. 
 
• Colunas de proteção (guarda) 
 
– Posicionada a frente da coluna analítica 
– Função  aumentar a vida útil da coluna analítica 
– Composição semelhante a composição da coluna analítica 
 
• Termostato para coluna  manter a temperatura sob 
controle. 
 
 
 
Instrumentação 
Detectores 
 
• Pequeno volume morto 
 
• Pequeno e compatível com a vazão de líquido 
 
• Não existe detector universal 
 
• Tipos de detectores: 
 
 
 
 
 
Instrumentação 
Detectores 
Instrumentação 
 
Tipos de CLAE (partição) 
• Cromatografia por partição  a fase estacionária 
é um líquido imiscível com a fase móvel 
 
• Cromatografia por partição líquido-líquido FE é 
um solvente que é imobilizado por adsorção 
 
• Cromatografia por partição com fase ligada  FE 
é um composto orgânico imobilizado por ligações 
químicas 
 
• Amplamente empregada 
 
 
Tipos de CLAE (Partição) 
Recheios com fase ligada 
 
 
 
 
• FE  diferentes polaridades 
 
• Características: 
– Maior estabilidade 
– Compatível com CLAE por gradiente 
– Pequena capacidade de amostra 
 
• Recheios de Fase Normal e Reversa 
– Fase normal  A FE é polar e a fase móvel é apolar 
 
– Fase reversa  A FE é apolar e a fase móvel é polar 
 
Tipos de CLAE (Partição) 
Escolha das Fases Móvel e Estacionária 
 
• Regra geral: 
 iguala-se a polaridade do analito com a da FE 
 
 Usas-se uma FM com polaridade diferente da FE 
 
 Analito e FM com polaridades semelhantes não é vantajoso... 
 
 Analito e FE com polaridades muito parecidas também não é 
vantajoso... 
 
 
 
 
 
 
Tipos de CLAE (Partição) 
• Aplicações: 
Tipos de CLAE (Partição) 
• Aplicações: 
Tipos de CLAE (Adsorção) 
• CLAE por adsorção  Os analitos são adsorvidos 
sobre uma superfície de um sólido polar finamente 
dividido (recheio) 
 
• A FM é constituída por um solvente orgânico ou 
por uma mistura de solventes orgânicos 
 
• A FE é composta por partículas de sílica ou alumina 
Tipos de CLAE (Troca Iônica) 
• Existem dois tipos  Baseadas em supressores e coluna 
única 
 
• Cromatografia de íons baseadas no uso de supressores: 
 
• Detector de condutividade  sensíveis, universais para 
espécies carregadas, simples, baixo custo e fáceis de serem 
miniaturizados 
 
• Limitação  alta concentração de eletrólito para eluição da 
maioria dos íons dos analitos 
 
• Conseqüentemente  alta condutividade e baixa 
sensibilidade 
 
• Porém, em 1975... 
 
Tipos de CLAE (Troca Iônica) 
 
• Porém, em 1975... 
 
• Coluna supressora de eluente  coluna recheada com uma 
resina trocadora de íons que converte os íons do solvente de 
eluição para espécies moleculares de ionização limitada 
 
• Na determinação de cátions: 
 
 
• Na determinação de anions: 
 
 
Tipos de CLAE (Troca Iônica) 
Supressora Coluna 
Tipos de CLAE (Troca Iônica) 
Coluna de guarda 
Tipos de CLAE (Troca Iônica) 
Fluoreto 
Sulfato 
Cloreto 
Tipos de CLAE (troca iônica) 
 
Tipos de CLAE (Exclusão) 
• O fracionamento é baseado nos tamanhos 
das moléculas• Filtração em gel  recheio hidrofílico 
(espécies polares) 
 
• Permeação em gel  recheio hidrofóbico 
(espécies apolares) 
 
Tipos de CLAE (Exclusão) 
• Aplicação: 
CLAE versus CG 
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 
 
1. Silva, L.L.R. Notas de Aula. FACET, UFVJM, 2008. 
 
2. Cadore, S. Notas de Aula. IQ, UNICAMP, 2004. 
 
3. SKOOG, D. A; HOLLER, F. J.; NIEMAN, T. A., Princípios 
de Análise Instrumental, 5ª edição, Editora Bookman, 
2006. 
 
4. COLLINS, H. C.; BRAGA, G. L.; BONATO, P. S., 
Fundamentos de Cromatografia, Editora Unicamp, 2006.