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CROMATOGRAFIA
SERVIÇO PÚBLICO FEDERAL
INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAÇÃO, CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE MATO GROSSO
CAMPUS BELA VISTA
DEPARTAMENTO DE ENSINO
Profa. Adriana de Paula Cardoso Siqueira
dridpaula@hotmail.com
✓ A palavra cromatografia é de origem grega (kromatos – cor; graphos – escrita) e foi usada
pela 1ª vez em 1906, pelo botânico russo Mikhael Tswett, para descrever a separação de
pigmentos de plantas em zonas de cores distintas.
CROMATOGRAFIA
✓ A partir de 1906 o uso da cromatografia se tornou popular como um método de
identificação e de separação de substâncias.
✓ Atualmente, o método aplica-se também a substâncias incolores, porém o nome
original foi mantido.
HISTÓRICO
✓A separação dos componentes pode ser verificada por meio de faixas coloridas na
coluna
✓ EXPERIMENTO: Separar pigmentos de folhas verdes usando uma coluna
empacotada com CaCO3 (fase estacionária) e éter de petróleo (fase móvel).
À medida que a fase móvel percorre a fase
estacionária, os componentes da mistura vão
interagir de maneira distinta com a fase
estacionária, e essa diferença de interação
provoca a separação dos componentes.
• Técnica de separação de misturas com base nas características físico-químicas de cada molécula
➢ FUNDAMENTO DA TÉCNICA
CROMATOGRAFIA
FASE ESTACIONÁRIAFASE MÓVEL
Fase que se move é 
denominada
Fase que NÃO se 
move é denominada
LÍQUIDOS OU GASES SÓLIDOS OU LÍQUIDOS
Fase estacionária
Fase 
móvel
PRINCÍPIO BÁSICO DA CROMATOGRAFIA
✓ Transporte dos componentes de uma amostra por uma fase móvel através de uma fase 
estacionária
REPRESENTAÇÃO ESQUEMÁTICA DE UMA SEPARAÇÃO CROMATOGRÁFICA
F. Móvel
F. Estacionária
Analitos
✓Identificação de compostos, por comparação com padrões previamente 
existentes
✓Purificação de compostos, separando-se de substâncias indesejáveis
✓Separação dos componentes de uma mistura
✓Em análises qualitativas e quantitativas
APLICAÇÕES DA CROMATOGRAFIA
EXEMPLOS
✓Purificação de produtos farmacêuticos
✓ Industria Farmacêutica – verificação da pureza de medicamentos,
identificação de compostos ativos, controle de qualidade
✓ Indústria de alimentos: detecção de resíduos de pesticidas em alimentos e 
análise de alimentos
✓Monitoramento ambiental: determinação de resíduos de pesticidas em águas
ou esgotos
CROMATOGRAFIA
Indústria petroquímica
Veterinária
Farmacêutica
Alimentícias
Forense
Ambiental
Ciência 
e 
Pesquisa
➢ Maior variedade de aplicações
➢ Identificação de analitos em baixas concentrações
➢ Quantidades pequenas de amostras tanto para fins quantitativos quanto
qualitativos
➢ Maior sensibilidade e repetibilidade
VANTAGENS
➢ Amostras altamente complexas
Tipos de cromatografia
CROMATOGRAFIA
PLANAR
C. PAPEL C. C. DELGADA
COLUNA
F. M. GASOSA F. M. LÍQUIDA
C. GASOSA CLAE
• É um método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura, preferencialmente
utilizado para análise qualitativa
• Técnica de separação é de partição líquido-líquido, ou seja, os componentes de uma mistura são
separados pela suas diferenças de solubilidade nas duas fases estacionária e móvel
✓ CROMATOGRAFIA EM PAPEL (CP) 
• A solubilidade é a propriedade em que um componente da mistura se dissolve na fase móvel. Quanto
maior for a solubilidade na fase móvel, mais rapidamente a molécula se moverá pela coluna.
CROMATOGRAFIA PLANAR
• Este método, embora menos eficiente que a CCD, é muito útil para a separação de compostos polares.
CROMATOGRAFIA PLANAR
✓ CROMATOGRAFIA EM PAPEL (CP) 
• A fase móvel pode ser um solvente puro ou uma mistura de solventes.
• A fase estacionária consiste de celulose praticamente pura,
que pode absorver até 22% de água.
• A água absorvida que funciona como fase estacionária líquida e
que interage com a fase móvel, também líquida (partição
líquido-líquido).
• A fase móvel movimenta-se através da fase estacionária por ação de capilaridade
✓ CROMATOGRAFIA EM PAPEL (CP) 
• É uma técnica de adsorção líquido – sólido.
CROMATOGRAFIA PLANAR
✓ Cromatografia em Camada Delgada (CCD) 
• A adsorção é a propriedade em que um componente da mistura adere à fase estacionária. Quanto maior for a
adsorção à fase estacionária, mais lentamente a molécula se moverá.
• A adsorção é o processo físico-químico em que as moléculas, átomos ou íons ficam retidos na superfície de uma
substância, em geral, substâncias sólidas.
• A fase móvel (solvente) eluirá pela camada adsorvente (fase estacionária)
CROMATOGRAFIA PLANAR
✓ Cromatografia em Camada Delgada (CCD) 
• A fase estacionária consiste em um adsorvente
extremamente polar (como sílica em gel, alumina, celulose
e poliamida), o qual adere à superfície de uma placa (na
maioria das vezes, de vidro)
• Na fase móvel utiliza-se solvente menos polar
• Melhores resultados são obtidos com misturas de solventes, de modo a se obter uma polaridade média em
relação à polaridade dos componentes da amostra.
• Os componentes da amostra irão se deslocar pela fase 
móvel, de modo que o mais polar fica mais retido na fase 
móvel e o menos polar fica menos retido.
CROMATOGRAFIA PLANAR
✓ Cromatografia em Camada Delgada (CCD) 
Cálculo do Rf : é a razão entre a distância percorrida pelo componente e a distância percorrida pelo solvente.
Fator de retenção (Rt) é um 
parâmetro utilizado em CCD
1. Calcular o Rf de A e de B
2. Dois componentes A e B, foram separados por CCD (cromatografia em camada delagada). Quando a frente
do solvente atingiu, 6,5 cm, acima do ponto de aplicação da amostra, a mancha de A, estava a 5 cm, a de B a
3,6 cm. Calcular o Rf de A e de B. Desenhar esta placa, obedecendo o mais fielmente possível as distâncias
fornecidas.
3. Considerando a cromatografia em papel responda:
a) Qual é o estado físico da fase móvel e da fase estacionária na cromatografia em papel?
a) Qual é o mecanismo de separação da cromatografia em papel?
4. Considerando a cromatografia em camada delgada responda:
a) Qual é o estado físico da fase móvel e da fase estacionária na cromatografia em camada delgada ?
b) Qual é o mecanismo de separação da cromatografia em camada delgada?
R: Ambas as fases no estado líquido
R: Partição líquido-líquido
R: Adsorção líquido - sólido
R: Fase móvel – líquida; Fase estacionária - sólida
Quando a placa foi revelada com iodo, foram observadas três manchas. Pode-se afirmar que as manchas obtidas nos
Rf 0,34 e 0,77 correspondem, respectivamente, a quais estruturas? Justifique.
5. Uma mistura contendo os compostos I, II e III, representados abaixo, foi analisada pela técnica de
cromatografia em camada delgada. A mistura foi aplicada em uma placa de sílica sem indicador de fluorescência.
Após eluição com hexano:éter etílico (4:1) e revelação sob luz ultravioleta (254nm), a placa apresentou o seguinte
aspecto:
(I) Apresenta Rt = 0,77
(III) Apresenta Rt = 0,34 (mais polar)
(II) possui uma distribuição de 
elétrons um pouco mais desigual 
devido ao sistema de elétrons π em 
sua estrutura, o que lhe dá uma 
polaridade moderadamente maior 
em comparação com (I) 
Tipos de cromatografia
CROMATOGRAFIA
PLANAR
C. PAPEL C. C. DELGADA
COLUNA
F. M. GASOSA F. M. LÍQUIDA
C. GASOSA CLAE
Partição líquido -
líquido
Adsorção líquido –
sólido
CLASSIFICAÇÃO PELA FASE MÓVEL
CROMATOGRAFIA 
LÍQUIDA
CROMATOGRAFIA 
GASOSA
✓ Considerando o estado físico da fase móvel:
CROMATOGRAFIA EM COLUNA
✓ O fluido que entra na coluna é chamado de ELUENTE e o fluido que emerge ao final da coluna é 
chamado de ELUATO
✓ As colunas são geralmente de de aço inoxidável. 
CROMATOGRAFIA LÍQUIDA
✓ ELUIÇÃO é o processo de passagem de um líquido ou de um gás por uma coluna cromatográfica.
• A fase móvel é arrastada através da coluna apenas pela força da gravidade
• São utilizadas fases estacionárias de partículas menores, sendo necessário o uso de uma bomba de
alta pressão para eluição da fase móvel
➢ CROMATOGRAFIA LÍQUIDA CLÁSSICA
➢ CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)
➢ CROMATOGRAFIA IÔNICA
• Fasesestacionárias mais usadas: sílica e alumina
• A fase estacionária é acondicionada em tubos cilíndricos de vidro, de diâmetro
a variados, os quais possuem uma torneira em sua extremidade inferior
➢ CROMATOGRAFIA LÍQUIDA CLÁSSICA
• É o tipo mais versátil e mais amplamente empregado de cromatografia por eluição
• Nesse método são utilizados altas pressões de bombeamento
• Equipamentos mais complexos 
• Equipamentos mais caros 
➢ CROMATOGRAFIA LÍQUIDA DE ALTA EFICIÊNCIA (CLAE)
✓ High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
INSTRUMENTAÇÃO DE UM CROMATOGRAFO LÍQUIDO
FASE MÓVEL
FASE 
ESTACIONÁRIA
CROMATOGRAMA
CROMATOGRAFO LÍQUIDO
INSTRUMENTAÇÃO DE UM CROMATOGRAFO LÍQUIDO
FASE MÓVEL
THF tetrahidrofurano
✓ As fases móveis utilizadas em HPLC devem:
• Possuir alto grau de pureza 
• Estar livres de oxigênio ou outros gases dissolvidos , sendo filtradas e desgaseificadas antes do
uso.
DESGASEIFICADOR
✓ A bomba deve proporcionar ao sistema vazão contínua sem pulsos com alta reprodutibilidade,
possibilitando a eluição da fase móvel a um fluxo adequado.
✓ (1) A válvula de quatro vias fica alternando entre os canais dos solventes
– Permite a escolha do volume 
– Boa precisão 
✓ (2) A válvula de purga gira no sentido de análise e no sentido de descarte
(1)
(2)
✓ As colunas utilizadas em HPLC são geralmente de aço inoxidável, com diâmetro interno de cerca
de 0,45 cm para separações analíticas
✓ O comprimento é variável, sendo comuns colunas analíticas de 10-25 cm
✓ O detector mais utilizado para separações por cromatografia líquida é o detector de
ultravioleta, sendo também empregados detectores de fluorescência, de índice de refração,
condutividade, eletroquímicos, entre outros.
✓ O registro de dados pode ser feito através de um registrador, um integrador ou um
microcomputador.
Absorção por radiação eletromagnética
• Varia de acordo com as interações das substâncias presentes na amostra com as fases
estacionária e móvel, por isso, cada composto será eliminado da coluna e identificado pelo
detector em um tempo diferente, gerando um pico cromatográfico
COMO SE FAZ A IDENTIFICAÇÃO DE UM COMPOSTO POR CROMATOGRAFIA
LÍQUIDA
✓ Pelo tempo de retenção
• A análise dos diferentes picos nos permite identificar e quantificar as substâncias presentes na 
amostra
✓ Os principais detectores utilizados em cromatografia de fase líquida, são:
• Ultravioleta-Visível
• Fluorescência
• Índice de Refração (RI)
• Detector de Dispersão de Luz por Evaporação
• Espectrometria de Massas (MS)
• Condutividade elétrica
✓ Um bom detector deve possuir as seguintes características:
• Ser preciso e apresentar boa reprodutibilidade.
• Alta sensibilidade, seletividade, linearidade
• Ser pouco sensível às variações de temperatura e fluxo
• Gerar sinal independente da fase móvel utilizada 
• Não contribuir para o alargamento do pico extra-coluna
• Não destruir o analito durante a análise
• Fornecer informações qualitativas sobre o pico detectado
• Gráfico que mostra a resposta do detector em função do tempo de eluição. 
CROMATOGRAMA
• Cada pico corresponde a uma substância diferente, eluída da coluna. 
✓ FORMATO DOS PICOS
a – ideal 
b – mais comum em colunas empacotadas
c – saturação da coluna
d – interações muito fortes com a coluna
e – picos mal resolvidos ou problema na injeção
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