Atividade de cromatografia

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE
ESCOLA DE QUÍMICA E ALIMENTOS
Engenharia de Alimentos - Análise de Alimentos II - 2022/1
Turmas A, B e C
Prof.ª: Aline Iahnke
Atividade 3 – 2° Bimestre 
Eduarda Anghinoni Martins – 124610
CROMATOGRAFIA 
O nome Cromatografia foi criado pelo botânico russo Mikhael Semenovich Tswettem em 1906, quando ele separou clorofila de uma mistura de pigmentos de planta. Naquela época ainda não e existiam métodos de separar substancias contidas nos extratos vegetais e animais. Foi quando Tswett teve a ideia de encher com carbonato de cálcio um tudo muito semelhante a uma bureta, o tubo foi fixado na vertical sobre o carbonato de cálcio foi colocado um extrato de folhas e depois adicionado o éter de petróleo. Tswett então percebeu que o extrato vegetal estava sendo arrastado para a parte inferior da coluna e que a cor verde escura original estava sendo decomposta em zonas coloridas com duas tonalidades de verde (clorofilas), laranja (caroteno) e amarelo (xantofila). Assim foi descoberto um método de separação dos componentes de uma mistura. Daí vem o nome da técnica, pois, em grego “cromo” significa “cor” e “grafia” significa “escrita” o que quer dizer “escrevendo em cores”, embora o nome cromatografia se refira a zonas coloridas, o método se aplica também a substancias incolores.
A cromatografia é um método físico químico de separação dos componentes de uma mistura, realizada através da distribuição desses componentes entre duas fases, que entram em contato. Uma das fases permanece fixa (fase estacionária - FE), enquanto a outra move-se através dela (fase móvel - FM). Durante a passagem da fase móvel sobre a fase estacionária, as substancias da mistura são distribuídas entre duas fases, de modo que as menos solúveis na fase estacionária (mais solúveis na fase móvel) tem uma movimentação mais rápida ao longo da coluna, enquanto as mais solúveis na fase estacionária serão seletivamente retidas, tendo uma movimentação mais lenta. 
Segundo Collins e Braga (1987), podemos classificar a cromatografia de acordo com a figura abaixo, em função da polaridade das duas fases. 
Imagem retirada do livro: Fundamentos teóricos e práticos em análise de alimentos.
· Fase normal: fase estacionária polar e fase móvel apolar, FE mais polar, FM mais apolar, aumento da polaridade do soluto e maior tr.
· Fase reversa: fase estacionária apolar e fase móvel polar, FE mais apolar, FM mais polar, aumento da polaridade do soluto e menor tr.
Dependendo do tipo de fase estacionária, a transferência dos componentes da fase móvel para a fase estacionária é geralmente devido a um ou mais fatores como:
1. Adsorção na superfície das partículas sólidas da fase estacionária;
2. Partição entre os líquidos da fase móvel e da fase estacionaria que fica nos poros de um suporte sólido inerte;
3. Formação de ligações heteropolares com componentes iônicos da fase estacionária. 
O mecanismo de adsorção acontece quando a FE é um sólido e a FM é um líquido ou um gás. Um exemplo do mecanismo de adsorção é em cromatografia em camada delgada que utiliza um sólido, como sílica ou alúmina, como adsorvente, e uma mistura de solventes (líquido) como fase móvel. A adsorção se dá na interface entre o sólido e a fase móvel, devido á presença de grupos ativos na sua superfície. Tal mecanismo ocorre também em cromatografia gás-sólida e cromatografia líquida-sólida em coluna. 
O mecanismo de absorção ou partição ocorre quando a fase estacionária é um líquido espelhado na superfície de um suporte sólido e inerte, ou aderido nas paredes do tubo cromatográfico. O processo é intrafacial, ocorrendo por absorção ou partição, e baseia-se nas diferentes solubilidades dos componentes da amostra na fase estacionaria líquida e na fase móvel também líquida. Esse mecanismo é encontrado na cromatografia em papel e na líquida-gasosa e líquida-líquida, em coluna. Existe um mecanismo misto entre a partição e adsorção, porque podem ocorrer os dois processos. É o caso da fase estacionária sólida, como sílica polar, quimicamente ligada a grupos apolares, como cadeia longas e alquila (fase reversa). Porém essas fases estacionárias apresentam aos componentes da amostra tanto as cadeias longas de alquila, que funcionam como líquido apolar, como a superfície solida da sílica com compostos ativos interfaciais. Esse tipo de mecanismo é encontrado na cromatografia líquida de fase reversa em coluna a pressão atmosférica e a alta pressão. 
Os métodos cromatográficos tem uma faixa de aplicação praticamente ilimitada, podem ser usados para separação desde moléculas menores, como H2 e D2, até as maiores, como proteínas etc. Quantidades na ordem de picogramas podem ser separadas e detectadas por cromatografia gasosa combinada com espectrometria de massa, enquanto no outro extremo de peso, quantidade em multigramas podem ser separadas e isoladas por métodos de coluna preparativa.
Cromatograma é a demonstração gráfica da separação obtida por alguma técnica cromatográfica, planar ou em coluna. Através do cromatograma podemos retirar dados para uma análise qualitativa e quantitativa da amostra. 
CROMATOGRAFIA PLANAR 
A cromatografia planar (papel e camada delgada) apresenta o cromatograma no qual são usadas as seguintes nomenclaturas: 
Imagem retirada do livro: Fundamentos teóricos e práticos em análise de alimentos
A cromatografia em papel, foi desenvolvida em 1944, é uma técnica simples econômica de separação dos componentes de uma mistura, podendo em alguns casos, ter uma aplicação qualitativa e quantitativa. Classifica-se como cromatografia líquida-líquida, e a separação ocorre por partição do soluto entre dois líquidos. 
Está baseada nas diferentes solubilidades relativas dos componentes da amostra na fase móvel (líquida) e na fase estacionária (líquida). Os componentes menos solúveis na fase estacionaria tem uma movimentação mais rápido ao longo do papel, enquanto os mais solúveis serão seletivamente retidos, tendo uma movimentação mais lenta.
As algumas vantagens deste método são:
· Simples e econômica;
· Utiliza uma pequena quantidade de amostra;
· Boa capacidade de resolução;
· Praticidade (o papel pode ser recortado).
A cromatografia em camada delgada também é uma técnica simples e antiga, desenvolvida em 1938, mas somente a partir da década de 60 passou a ser bastante utilizada na maioria dos laboratórios de análise.
A cromatografia em camada delgada é considerada uma cromatografia em coluna modificada para o plano, pois ela consiste na separação dos componentes de uma mistura por migração diferencial sobre uma camada delgada de adsorvente preso sobre uma superfície plana. Essa superfície é geralmente de vidro plano, porem pode ser também de alumínio com vantagem de poder ser recortada.
Essa técnica apresenta uma série de vantagens:
· Fácil execução;
· Rapidez;
· Versatilidade;
· Grande reprodutibilidade;
· Baixo custo (em relação aos métodos instrumentais, porem mais alto custo em relação a cromatografia em papel);
· Aplicação analítica ou preparativa, cuja escala está na dependência da espessura da camada de adsorvente e da amostra em análise. 
Existem algumas vantagens da camada delgada sobre o papel como fase estacionária: 
· Maior rapidez e eficiência de separação: camada delgada é composta de partículas finas em relação às fibras do papel;
· Uso de reagentes de revelação corrosivos como o ácido sulfúrico;
· Mais sensível e necessita de menor quantidade de amostra: entre 10 a 100 vezes mais sensível;
· Mais versátil em relação a fase estacionária.
Porém existem algumas desvantagens em relação a cromatografia em papel, como:
· Mais cara;
· Mais difícil de tirar as manchas da placa para análise por outros métodos;
· Menos uniformidade para fazer a camada delgada.
APLICAÇÕES: 
Para cromatografia em papel - Determinações dos seguintes componentes em vários tipos de alimentos:
· Aminoácidos, peptídeos e proteínas;
· Carboidratos;
· Vitaminas;
· Ácidos orgânicos;
· Álcoois;
· Antocianinas;
· Compostos fenólicos;
· Flavorizantes naturais e artificiais;
· Corantesnaturais e artificiais;
· Conservadores;
· Antioxidantes;
· Estabilizantes e emulsificantes;
· Resíduos de pesticidas
· Adulterantes em geral.
Para as cromatografias em camada delgada são as mesmas que para as cromatografia em papel, além das micotoxinas, carotenoides e contaminantes de embalagens.
CROMATOGRAFIA EM COLUNA 
A cromatografia em coluna pode ser de vários tipos e apresenta o seguinte cromatograma, obtido de um gráfico registrado através de um registrador ou uma impressora, contendo as seguintes nomenclaturas:
Imagem retirada do livro: Fundamentos teóricos e práticos em análise de alimentos.
No cromatograma registrado da cromatografia em coluna, a linha de base representa a passagem somente da fase móvel através do detector. Quando os componentes da amostra são eluídos, aparecem os picos, cujas áreas são proporcionais as concentrações. 
Essa técnica é dividida em quatro partes, de acordo com o tipo de mecanismo de separação, o qual reflete a natureza da fase estacionária:
· Cromatografia de adsorção;
· Cromatografia de partição;
· Cromatografia de exclusão molecular;
· Cromatografia de troca iônica. 
Cromatografia de adsorção – Cromatografia líquida-líquida:
Nesse tipo de cromatografia, a fase estacionária é um sólido de superfície ativa, que pode ser: sílica-gel, alúmina, celulose etc. Esse sólido é empacotado dentro da coluna de vidro ou de aço, e a fase móvel que é um solvente composto de um ou mais líquidos orgânicos, vai eluir os componentes da mistura através da coluna. Nesse tipo de cromatografia, a técnica é chamada de fase normal, quando a fase estacionaria é polar e a fase móvel apolar; e de fase reserva em caso contrário. 
Cromatografia de partição – Cromatografia líquida-líquida:
Nesse método, a coluna é empacotada com um suporte sólido de grande área de superfície, que é embebido com uma fase líquida. A amostra é aplicada no topo da coluna como uma zona muito estreita e é desenvolvida passando-se uma fase móvel líquida imiscível com a fase estacionária. As separações resultam porque solutos relativamente mais solúveis na fase líquida estacionária migram mais devagar que aqueles com uma solubilidade relativa maior na fase móvel líquida. 
Em todos os casos, os solutos são mais solúveis na fase estacionaria que na fase móvel. Para separação de uma mistura polar, entretanto, um líquido polar é a fase estacionária e um líquido menos polar é a fase móvel (isto é a cromatografia de partição normal). Na fase reserva, solutos não-polares são separados numa fase estacionária menos polar com uma fase móvel mais polar. 
Cromatografia líquida de troca iônica:
É a técnica cromatográfica mais antiga, pois em 150, os químicos especialistas em solo Way e Thompson descobriram que o solo tem a capacidade de remover íons NH4+ de soluções, substituindo-os por íons Ca2+. Porém foi somente em 1917 que Folin e Bell utilizaram a técnica de cromatografia por troca iônica em técnicas analíticas para determinação de amônia na urina. 
A separação acontece por troca de íons entre os solutos da amostra e os componentes iônicos das fases móvel e estacionária. A coluna é empacotada com uma fase estacionária sólida contendo grupos iônicos que podem trocar reversivelmente cátions ou ânions com uma solução iônica. A mistura de íons é colocada no topo da coluna e é desenvolvida com uma fase líquida iônica de lavagem. Os íons na mistura da amostra, que são atraídos na fase estacionária por forças eletrostáticas, são deslocados pelo eluente (FM iônica), por troca de lugar, e movidos para baixo da coluna em velocidades diferentes, dependendo de suas afinidades relativas com a resina. 
Cromatografia de exclusão molecular:
É uma técnica que teve início na década de 60, e caracteriza-se por ter propriedades bem distintas das demais cromatografias em coluna aberta. Os componentes da amostra não têm afinidade nem com a fase móvel nem com a fase estacionária. Eles são separados por seleção de tamanho das moléculas do soluto, que passarão através da fase estacionária, que faz o papel de uma peneira molecular. A fase móvel tem o papel de apenas dissolver os componentes da amostra para carrega-los através da coluna.
APLICAÇÕES: 
Cromatografia de partição:
· Vitaminas;
· Ácidos graxos em óleos e gorduras;
· Antioxidantes: BHA e BHT.
Cromatografia de exclusão molecular:
· Proteínas;
· Polissacarídeos;
· Triacilgliceróis;
· Compostos naturais responsáveis por sabor/odor e cor;
· Resíduos de pesticidas.
Cromatografia líquida de troca iônica
· Tratamento da dureza da água;
· Metais em traços;
· Ácidos orgânicos em frutas;
· Proteínas e aminoácidos;
· Vitaminas do complexo B;
· Bromato em pão.
Cromatografia de adsorção:
· Vitaminas;
· Carotenoides;
· Micotoxinas (aflatoxinas);
· Oligossacarídeos.
REFERÊNCIAS
CECCHI, Heloisa Máscia. Fundamentos teóricos e práticos em análise de alimentos. 2. ed. Campinas: Editora Unicamp, 2003.
Material didático disponível no ava.