Biotécnicas aplicadas a reprodução animal Cap. 5

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logiasaplicadasàreproduçãodoscarnívoros
domésticos.O interesserecentedecompa-
nhiascomerciais,aliadoaosrecursoshuma-
nosaperfeiçoadosnasuniversidades,possibi-
litahoje,a implantaçãodediversosbancos
desêmencaninocongeladoemdiversospaí-
ses.Essesbancosdesêmenmantêmconstan-
tementematerialgenéticode altovalor, o
qualpodeserutilizadoporpopulaçõesisola-
dasgeograficamente,afimdeseevitaroex-
cessivocruzamentoconsangüíneo,alémda
eliminaçãodedoençassexualmentetransmis-
síveis.Dessemodo,entende-sequeatecnolo-
giadesêmeneainseminaçãoartificialemcães
sãoapenasocomeçodeumanovaeraparaa
reproduçãoeotimizaçãodomaterialgenético
decanídeosdomésticoseselvagens,vistoque
ocãodomésticopresta-secomomodeloexpe-
rimentalparaosdemaiscanídeos.
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95
Capítulo6
Inseminação Artificial em Bubalinos
OtávioMitioOhashi
Introdução
A InseminaçãoArtificial(IA) éumadas
técnicasmaissimplese debaixocustoem-
pregadana áreade reproduçãoanimale a
queapresentamelhorresultadoquandose
pretenderealizaraseleçãoeomelhoramento
genéticodeum rebanhocomoum todo.O
melhoramentogenéticoé realizadoatravés
dousodesêmendereprodutoresdecompro-
vadovalorzootécnicoedasuautilizaçãoem
rebanhoselecionado,atravésdoprocessoda
IA. Apesardesuasimplicidade,a IA requer
umcriteriosoerígidocontroledesuasdife-
rentesetapas,quevaidesdeaseleçãodore-
produtordoadorde sêmen,passandopelo
processamentotecnológicodo sêmen,sele-
çãoecontroledorebanho,chegandoatéao
treinamentodoinseminador.Nestecapítulo,
seráabordadoo empregodatécnicada IA
naespéciebubalina,aqualtemdemonstrado
serviáveledefundamentalimportânciapara
a melhoriadaprodutividadedorebanho.
Morfofisiologia do SistemaGenital
do Búfalo
O sistemagenitaldobúfaloémorfologi-
camentesemelhanteaodobovino,compe-
quenasdiferençasqueserãodestacadasa
seguir.A bolsaescrotalémenorenãoapre-
sentaa constriçãona regiãodo colocomo
nosbovinos(Battacharya,1974).Ostestícu-
lostambémsãomenoresquedosbovinose
o seucrescimentoapresentaaltacorrelação
com o desenvolvimentocorporal(Ohashi,
1993a;Chacur,1999;ValeetaI.,2001).A
tabela6.1apresentadadossobreabiometria
testicularembubalinosdediferentesidades.
A vesículaseminalémenorqueadobovino,
cujocomprimentoe largurasão5,33+ 2,2
x 1,9+ 0,9cm,respectivamente.As lobula-
çõessãotambémmenospronunciadasemais
finasquenosbovinos(Valeetal.,1981,Oha-
shietaI., 1988).
A puberdadeno bubalino,caracterizada
histologicamentepeloiníciodaatividadees-
permatogênicadostestículos,começaapartir
de 14-15meses,comosanimaisatingindoa
maturidadesexualaoredorde24-30meses
deidade(Ohashi,1993a),sendoqueocom-
pletodesenvolvimentoreprodutivoéatingido
somenteaos4-5anosdeidade.O desenvolvi-
mentoreprodutivodobubalinopareceserbas-
tantelento,quandocomparadoaobovinoBos
taurus,entretanto,comumaadequadaseleção
genética,aliadoaumbommanejoealimenta-
ção,épossívelobteranimaismaisprecoces,
97
umavezquetêmsidoobservadoshistologi-
camenteanimaiscomatividadeespermatogê-
nicacomidadesde 8-9 meses(Devaraj&
Janakiraman,1986;Ohashietal., 1988).
Consideraçõessobre o processamento
tecnológico do sêmen
O processamentotecnológicodo sêmen
temcomoprincipalobjetivoaumentaronú-
merodefêmeasfertilizadascom um único
ejaculado,comotambémconservaracapaci-
dadefertilizantedo espermatozóide,quer
sejaporumperíododeterminado,atravésde
usodosêmenrefrigerado,quersejaporum
períodoindeterminado,atravésdautilização
datécnicadecongelaçãodosêmen.A conge-
laçãodosêmenestábemestabelecidanaes-
péciebovinae emfasedeaperfeiçoamento
emoutrasespéciesanimais,comoporexem-
plo,nosbubalinos,ovinos,caprinos,suínos
e eqüinos.
A criopreservaçãodo sêmentomouum
impulsomuitograndenadécadade40,após
adescobertaporPOLGE, dafunçãocriopro-
tetoradoglicerol(Polge,1985),oquepermi-
tiuacongelação,comsucesso,dosêmenbo-
vino.Atualmenteinúmerasoutrascélulas,e
mesmotecidosdoorganismoanimal,sãotam-
bémpreservadaspeloprocessodecongelação,
tendocomoprincipalagentecriogênicoo ni-
trogêniolíquido,ondeas célulasoutecidos
congeladospodemsermantidosportempoin-
determinado,osquaisapósadescongelação,
recuperamtodasassuasfunçõesfisiológicas.
Duranteo processodecongelaçãoe de
descongelaçãodo sêmen,cercade 10-50%
dosespermatozóidesde um ejaculadonão
resistemaoprocessoemorrem,oquedepen-
derádeváriosfatorestaiscomo,qualidade
doejaculado,métododecongelação(curva
decongelação),tipodediluidor,tipodeen-
vasamento(mini-palheta,palhetamédia,am-
pola,pellets)emétododedescongelação.
A mortedo espermatozóideduranteo
processodecongelaçãoocorrecomoconse-
qüênciadasmudançasfísico-químicasque
seprocessamno meiodiluidore principal-
mentenopróprioespermatozóide,atravésde
danosprovocadosemsuasultra-estruturas
queinviabilizamasuasobrevivência.Odesa-
fiocelular,duranteacongelaçãoedesconge-
laçãonãoéacapacidadedacéluladesupor-
tara temperaturamuitobaixa,massimade
atravessarumadasfasescríticasdoprocesso
quevaide-15a -60°C,noqualacélulatem
quepassarduasvezes,ou seja,durantea
congelaçãoedescongelação(Mazur,1985).
Ascélulasnormalmenteresistemaoabài-
xamentoda temperatura,entretanto,não
resistemàformaçãodecristaisdegelo,uma
vezqueissoimplicanaretiradadeáguado
sistema,levandoao desequilíbrioosmótico
comconseqüentedesidrataçãocelular(Ma-
zur, 1985;Holt,2000).Essefatoocorreprin-
cipalmentequandoo processode congela-
çãoé lento.
Os eventosfísicosqueocorremnacélula
dependemda velocidadede congelação.
Tabelo6.1. Dadosbiométricosdotestículo(médio)debubolinosemd~erentesidades(CE:circunferênciaescratal;G: comprimentotesticular;LT:
larguratesticular).
98
Idadesemmeses
PorômefTosRecém-nascido2-5 6.8 9-11 13-14 16 18.24 >36
CE(cm) 8,8:!:0,5 12,6:t.0,714,1:!:1,1 19,3:!:2,1 23,7:!:1,0 24,4:!:1,1 28,2:!:1,6 32,7:t.2,7
a (cm) - 4,4:!:0,5 4,9:!:0,4 6,7:!:0,9 7,9:!:0,6 8,7:!:0,4 8,7:!:1,1 12,2:!:2,2
LT(em) - 2,3:!:0,3 2,8:!:0,3 4,2:!:0,6 5,2:!:0,3 6,2:!:0,5 6,4:!:0,3 7,1:!:0,8
Fonte:Ohoshi(19930)
Quandoo processodecongelaçãoé muito
lento,ocorreacongelaçãodaáguaextracelu-
larcomaconseqüenteconcentraçãodesolu-
to,colocandoacélulamomentaneamenteem
ummeiohipertônico,fazendocomqueacé-
lulapercaáguarapidamente,oquelevaade-
sidrataçãocelulareaoaumentonaconcen-
traçãodesolutointracelular,promovendoa
mortecelularpordesidratação.Poroutrola-
do,quandoacélulaécongeladarapidamen-
te,nãoháperdadeágua,promovendocom
issoaformaçãodecristaisdegelointracelu-
lar,causando,conseqüentemente,lesõesnas
estruturascelulares,fatoquecomprometea
funçãocelular(Mazur,1985).
Portanto,énecessáriaumacurvadecon-
gelaçãoqueeviteessesdoisextremos,ouse-
ja,nãomuitolentaenemmuitorápida,pre-
venindo,dessemodo,queumgrandenúme-
ro decélulassejamafetadasduranteo pro-
cesso.Paraacongelaçãodesêmenbovinoe
bubalino,estacurvajá estábemdefinidae
consistebasicamenteembaixaratemperatu-
radosêmenaumavelocidadede0,3-0,5°C/
minutoatéo sêmenatingir4°C,oquesecon-
seguedeixandoo sêmen,quefoi diluídoa
32°C,ecolocá-loàumatemperaturade4°C,
durante3-4 horas,tempoestedenominado
de"tempodeequilíbrio",ondeosêmendiluí-
dolevacercade90minutosparaatingiratem-
peraturade4°C,permanecendonessatempe-
raturaotemporestante.Posteriormente,osê-
menétransferidoparaovapordenitrogênio
líquidoà umatemperaturaaproximadade
150°Cnegativospor 15minutoselogoapós
mergulhadoemnitrogêniolíquido,ondea
temperaturaéde196°Cabaixodezero,con-
cluindo-seo processodecongelação.
Processamentotecnológicodo
sêmenbubalino
A IAembubalinos,apesardeteriniciado
nadécadade50(Bhattacharya& Srivastava,
1955),aindanasdécadasde60-70,amesma
suscitavadiscussõesquantoasuaviabilidade
técnica,emfunçãodeváriosfatores,taisco-
mo,dificuldadesnacongelaçãodosêmendo
reprodutorbubalino,nadetecçãovisualdo
estronabúfalaenadeterminaçãodomelhor
momentopara a inseminaçãoda búfala.
Hoje, essesobstáculosestãosendosupera-
dos,emfunçãodaadequaçãodomanejona
detecçãodoestroenadeterminaçãodomo-
mentodeinseminaràespéciebubalina.Ade-
quando-seessemanejoreprodutivoàespécie
emquestão,o usoda IA embubalinostem
demonstradosertãoeficientequantonosbo-
vinos,nãohavendomaisdúvidaquantoasua
viabilidadetécnica.Entretanto,aindahámui-
to paraseraprimorado,especialmentecom
relaçãoaomelhoramentogenéticodo reba-
nho,ondeum criteriosoprogramadeveria
ser implementadoparaidentificaranimais
superioresdo pontode vistade produção
animal,paraqueosmesmospossamserutili-
zadoscom segurançae confiabilidadeem
programasdeIA, transferênciadeembriões
eoutrasbiotécnicasquevisemoaumentoda
produtividadedo rebanho.
No Brasil,os primeirostrabalhossobre
processamentotecnológicodosêmeneIA em
bubalinosforamrealizadospelaequipedo
Prof.Will\amGomesVale,da Universidade
Federaldo Pará(UFPA), no finaldadécada
de70einíciodadécadade80.O referidopes-
quisadorutilizouo diluidorabasedetes-tris
paracongelarosêmenbubalino,obtendoex-
celenteresultadonamotilidadepós-congela-
ção,contribuindoemmuitoparasolucionaro
problemadacongelaçãodesêmenbubalino,
o qualnãoapresentavabonsresultadosapós
oprocessodecongelação.Alémdisso,insemi-
nouasprimeirasbúfalasno Brasilem1982,
obtendoquatrobezerrosde1Ovacasinsemi-
nadasemumafazendada IlhadoMarajó.
Paraoprocessamentotecnológicodosê-
mensãonecessáriosconhecimentosbásicos
sobreas suascaracterísticas,umavezque,
99
somentedessemodopodeserobtidoo po-
tencialmáximodosprocessosdecongelação
edeIA. É importanteressaltarqueparase
chegara esseestágiodoprocessamento,é
necessárioqueo reprodutortenhapassado
porumcriteriosoerigorosoexameclínico-
andrológicoeavaliaçãodassuasqualidades
zootécnica.
O objetivodessesexameséselecionarso-
mentedoadoresdesêmenisentosdeproble-
masreprodutivos,especialmenteosdecunho
hereditário,ecomcaracterísticadeprodução
comprovada,aqualdeveserobtidaatravés
dotestedeprogênie,docontráriocorre-se
oriscodedisseminar-secaracteresindesejá-
veisequepossamcomprometeraprodutivi-
dadedorebanho.
Colheitadesêmen
Umacolheitadesêmenrealizadaadequa-
damentee respeitandoascaracterísticasfi-
siológicasdaespécie,éoprimeiropassopara
seobterosucessoesperadonoseuprocessa-
mentotecnológico.Embubalinos,acolheita
desêmendeveserrealizadapreferencialmen-
teatravésdométododavaginaartificial.En-
tretanto,outrosmétodostambémtêmsido
empregados,taiscomo,a eletro-ejaculação
(ondeobtém-sesucessosomenteemanimais
jovens)eamassagemdasampolasdosdue-
tosdeferentes.Com referênciaa essesdois
últimosmétodostêmsidorelatadosresulta-
dospoucossatisfatórios,ondea qualidade
dosêmenéinvariavelmenteinferiorquando
comparadoao obtidopelavaginaartificial.
O bubalinoadultoreageviolentamente
duranteatentativadacolheitadesêmenpelo
métododa eletro-ejaculação,umavezque
essaespéciemostra-sebastantesensívelao
estímuloelétrico.Poressemotivonãoéreco-
mendadoousodessemétodoparaacolheita
desêmenembubalino,especialmente,para
animaisadultos,acimadequatroanos.Além
disso,osêmencolhidoatravésdaeletro-eja-
100
culaçãoapresentamaiorgraudecontamina-
çãoporbactériasedecélulasdedescamação
do epitélioprepucial,emfunçãodamaioria
dosanimaisejacularemdentrodabainhapre-
pucial.O sêmencolhidoatravésdesseméto-
do tambémapresentamenorconcentração
espermáticaem funçãodo maiorestímulo
sobreasglândulassexuaisacessórias,levan-
do-asasecretarmaiorquantidadedeplasma
seminal,cujoestímulopodeatingirtambém
abexiga,podendohaveraliberaçãodeurina,
aqualserámisturadaaosêmen,comprome-
tendoasuaqualidade.Finalmente,essemé-
todonãopermiteavaliarumadasmaisim-
portantescaracterísticasde um reprodutor
queé a libidosexual.
A massagemdasampolasdosduetosde-
ferenteséum dosmétodosmaissimplesde
colheitadesêmenembovinos,entretanto,a
obtençãodesêmenatravésdestemétodoem
búfalosémaisdifícilerequerprática,sendo
quemuitosanimaisnão respondema esse
métododecolheita.O sêmencolhidoatravés
damassagemdasampolasdosduetosdefe-
rentesé geralmentedebaixaqualidade,de
baixaconcentraçãoespermáticae de alta
contaminaçãoemdecorrênciadoanimaleja-
cular dentro da bainha prepucial (Vale,
1994),nãodevendo,portanto,seraproveita-
do parao processodacongelaçãoparauso
emprogramasdeIA.
A vaginaartificialéométododeexcelên-
cia paraa colheitade sêmende bubalinos,
porseromaispróximodoprocessodamon-
tanaturale segundoSansoneetaI. (2000)
por seresteanimalumdosmaisfáceisaser
treinadoparaa colheitade sêmenpor este
método.A estruturadavaginaartificial,àse-
melhançadausadaembovino,éconstituída
basicamenteporumtuborígidocomválvula
deduplaentrada(areágua),cilindroflexível
delátex("camisa"),conecoletordelátexe
tubocoletorgraduado.Parabubalinos,ava-
ginaartificialdevesermaiscurta,comcerca
de25-30cmparaanimaisjovense de 30-
35cmparaanimaisadultosacimadequatro
anos,emfunçãodomenortamanhodopênis
bubalinoemrelaçãoaobovino.Nãoéneces-
sáriaalubrificaçãodavaginaartificial,umavezquealubrificaçãonaturaldopênisésufi-
cienteparapermitirapenetraçãodomesmo.
Porém,um dosaspectosimportantesa ser
observadoé a temperatura,quedeveestar
entre42-44°C,umavezque,muitosanimais
montam,porémnãoejaculamquandoatem-
peraturadavaginaartificialestáabaixo,ou
sofremirritaçõesdopênisquandoamesma
estáacimadesseparâmetro.Estefatoacarre-
taarecusadosanimaisnaspróximascolhei-
tasdesêmen,ondemuitasvezesoreprodutor
masturba-sequandoapresentadoaomane-
quim,semrealizaramonta,havendomuitas
vezesa necessidadede recondicionamento
dosmesmos.Deve-seusarvaginaartificial
deboaqualidade,especialmentecomrelação
aocilindroe ao conede látex,quemuitas
vezes,quandodemáqualidade,apresentam-
setóxicasparaos espermatozóides.
Em regiõesde climaquentee úmidoo
comportamentosexualdobúfalomanifesta-
seprincipalmenteduranteashorasamenas
dodia.NaregiãonortedoBrasil,ondepredo-
minaoclimatropicalúmido,comaltatempe-
raturaambientalduranteodia,temsidoobser-
vado,queosbúfalosemregimedecolheita
desêmenemCentraldeIA apresentamme-
lhordesempenhosexuallogoapóso pôrdo
soldoquenoiníciodamanhã(OhashietaI.,
1988).Nohorárionoturno,muitosanimais
"montam"empoucossegundosapósaapro-
ximaçãodomanequim.Entretanto,paraum
bomdesempenhonacolheitadesêmencom
avaginaartificialénecessárioumtreinamen-
tooucondicionamentoadequadodorepro-
dutorparaacolheitacomoreferidométodo.
Os animaisselecionadoscomodoadoresde
sêmen,devemserpreferencialmentejovens,
entredois e quatroanos,os quaistambém
devemsercalmosedóceis.Duranteo treina-
mentodosanimais,quandonecessário,de-
vemsertratadoscomfirmeza,masnuncade-
vemrecebermaustratos,comopancadase
chicotadas.
Osanimaisadultos,acimadequatroanose
quetenhamsidoutilizadoscomoreprodutor
acampo,sãomaisdifíceisdesecondiciona-
remacolheitadesêmencomousodavagina
artificial,entretanto,compaciência,obtém-se
comalgunsanimais,bonsresultadosnocon-
dicionamentoenacolheitadesêmen.Deve-
seevitarcolocarbúfalosadultospróximosuns
dosoutros,poisapesardessesanimaisserem
bastantedóceis,elesnãopermitemapresença
deumoutromachonamesmaárea,podendo
ocorrerbrigas,oquemuitasvezesculminaem
sériaslesõesnosanimais,taiscomo,cortespro-
fundosnapele,quebradechifresemuitasvezes
depernas,especialmenteasdianteiras.
A saladecolheitadesêmendeveserlim-
pa,localizadaemlocaltranqüilo,compouca
genteaoredor,bemarejadaedepreferência
compisoemborrachadonaáreadecolheita
paraevitarqueo animalescorreguedurante
o salto.O manequimdeveserdepreferência
umafêmeadeboaestruturacorporal.Entre-
tanto,emcasodereprodutoresjovens,pode
seroutromachojovem,entretanto,emani-
maisacimadequatroanosequejá serviram
comoreprodutornorebanho,autilizaçãode
um manequimmachojovemtemresultado
emfracassonacolheita,emfunçãodareação
violentapor partedo reprodutorcontrao
manequim(Ohashi,1993b),dando-sepor-
tanto,preferênciaao manequimfêmea.
Avaliaçãodo sêmen
Esteéumdosimportantesaspectosaser
observadonoprocessamentotecnológicodo
sêmen,umavezqueatravésdeumacriterio-
saavaliaçãodosêmenobtém-sedadosquan-
toa qualidadedoejaculado,bemcomo,so-
breasaúdereprodutivadodoador.Na ava-
101
liaçãodosêmenbubalinoobservam-sevários
parâmetroscomoo volume,a cor (exames
macroscópicos),o turbilhonamento,amotili-
dade,o vigor,a concentraçãoe a patologia
espermática(examesmicroscópicos),sendo
que,nenhumtesteisoladamentepodepredi-
zercomsegurançasobreaqualidadeeaca-
pacidadede fecundaçãodo sêmen.É bom
lembrarquetaisexamesdevemserrealizados
com o ejaculadomantidoemtemperatura
constantede38°C,tendoemvistaqueo es-
permatozóidedobúfaloé bastantesensível
à variaçãoda temperatura(Raizadaet aI.,
1988;Ohashi,1993b;SansoneetaI.,2000).
A nãoobservaçãodestedetalhefazcomque
muitasvezeso sêmenqueaparentaterbaixa
motilidadeantesda diluição,melhoreapós
a suadiluiçãocomo meiodecongelação.
Parapreservaraqualidadedosêmenpara
acongelação,é importantequelogoapósa
colheitadaamostraparaaavaliaçãoedeter-
minaçãodaconcentraçãoespermáticadilua-
seo ejaculadoem 1:1 com o diluidor,en-
quantoseprocessamasanálisesdoejacula-
doeadeterminaçãodaconcentração,visan-
do a determinaçãoda taxadediluição,ou
seja,ovolumedo diluidora seracrescenta-
do aoejaculado.
O volumedoejaculadovariacomaidade,
coma freqüênciae o númerode colheitas
realizadasemumdeterminadoperíodo.Em
búfalojovem(2-4anos),ovolumeeacon-
centraçãodoejaculadosãomenoresquedos
animaisadultosemfunçãodomenortama-
nho dos testículose dasglândulassexuais
acessórias.O volumedo sêmenobtidonas
colheitascomvaginaartificial,utilizandopre-
viamentea falsamonta,estáemtornode2-
3 mlparaaprimeiraamostraede0,5-1ml
paraasegunda,comumaconcentraçãoes-
permáticade cerca de 800.000/mm3e
400.000/mm3,respectivamente(Ohashi,
1993b).Chacur(1999)observouembúfalos
comtrêsanosdeidadequeovolumeeacon-
102
centraçãodosêmenforamde2,5+0,2mle
467.000+32.000espermatozóides/mm3,
respectivamente.Emanimaisacimadequa-
tro anos,o volumedo 1° ejaculadogiraem
tornode4-6mledo2°de3-4ml,comcon-
centraçãoaoredorde 1.000.000/mm3ede
750.000/mm3,respectivamente(Ohashi,1988;
Ohashi,1993b;Vale,1994).
A cordosêmenédependentedesuacon-
centraçãoespermática,podendovariarde
brancoleitoso/brancomarmóreo,quandoo
mesmoapresentainvariavelmenteumaalta
concentração,atéacoloraçãobrancatranslú-
cido,quandoo mesmoapresentabaixacon-
centraçãoespermática.A coloraçãoróseo-
avermelhadoindicacontaminaçãopor san-
gue,quepodeseroriundodetraumapeniano
provocadodurantea colheitado sêmen.
O turbilhonamentoé definidocomo o
movimentoemmassadosespermatozóides,
o queprovocaa formaçãode verdadeiras
"ondas"deespermatozóidesequepodeser
observadoemsêmendeanimaisqueapre-
sentamaltaconcentraçãoespermáticacomo
obovino,bubalino,caprinoeovinoeparaisso
bastacolocarumapequenagotadesêmenem
umalâminaaquecidaeobservarcomobjeti-
vade10x.Essacaracterísticadoejaculadoé
avaliadonumaescalaquevaidezeroa cin-
co,sendozeroparao ejaculadocomausên-
ciadeondasecincoquandoháa presença
demuitasondasespermáticas,movimentan-
do-serapidamentenocampomicroscópico.
Essaavaliaçãoé subjetivae somentecoma
práticaconstanteseconsegueavaliarcomse-
gurançaesseparâmetro,especialmentepara
asescalasintermediáriasde 1a 4.
A motilidadeespermáticaindicaapercen-
tagemdeespermatozóidescommovimentos
progressivos(parafrente),emcujaavaliação
deve-seexcluirosespermatozóidescommo-
vimentoscircularese vibratórios.Avalia-se
amotilidadecomamesmagotaquefoiutili-
zadaparaaobservaçãodoturbilhonamento,
sendoque agoracoloca-seuma lamínula
aquecidasobreagotaeexamina-secomobje-
tivade40x,depreferênciaatravésdemicros-
cópioequipadocomcontrastedefase.
O vigorindicaaforçacomqueosesper-
matozóidesselocomovematravésdocampo
microscópicoeéavaliadocomamesmalâ-
minacomqueseavaliaa motilidadee com
omesmoaumento.Suaavaliaçãoédadanu-
maescalaquevaidezeroacinco,sendozero
parao ejaculadoqueapresentaespermato-
zóidescommovimentaçãofracaouausente
ecincoparaejaculadosqueapresentames-
permatozóidescom forte movimentação
atravésdo campomicroscópico.
No búfalo,todasessascaracterísticasdes-
critasacima(turbilhonamento,motilidadee
vigor)devemseravaliadasrapidamentepois
amovimentaçãodosespermatozóidesdobu-
balinodecairapidamente,especialmentese
a lâminae lamínulaestiveremfriasdurante
osexamesmicroscópicos.Porisso,éfunda-
mentalqueessascaracterísticasdo sêmen
bubalinosejamavaliadasem microscópio
adaptadocom platinaaquecedora,a qual
deveestarcomtemperaturaentre38e39°C.
Alémdessascaracterísticas,examesadi-
cionaispodemserrealizados,taiscomoexa-
medevivos/mortos,atravésdesimplescolo-
raçãovitalcomeosinacitratada(1gdeeosina
azuladaem100ml desoluçãodecitratode
sódioà2,9%)oucomoutrotipodecorante,
bemcomo,a análisedo espermograma,o
qualdevecompreenderoexamedosdefeitos
demorfologia(coloraçãodeWilliams)edos
defeitosestruturaisdos espermatozoides,
atravésdamicroscopiadecontrastedefase.
As anormalidadesespermáticasmais fre-
qüentesobservadassãoasanomaliasdecau-
daseguidadasanomaliasdecabeçadoses-
permatozoides.Outrasalteraçõesmuitofre-qüentesobservadasembúfalosdo rebanho
nacionalsãoespermatozóidescomimplanta-
çãoabaxial(Ohashi,1988),sendoqueseu
significadoparaa fertilidadenãoestádevi-
damenteesclarecido,aqualtambémtemsido
descritaemoutrospaísesemanimaisinfér-
teis,assimcomo,emanimaiscomafertilida-
denormal(Kodagalietai., 1971).
Procedimentoparaa coloraçãovital
Colocarduasgotasdasoluçãodeeosina
citratadaemumalâminaelogoapósadicionar
umagotadesêmen,homogeneizareesperar
30segundoseimediatamentefazeresfregaço
esecaremchama.Deveráserrealizadaacon-
tagemde200espermatozóides,imediatamen-
teapósacoloração,comobjetivadeimersão,
sendoo resultadodadoempercentagemde
espermatozóidesvivos.Os espermatozóides
mortoscoram-sederóseo-avermelhadoeos
espermatozóidesvivos,por apresentarema
suamembranacitoplasmáticanãopermeável
ao corante,aparecemincolor.É importante
queasoluçãodeeosinaestejanamesmatem-
peraturadosêmenequeacontagemsejafeita
imediatamenteapósacoloração,poiscomo
tempotodosos espermatozóidesvãoabsor-
vendoa eosinae ficamróseos.
Diluidores
Entende-sepordiluidores,soluçõesque
têmporobjetivoaumentarovolumedoeja-
culado,potencializandoasuacapacidadede
fecundaçãoepreservandoacapacidadefe-
cundantedoespermatozóide,protegendo-os
duranteoprocessodecongelação.Oscom-
ponentesbásicosdeumdiluidorsãoosse-
guintes:água,substânciatampão,compo-
nentesorgânicos(gemadeovo),crioproteto-
res(sêmencongelado),energéticos(frutose)
eantibióticos.SegundoMiesFilho(1987),
umbomdiluidordevesatisfazeràsseguin-
tescondições:
- ausênciadetoxidezparaosesperma-
tozóides.
- terpressãoosmóticaigualàdosêmen
- apresentarpH favorávela sobrevivên-
ciadosespermatozóides
103
- serdebaixocustoedefácilpreparo
- nãoproduzirmetabólitosnocivosaos
espermatozóides
- nãomascararoexamemicroscópicodo
sêmendiluído
Antesdesefazeradiluição,éimportante
observarseoejaculadoeo diluidorestãona
mesmatemperatura.No casodebubalinos,
utiliza-seumbanho-mariacomatemperatu-
ra a 32°C,na qualdevemser colocadoso
sêmeneo diluidorparaqueos mesmosal-
cancema mesmatemperatura.
Paradeterminaçãodataxadediluição,é
necessárioquesetenhaalgunsdadosfunda-
mentais,taiscomo:aconcentraçãoespermá-
ticarelativa,ovolumedo ejaculado,tipode
envasamento(palhetamédia= 0,5mI,pa-
lhetafinaoumini-tubo= 0,25ml) ea con-
centraçãoespermáticapor dose (normal-
mente40 milhões/dose).O primeiropasso
édeterminara concentraçãototaldoejacu-
lado,o quesefazapartirdo conhecimento
daconcentraçãorelativa,aqualdevesermul-
tiplicadapelovolumedoejaculado(Fórmula
1).Logoemseguida,determina-seonúmero
total de espermatozóidescom motilidade
progressiva,aqualobtém-seapartirdamoti-
lidadedosêmen,atravésdeumaregradetrês
simples(Fórmula2).
A motilidadeprogressivaé o númerode
espermatozóidesque deslocam-separa a
frente,o queéumindicativodequeosmes-
mosestãoaptosparaselocomoverematéo
sítiodefecundação(ampoladatubauterina).
A partirdonúmerodeespermatozóidescom
motilidadeprogressiva,determina-seo nú-
merodedosesquesepodeobterdosêmen,
oqueseconseguedividindo-seaconcentra-
çãototaldoejaculadopelonúmerodeesper-
matozóide/dose(Fórmula3).
O volumedodiluidoraseracrescentado
aoejaculadoédeterminadomultiplicando-se
onúmerodedosespelovolumedoenvase,di-
minuídodovolumedoejaculado(Fórmula4).
104
CT =C xVoI.(Fórmula1),
ondeCT =concentraçãototal;C =concentra-
çãorelativa;VoI. =volumedoejaculado.
MotilidadeProgressiva=(CT x Motilidade
espermática)/ 100(Fórmula2)
N° dedoses= N°deespermatozóidescom
motilidadeprogressiva/N°deespermato-
zóidepordose(Fórmula3)
Volumedodiluidor=(N°dedosesxVoI.do
envase)- VoI.doejaculado(Fórmula4)
Exemplo:
- Volumedo ejaculado=5 ml
- Motilidadeespermática=70%
- Concentraçãorelativa=1.000.000es-
permatozóides/mm3=1.000.000.000
espermatozóideslml
- Espermatozóides/dose=40.000.000
- Tipodeenvase=palhetafina(0,25mI)
Executando-seasfórmulasdescritasaci-
materemos:
-CT =1.000.000.000espermatozóides1
rnlx 5rnl=5bilhõesdeespermatozóides
-Motilidadeprogressiva=(CTxMotilida-
deespermática)1100=(5.000.000.000
x 70) 1 100 =3.500.000.000esperma-
tozóides
- No.Dedose=3.500.000.000/40.000.000
= 87,5dosesdesêmen
-Volumedodiluidor= (87,5x0,25rnl)
- 5rnl= 16,8mIdodiluidor.
Portantonoexemploacima,ovolumedo
diluidora seracrescentadoaosêmené de
16,8mldediluidor.
Determinado-seonúmerodedoseeovo-
lumedediluidoraseracrescentadoaoejacu-
lado,procede-sea diluiçãoa qualdeveser
seguidodemovimentaçãocircularelentado
frascocontendoo sêmendiluídoparaque
ocorraahomogeneizaçãoadequada,evitan-
do-seaformaçãodebolhasdear.
Apesardosêmendebúfalotersidocon-
geladonadécadade50,aindahojeexiste
umapequenacontrovérsiasobreo melhor
diluidoraserutilizado.Inúmerosdiluidores
têmsidotestados,todosbaseadosnasfórmu-
lasutilizadasparabovinos,taiscomo,ocitra-
to-gema,lactose,leitedesnatado,sorodelei-
tedebúfalaetris-gema.Maisrecentemente,
doisoutrosdiluidores,desenvolvidosespeci-
ficamenteparao bubalinos,foramtestados,
sendoum à basede Tes-Tris (Valeet aI.,
1990)e o outro à basede glicina (Oba et
ai.,1994),sendooglicerolà7%,ocrioprote-
torcomumatodosos diluidores.
Temsidorelatadoquesêmendebúfalo
congelado,utilizando-sediluidoresabasede
citrato-gemaouleitedesnatado,apresentaram
motilidadepós-congelaçãoemtornode20%,
e comlactose,a motilidadepós-congelação
ficouem30%(Ohashi,1993b),sendoque os
melhoresresultadosforamobtidoscomdilui-
doresàbasedetrisetes-tris(fórmulasabai-
xo),commotilidadepós-congelaçãovariando
de 50-60%nos doisdiluidores.Entretanto,
quandoo sêmen,diluídocom diluidoresà
basedecitrato,leitedesnatadooulactose,foi
submetidoaotestedetermoresistência(TTR)
a39°C,amotilidadeespermáticajáestavaau-
senteapós30minutosdoiníciodoteste,apre-
sentandosomenteespermatozoidescommo-
vimentovibratórioA motilidadeespermática
do sêmencongeladocom Tris cessoucom
umahoraemeiaapóso iníciodoteste.O me-
lhorresultadofoi obtidocomdiluidoràbase
deTes-Tris,noqualamotilidadeespermática
apóscincohorasdo iníciodoTTR aindaera
aoredorde20%(Ohashi,1993b).
Emtestedecampo,inseminando430bú-
falas,BarnabéetaI. (1995)observaramque
o sêmencongeladocomTes-Trisapresentou
um índicedegestaçãode60,0%,enquanto
queosêmencongeladocomTriso índicefoi
de49,26%,ouseja,odiluidoràbasedeTes-
Trisapresentouumíndicedegestação10,74%
superior(p<0,05)aosêmencongeladocom
Tris,demonstrandodestemodoqueo dilui-
doràbasedeTes-Triséumbomdiluidorpara
sêmendebubalino.
o diluidoràbasedeglicinatemapresen-
tadobonsresultadosemtestedelaboratório
(ObaetaI., 1994;Chacur,1996),havendo
a necessidadedotestedecampo.
Após fazero diluidor,deve-semediro
pH, oqualdeveestaremtornodaneutralida-
de(6,8-7,2),casonecessário,corrigi-Iocom
solução1N dehidróxidodesódio,quando
estivercompH ligeiramenteácido,ou com
solução1N deácidoclorídrico,emcasode
pH ligeiramentealcalino.
É importantelembrarqueoscomponen-
tesqueentramnacomposiçãodomeiodilui-
dor devemserdequalidadecomprovada.A
águadeveserdestiladaedeionizadaou-bi-
destilada,nuncausaráguasomentedestila-
da.O ovoaserusadoparaobtençãodagema
deveserdegranjacomsanidadecomprova-
da,livrededoençastaiscomo,salmonelose
etuberculoseaviária,asquaispodemcausar
problemasno rebanhoque utilizar sêmen
contaminadocomasbactériasresponsáveis
pelasreferidasdoenças.
Fórmulodo diluidoro basedeTes-Tris(Tes= tris-hidroxi1Jmino-etono)
Sol.Stack. Sol.Leitedesnatadoo11%
Tes 24,5g SoluçãoFinol
Tris 5,3g SoluçãodeTes-Tris:..36,5ml
D-frutose 1,08g SoluçãodeLeite: 36,Sml
Penicilina 500.000UI Glicerol: 7ml
Estreptomicino500mg Gemodeovo: 20ml
Águo(bi-destilodo)...500ml *Filtrarameiodiluidorempapelfiltro.
Fonte:Gunzel,1979.
Fórmulodo diluidoro baseTris(Tris-hidroxi1Jmino-metono)
Sal.Stock. I Soluçãofinal
Tris 30.4812g
Ác.Cítrico 17,Og
D-frutose 12.5g
Estreptomicino850mg
Penicilina 850.000UI
Água(bi-destilodo)850ml
Fonte:Vosonth(1979)
Sol.Tris 740ml
Glicerol 60ml
Gemadeovo... 200 ml
105
Envasamento
Apósadiluição,faz-seoenvasamentodosêmen,dividindo-oemdosesparaquesejam
armazenadasnobotijão(container)denitro-
gêniolíquido.O mododeenvasamentodo
sêmensofreumodificaçõeseaperfeiçoamen-
tos.Em bovinos,no iníciodo empregoda
técnicadaIA comsêmencongelado,asdoses
eramcongeladasnaformadepellet,molda-
dosempequenosburacosfeitosnoblocode
geloseco(-79°C).No entanto,porquestões
sanitárias,dificuldadeno manuseio,no ar-
mazenamento,descongelaçãoentreoutras,
estatécnicafoi substituídapelométodode
congelaçãoemampoladevidro,comcapaci-
dadeparacercade1mI.Esteúltimotambém
pordificuldadedemanejo,dearmazenamen-
toedescongelação(emáguacomgelo),foi
substituídopelapalhetafrancesa(média)
comcapacidadepara0,5mI,semosproble-
masdos métodosde envaseanteriores.A
vantagemdacongelaçãoempalhetaséque
háumaperdamenordeespermatozóidedu-
ranteoprocessodecongelaçãoedesconge-
lação(cercade15-20%),emfunçãodopro-
cessodecongelaçãosermaisuniformepor
todaa superfíciedapalheta,enquantoque
coma ampola,a perdaespermáticaerade
cercade50% (MiesFilho, 1987).
Atualmenteo melhormétododeenvasa-
mentoéo queutilizaapalhetafrancesafina
de0,25ml,cujaperdaespermáticadurante
o processode congelaçãoe descongelação
do sêmené de somentecercade 10-15%
(Mies Filho, 1987).Além disso,a referida
palhetaapresentamaiorfacilidadedearma-
zenamentodo queapalhetamédiaemfun-
çãodo menordiâmetro.Na Alemanha,foi
desenvolvidaa técnicado mini-tubo(capa-
cidadede0,25ml)cujotamanhocorrespon-
deàmetadedapalhetamédia.Portanto,para
o envasamentodo sêmenbubalino,podem
serusadosapalhetamédia,afmaeominitub.
106
Congelaçãodo sêmen
Apósoenvasamentotransfere-seosêmen
paraumacâmarafria,reguladapara4°Cpa-
raqueosêmenabaixeasuatemperaturagra-
dualmente,o qualdevepermanecernesse
ambientedurante3-4 horas,períododeno-
minadodetempodeequilíbrio.Decorridoo
tempodeequilíbrio,prossegue-senoproces-
so decongelação,colocando-seaspalhetas
ouminitubcomsêmennovapordonitrogê-
nio líquido,o queérealizadocomo auxílio
deumaplataformafeitadetela,localizadaa
aproximadamente4,0a5,0cmacimadoní-
veldonitrogêniolíquido(vapordo nitrogê-
niolíquido),ondeatemperaturaestáemtor-
no de 150°Cnegativos.O sêmendeveser
mantidono referidovaporpor 15minutos
e,apósdecorridoessetempo,sermergulha-
dononitrogêniolíquido,completandoopro-
cessodecongelaçãodo sêmen.
Avaliaçãodo sêmencongelado
A avaliaçãodosêmenpós-congelaçãoé
umadasetapasmaisimportantesdoproces-
samentotecnológicodo sêmenevisaobter
subsídiosqueasseguremqueo processode
congelaçãodosêmenfoiadequadoemante-
vea qualidadeea integridadeespermática.
A descongelaçãodosêmendeveserrealizada
emáguaà38°C, durante45segundose,lo-
goapós,examinarosêmencommicroscópio
adaptadocomplatinaaquecida,observando-
seamotilidadequedeveestaracimade45%
evigor3.É importantequeosêmensejades-
congeladoadequadamentecomo descrito
acima,casocontrário,aqualidadedosêmen
ficarácomprometida(SukhatoetaI.,2001)
resultandoembaixataxadeconcepção.Logo
apósaavaliaçãodamotilidade,colhe-seuma
amostraemformolsalinoparaanálisedain-
tegridadedoespermatozóideatravésdemi-
croscopiadecontrastedefase,comênfase
especialsobrea membranaacrossômica,
umavezqueamesmaéfacilmentelesadase
oprocessodecongelaçãonãoforadequado.
Adicionalmente,pode-sefazer o Teste.de
Termo-Resistência(TTR) queconsisteem
deixaro sêmenemumbanho-mariaà39°C
durante5horaseobservaramotilidadeao
finaldo teste,a qualdeveserdeno mínimo
20%.Os examesde laboratóriotêm por
objetivoobservarcaracterísticasdo sêmen
queestãocorrelacionadascomacapacidade
defecundaçãodo mesmo,entretanto,para
quesetenhamdadossobrea realcapacida-
dedefertilizaçãoénecessáriotestarapartida
dosêmennotestedecampo,ondeamostras
domesmosãoutilizadasemdiferentespro-
priedades,atravésdasquaispode-seobter
dadosconcretossobrea taxadeconcepção
(númerodedosesutilizadas/vacagestante),
oqueindicaarealcapacidadedefecundação
dosêmencongelado.
Inseminação Artificial (IA)
na vaca bubalina
Comoadventodousodediluidoresespe-
cíficosparaaespéciebubalina,osproblemas
doprocessamentotecnológicodosêmenvi-
sandoacongelaçãofoisuperado.Entretanto,
aperfeiçoamentosno empregodatécnicaa
campoaindasãonecessários,visandofacili-
taro seuuso,bemcomo,o manejodasfê-
measasereminseminadas,umavezque,ain-
daexistempequenosproblemasnoprocesso
da IA embubalino.
Um dessesprincipaisproblemaséadifi-
culdadenadetecçãovisualdoestropelova-
queiroenadeterminaçãodomelhormomen-
toparaaIA, tendoemvistaqueocomporta-
mentodeestronabúfalaémaisdiscretoque
navacabovina(Tabela6.2). Porexemplo,o
comportamentohomossexualqueécaracte-
rizado pelo comportamentodas fêmeas
montaremoudeixarem-semontarnoperío-
dodoestro,nasvacasbubalinas,somenteum
pequenonúmerodeanimaisapresentaesse
tipodecomportamentoquandocomparado
aocomportamentodobovino,especialmen-
te doBos taurus,comotambémsãoos si-
naisclínicos,comoo corrimentodo muco
vaginalquesóédetectadonabúfalaemes-
troquandorealiza-seamassagemdavagina
atravésdo toqueretal(Ohashi,1994).Em
funçãodessefato,édefundamentalimpor-
tânciao usodeumrufiãoparaaidentifica-
çãoseguradabúfalaemestro,o qualpode
serummachooperadoparaessafinalidade
ou umafêmeaandrogenizada.
O períodoparaaobservaçãodeestrode-
veserno mínimode 1-2horas,duasvezes
aodia,umapelamanhãentre6:00e 7:30e
a outrapeloperíododatardeentre17:00e
as 18:30horas.Essessãooshoráriosonde
osanimaisexternamcommaiorintensidade
ocomportamentodeestro,especialmenteem
regiõesdealtatemperaturaambiental,sendo
que,emregiõesdeclimaameno,oestropode
sermanifestadoemqualquerhoráriododia
(Baruselli,1994b).
Tabela6.2. Principaissinaisde estraobservadasem búfalas
Fonte:Hale (1988);2-Baruselli(1994b).
A búfalaapresentaumagrandevariabili-
dadenaduraçãodoestro,fatoquedificulta
a determinaçãodeumhoráriopadronizado
paraa realizaçãoda IA, entretanto,sabe-se
queoesquemautilizadoembovinonãoapre-
sentabonsresultadosembubalinos(Tabela
6.3).Emfunçãodessefatoéquepreconiza-
searealizaçãodaIA dabúfalaapóso término
do estro,ou seja,a partirdo momentoem
quea mesmanãoaceitamaissermontada
107
Sinoisdeestro %(n=70)1 %(n=29)1
Aceitaçãodomontapl rufião 100 100
Montaremoutrofêmea 17,1 3,4
Micçãofreqüente 67,1 72,4
Elevação da cauda 95,7 51,7
Edemavulvar 67,1 79,3
Mugidofreqüente 57,0 51,7
Descarga de muco à palpoção 75,7 68,9
pelorufião.Esseéumdosaspectosquedifi-
cultaa realizaçãodeumprogramadeIA em
pequenaspropriedades,umavezqueéne-
cessáriomanterdoisrufiõesnapropriedade,
umparaa detecçãodo estrodosanimaisa
campoeooutrorufiãoquedevesermantido
juntocomafêmeaemestroparaobservação
domomentoemqueamesmanãomaisacei-
taramonta,paraquesejaentãorealizadaa
IA, umavezqueaovulaçãoocorreráemmé-
dia 16horasapóso términodo estro(Vale,
1983;Baruselli,1994a).Do pontodevista
prático,essefatotorna-seumalimitaçãodo
usodareferidatécnicaempropriedadescom
pequenonúmerodeanimaisecomdeficiên-
ciadeespaçofísico(curral),vistoqueoma-
nejodedoismachosnamesmaáreadificulta
o manejodosanimais.
Devidoadificuldadenadetecçãodoestro
enadeterminaçãodomelhormomentopara
realizaraIA nabúfala,atualmenteametodo-
logiadenominadadeovsynch(sincronização
daovulação)utilizadaembovinosparaarea-
lizaçãodaIA emtempofIXO(inseminaçãoem
tempopré-determinado)estasendoadaptada
paraaespéciebubalinausando-seGnRH +
PGF2alfa(BarusellietaL,1999;SousaetaL,
1999)ouusandoeCG (PMSG) +PGF2alfa,
bemcomo,compostoscomerciaisàbasede
progesterona,sendoesteúltimométodousa-
dona formadeesponjaintravaginal(Barile
etal.,2001).Emtodososprotocolososresul-
tadosforammuitopromissores,entretanto,
o únicoinconvenienteaindaéo custo,espe-
cialmentesefor usadoparaumprogramade
IA emlargaescala.
É necessárioquesetenhaemmenteque'
emum programade IA nãobastasomente I
umbomcontrolereprodutivo,é necessário
tambémquesetenhaumrígidocontrolecom
relaçãoaosaspectossanitários,bemcomo
comrelaçãoaosaspectosnutricionaisdore-
banho.Outro fatorquedeveserlevadoem
conta,quandodaimplantaçãodeumprogra-
made IA embubalino,é o fatode queem
regiõesondehádiferençade luminosidade
(dia/luz)duranteo ano,o búfaloapresenta
o fenômenodaestacionalidadereprodutiva,
concentrandosuaatividadereprodutivanos
mesesdeoutonoeiníciodeinverno(Baruselli,
1993;Baruselli,2001).Emregiãoequatorial,
comoa IlhadoMarajó,ondenãohádiferen-
çadeluminosidadeaolongodoano,arepro-
duçãopodeocorreraolongodoano.Nessa
regiãoporhavervariaçãonadisponibilidade
dealimento,ocorreaestacionalidaderepro-
dutiva,sendoquenessecaso,talcaracterísti-
caestárelacionadaaofatornutricional(Vale,
1988),ondenaestaçãochuvosa,ocorremas
enchentesdosriosGaneiro/junho)inundan-
do aspastagens,levandoà escassezdeali-
. mento,comconseqüentequedanaatividade
ovariana(ovárioafuncional).No entanto,no
períododejulhoanovembroocorreaestia-
gemdaschuvaseosriosvoltamaoseuleito
normal,disponibilizandoas pastagensaos
animais,quandoentãoteminícioo apareci-
mentodoestro,comdecréscimoapartirde
dezembro/janeiroquandoreiniciamaschuvas.
Outro aspectoque deveser levadoem
contaéo fatodanovilhabubalinaapresentar
o diâmetrodo colouterinobastantereduzi-
Animoisinseminodos
Tobelo 6.3. Toxodeconcepçãode vacasbubolinosinseminodosemdiferentesmomentosapóso aparecimentodo estro.
Dose/gestoçãoMomentodo Inseminoção
24 horasapósiníciodoestro
Padrãobovino
Apósfinaldoestro
42
64
70
Dosesutilizados Animoisnascidos
79
148
97
25
29
47
3,16
5,10
2,06
Fonte:Valeet01.(1990).
108
do,oquedificultaapassagemdapipetadu-
ranteoatodeinseminar,especialmentepor
Inseminadorcompoucaexperiência.Emfun-
çãodessefato,deve-seno iníciodeumpro-
gramade IA, dar preferênciaparaanimais
quejá pariram,nos quaisa cérvicejá está
bemmaisdesenvolvida.
Considerações finais
A técnicadaIA embubalinos,no quese
refereaoprocessamentotecnológicodo sê-
men,nãoapresentamaisaslimitaçõesquan-
to a suaqualidadepós-congelação,sendo
queaindaexistemas pequenaslimitações
quantoa detecçãodeestroeo melhormo-
mentoparainseminarafêmeabubalina,cujo
problemapodeserminimizadocomoauxílio
imprescindíveldorufião,semoqualadetec-
çãodeestronessaespécietorna-sebastante
difícil,mesmoquandoessafunçãoérealiza-
dapor pessoaconhecedorado comporta-
mentodebubalinoe treinadaparaessefim.
Issodeve-seao fatodequeos sintomasde
estronabúfalasãomaisdiscretosqueo da
vacabovina.Apesardasdificuldades,atécni-
cadaIA embubalinostemapresentadoum
grandeprogressotécnico-científiconesses
últimosanos,oquepermiteafirmarqueessa
técnicapodeserusadarotineiramentecomo
instrumentoparapromovero aumentoda
produçãoeaqualidadezootécnicadoreba-
nhobubalino.
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Capítulo7
Inseminação Artificial em Caprinos
José FerreiroNunes
Introdução
A inseminaçãoartificial(IA) é a técnica
maisimportantejá idealizadaparaomelho-
ramentogenéticodeanimais.Isto setorna
possívelporquepoucosreprodutoresalta-menteselecionadosproduzemespermatozói-
dessuficientesparainseminarmilharesde
fêmeasporano,enquantoquerelativamente
poucosdescendentesdefêmeasselecionadas
podemser obtidospor ano, mesmopela
transferênciadeembriões.
A técnicaconsistenaretiradado sêmen
dobodeesuadeposiçãonoaparelhogenital
dacabra.O sêmenpuropodetersuacapa-
cidadedeutilizaçãoaumentadagrandemente
atravésda simplesdiluição.Devidamente
processado,podeosêmendeumasócolheita
servirparaalgumasdezenasdecabras(Mies
Filho, 1978).
O sêmencaprinopodeser conservado
sobrefrigeraçãoa4°C,podendoserutiliza-
doemumcurtoespaçodetempoou,ainda,
congeladoa -196°Cemnitrogêniolíquido,
oquepossibilitaasuautilizaçãoporumlon-
goperíododetempo.A tecnologiadosêmen
caprinopossuientravescomrelaçãoàconge-
lação,provenientedeproblemasgeradospela
interaçãodoplasmaseminalcomosfosfoli-
pídiosexistentesnosdiluentescomumenteuti-
lizadosparabeneficiamentoecriopreservação
domaterialespermático(NunesetaI,1982).
O presentecapítuloabordaamorfofisio-
logiado aparelhoreprodutormasculinode
caprinos,autilizaçãodaáguadecococomo
diluente,bemcomoatecnologiademanipu-
laçãoebeneficiamentodo sêmencaprino.
Morfofisiologia do aparelho
reprodutor masculino de caprinos
Anatomiae fisiologia
Ostestículossãoosprincipaisórgãosden-
treosqueconstituemoaparelhogenitalmas-
culinoedeledependemduasfunçõesessen-
ciais:a espermatogêneseeaproduçãohor-
monal(Thibault& Levasseur,1992).Ostes-
tículosdobodesãoemnúmerodedois,apre-
sentamformaovóideeestãoalojadosnabol-
saescrotal,emposiçãovertical(Figura7.1).
São simétricose deconsistênciafirme.Os
testículosdeumbodeadultopesamde80a
300g, sendoinfluenciadopelaraça,estação
doanoeestadonutricional(Bariletal.,1993).
O epidídimoéumórgãoalongadoqueen-
volvemedialmentecadatestículo,comasua
cabeçadirigidaparaaporçãocranialdabor-
dalivredotestículo.É compostodetrêspartes
111
Prepúcio
Corpo doEpididimo--'
CaudadoEpididimo
Ampola
/ VesículasSeminais
/ li Próstata
Ânus
.~<"'1\/
Bulbo
Uretrais
Músculo
Figura 7.1. Componentesdo aparelhoreprodutivodo bode.
distintas:cabeça,corpoecaudaetemafun-
çãodetransportarearmazenarosesperma-
tozóidesproduzidosnostestículos.O dueto
deferente,junto com o duetoexcretorda
glândulavesicular,desembocanaporçãoini-
cialdauretra,formandooduetoejaculatório.
Suafunçãoéadetransportarosespermato-
zóidesno momentodaejaculação.
As glândulasacessóriassãoresponsáveis
pelaproduçãodoplasmaseminaleestãosi-
tuadasjuntoà uretra,depositandosuasse-
creçõesnela.Asglândulasvesiculares(duas)
sãoformadaspor um corpo glandular.A
próstata,poucodesenvolvida,estádistribuída
ao redordo lúmenda uretra.As glândulas
bulbouretraistêmo tamanhodeumaavelã,
epossuemsomenteumcondutoexcretorde
cadalado.
O pêniséo órgãomasculinoresponsável
pelacópula.É semelhanteaodeoutrosrumi-
nanteseapresentaaflexurasigmóide(ou"S"
peniano)entrea pélvise o escroto,disten-
112
dendo-senomomentodacópula,provocan-
doumaumentono comprimentoefetivodo
pênis,queé exteriorizadoe podepenetrar
nogenitaldafêmea.Apresenta,emsuaextre-
midade,aglande,naqualsesituaoprocesso
uretral(apêndicevermiforme),com3a4em
decomprimento.
O bodetambémpossuiglândulasodorífe-
ras,denominadasglândulasdeSchietzel,lo-
calizadasatrásdopontodeinserçãodoschi-
fres,equeproduzemumodorcaracterístico,
o odorhircino,queaumentanaestaçãode
monta,estimulandoocomportamentosexual
da fêmea.
Produçãoespermáticae puberdade
A puberdadenobodeestáassociadaaum
marcanteaumentonasecreçãodetestostero-
na,naespermatogêneseenocomportamen-
to sexual.De trintaa quarentadiasapóso
nascimento,o crescimentodos testículose
dosepidídimosdocaprinojovemseprocessa
espermatogênico.A temperaturaambiental
acimadaqualos espermatozóidescaprinos
sãoafetadossitua-seao redorde 29-30°C.
Masasensibilidadedosbodesàtemperatura
ambientalvariade acordocom a raçae o
local de criação.Existeumavariabilidade
intra-racialquantoaoestressetérmico,suge-
rindoumapossívelorigemgenética.A bipar-
tiçãoescrotal,emseusdiversosgraus,levaa
umamelhorregulaçãotérmicatesticulare
temsidodescritaemrebanhostropicaisco-
moadaptaçãofaceaoclimaadverso.Muitos
criadoresdecaprinossabemquediferentes
regimesalimentaressãocapazesdemodificar
aperformancereprodutivadeseusanimais.
Emzonastropicaisesubtropicais,aescassez
dealimentoséprovavelmenteumdosprinci-
paisfatoresambientaisquelimitamaperfor-
mancereprodutiva.A libidodobodepodeser
marcadamenteafetadapelafaltaouescassez
dealimentos.A perdadepesocrônica(400g
depesovivosemanalmentepor30semanas)
provocaumacontínuadiminuiçãodo peso
testicularedaconcentraçãoe númerototal
de espermatozóidespor ejaculado.Final-
mente,podeserdestacadoqueadeficiência
devitaminasemineraispodeafetaraperfor-
mancereprodutivadosbodes(Chemineau
etal.,1991).
Funçãofisiológicado plasmaseminal
Frazer& Bucci (1996)afirmaramqueo
plasmaseminalécompostoporaçúcares,li-
pídeoseminerais,bemcomoporumelevado
teordeproteínasespeciais,incluindoenzi-
mas,hormônios,váriosfatoresdecrescimen-
to, inibidores,imunossupressores,substân-
ciasligadasaandrógenos,inibinae imuno-
globulinas,ondeapresençaouaausênciade
muitosdessescomponentespodeestaren-
volvidacomafertilidade.Essasexercemim-
portanteinfluêncianasobrevivênciadascélu-
Iasespermáticas,comportando-secomoin-
dicadoresdepatologiasdo aparelhorepro-
114
dutormasculinoeestãointimamenterelacio-
nadascomacongelabilidadedosêmen(lbar-
ra & Navaridas,1992).
Há muitotempoqueo sêmentemsido
objetodeintensasinvestigaçõesbioquímicas,
masapesardosconsideráveisavanços,osco-
nhecimentossobreo plasmaseminalainda
sãoobscuros.As modificaçõesqueocorrem
apóso tratamento"in vitro",ocasionamva-
riaçõesno metabolismoe/ou sobrevivência
dosespermatozóides,alémdisso,ainexistên-
ciademecanismosdeeliminaçãodascélulas
espermáticasmortas,submeteosgametasvi-
vosaconviveremcomosprodutosdesuade-
composição(Corteel,1980).Skandhan(1981)
reconhecequeasalteraçõesdemuitoscom-
ponentesdo plasmaseminalsãoresponsá-
veispelaincapacidadedefecundaçãodoga-
meta,contudosugerequeháumacorrelação
diretaentreoníveldezinconofluidoseminal
eamotilidadedoespermatozóide,ressaltan-
doquepequenasquantidadesdesteelemento
sãoessenciaisparaamanutençãodamotili-
dadeespermática.
Ibarra& Navaridas(1992)sugeremque
afrutoseseminalcomporta-secomoummar-
cadordas funçõesdasvesículasseminais,
sendonecessáriaàsobrevivênciaemotilidade
inicialda célulaespermáticae queo ácido
cítricorefleteaatividadesecretoradaprósta-
tamesmoquesuafunçãoaindanãosejabem
conhecida.Todavia,acredita-sequeo ácido
cítricosecomportecomoumativadordafos-
fataseácida,sendoimportanteparaamanu-
tençãodo equilíbrioosmótico,juntamente
como potássioeo sódio,favorecendodeste
modoa atividadeespermática.
O ácidocítricoéumdosprincipaiscons-
tituintesdoplasmaseminaleapresentauma
relaçãocomos níveisdetestosteronaplas-
mática,ocorrendoemaltasconcentraçõesna
maioriadasespéciesdemamíferos,tendoele-
vadaimportânciaparao metabolismoemo-
tilidadeespermática,porconstituir-seemum
agentereguladornecessárioemmuitossiste-
masBioquímicos(Polakoski& Kopta,1982).
Singh& Penbey(1995),avaliandoacor~
relaçãoexistenteentreosníveisdetestostero-
naplasmáticacoma quantidadedealguns
constituintesbioquímicosdoplasmaseminal,
observaramquealtasconcentraçõesdo an-
drógeno,nãosomenteconduziamaumame-
lhordemonstraçãodalibido,comotambém,
eramresponsáveispelaelevaçãodosníveisde
frutoseeácidocítriconosêmendecaprinos.
HiroeetaI. (1960)afirmaramquea condi-
çãodearmazenamentodo plasmaseminal,
afreqüênciadeejaculações,oníveldeglicose
nosanguee a condiçãonutricional,podem
interferirfortementenaproduçãoemetabo-
lismodafrutose.
Pinheiroet aI. (1996a),com o objetivo
de determinaros parâmetrosbioquímicos
normaisnoplasmaseminaldecaprinoscria-
dosno Nordestedo Brasil,emmachosdas
raçasAlpina,MoxotóemestiçoAlpina-Mo-
xotó,observaramqueosvaloresencontrados
parafrutose,ácidocítricoeproteínatotalfo-raminferioresnaestaçãoseca.Entretanto,em
ambasasestações,o tiporacialMoxotómos-
trouvaloressempremaiselevados,correla-
cionandoosníveisde frutoseeácidocítrico
com a maior disponibilidadede alimento
ocorridaduranteaestaçãochuvosa.Pinheiro
etaI. (1996b)sugeremqueadisponibilidade
e quantidadedealimentoentreos períodos
chuvosoe seco,provavelmente,influenciam
o equilíbrioeletrolíticodo sêmencaprino.
Temsidosugeridoqueo plasmaseminal
decaprinosnomeiodeconservaçãointerfere
nocomportamentodosespermatozóidesem
suportara congelação(Corteel,1974).Al-
gunsexperimentosrelataramqueaqualida-
deespermáticadosêmenlavado,congelado
edescongeladoésignificativamentesuperior
aosêmennãolavado,noqueserefereàmoti-
lidadeindividualprogressiva(MIP), masnão
napercentagemdeespermatozóidesmóveis
(Corteel,1975a).A eliminaçãodoplasmase-
minalmelhorouocomportamentodosesper-
matozóidesemsuportaracongelação,aso-
breviver"invitro"apósadescongelaçãoesua
conservaçãoa-196°C,assimcomotambém,
aumentouataxadefertilidade(Corteel,1976).
Baseadonestasobservações,Corteel(1975a)
recomendoualavagemdoespermadecapri-
nosantesdacongelação.
Entretanto,asrecomendaçõesparalava-
gemespermáticaforampreconizadasapós
estudosrealizadoscomanimaisdeclimatem-
perado,ondecomprovadamenteo plasma
seminalexerceefeitodeletériosobreos es-
permatozóides(NunesetaI.,1982).Corteel
(1975a)relataqueo tempodeconservação
dosêmencongeladocomoplasmaseminal,
conservadoemnitrogêniolíquido,decresce
significativamentequandocomparadoao
sêmencriopreservadosemplasmaseminal.
Assim,o plasmaseminalcaprinomostra-se
desfavorávelà sobrevivênciaespermática
(Corteel,1975b).
Durantea estaçãonãosexual,emclima
temperado,oplasmaseminaldeprimeforte-
mentea motilidadeindividualea percenta-
gemde espermatozóidesmóveis,colhidos,
congeladosnaestaçãosexualedescongela-
dosna estaçãonãosexual(Nunes,1980).
NunesetaI. (1982),demonstraramque
esseefeitodeletériodoplasmaseminaldaes-
taçãonãosexualprovémdasglândulasbul-
bouretraisqueduranteessaestaçãotornam-
sehipertrofiadasesecretamgrandesquanti-
dadesdefosfolipasesdotipo"1\'.Essaenzima
agesobreosfosfolipídiosdosdiluentes,levan-
doaformaçãodelisolecitinaseácidosgraxos,
queexercemaçãotóxicasobreosespermato-
zóides(Roy,1957).Esseefeitoéexacerbado
quandoháinteraçãoentreasenzimasfosfoli-
paseseosfosfolipídiospresentesnomeiodi-
luentecomooleiteeoplasmaseminal,respec-
tivamente.Foidemonstradoqueacongelação
do sêmencaprinodiluídoemleite,contendo
115
acimade 10mg de fosfolipídios,causoua
mortedetodosos esperrnatozóides(Nunes
etaI., 1982).Portanto,diluentespobresem
fosfolipídiospoderiamserasoluçãoparaevi-
tarou reduziros efeitosnegativoscausados
pelafosfolipase"/\'sobreosêmendeanimais
destaespécie(Nunes,1987).Dentreasalter-
nativasdediluentespobresemfosfolipídios,
surgiuaáguadecocoque,atravésdeexperi-
rnentos"invitro"e"invivo",exibiuumexce-
lentecomportamentonoqueserefereaovi-
goremotilidadedeespermatozóidesmóveis
e fertilidade(Nunes,1986).
Utilização da água de coco e suas
frações ativas como diluente do
sêmen de mamíferos domésticos
Propriedadesfísico-químicasdaáguadecoco
A águadecoco(Cocusnucifera),perten-
centeàsubfamíliaCocosidea,dafamíliaPal-
mae,écompostadesoluçãoácidaestéril,con-
tendosais,proteínas,açúcares,vitaminas,
minerais,fatoresdecrescimentoegorduras
neutras(Marques,1982),alémdeindutores
dadivisãocelulare eletrólitosdiversos,que
lhesconferemdensidadee pH compatíveis
como plasmasangüíneo,fornecendo,desta
forma,osnutrientesnecessáriosparamanter
asobrevivênciaeviabilidadedosgametasmas-
culinose femininoscriopreservados(Blume
& MarquesJr., 1994).A águadococoima-
turoé isentade piógenos,com2,5a 5,9g/
100rnldeaçúcaresredutores,nãocausando
hemólisenosanguehumanoinvitroouinvivo
(Eisemann,1954).
Visandoisolara fraçãodaáguadecoco
queatuasobreosespermatozóides,realizou-
seo fracionamentodaáguadecoco,utilizan-
do-seurnacolunadeSephadexG-25,eum
comprimentodeondade21Onm,verifican-
do-sequatropiquesdesaídarecuperadosem
60tubos,sendoqueopiqueobservadoentre
ostubos20e30correspondeà fraçãoB, da
qualisolaramurnamoléculapertencenteao
116
grupodasauxinas,istoé,o ácido3-indol-
acético,substânciacomaçãohormonales-
timuladoradocrescimentodevegetais,aqual
demonstrouatividadesobreo metabolis-
modosesperrnatozóides(Nunes& Combar-
nous,1995).
A introduçãodo ácido3-indol-acético
(1M) nacomposiçãodosdiluentesconven-
cionaisdosêmendediferentesespéciescon-
fereaosespermatozóidesumincrementona
motilidade,aumentandoataxadefertilidade,
alémdepermitirasuaconservaçãodurante
períodosmaislongos.Cruz(1994)obteve
urnafertilidadesignificativamentesuperior
como usodesêmenpreservadopor48ho-
rasa4°Cemmeiocontendo1M (40,74%)
quandocomparadocomo sêmenemmeio
àbasedeleite(14,81%).
Composiçãoda águade coco
A águadecocorecomendadaparaouso
emdiluentesseminaiséaprovenientedefru-
toscom6 mesesdematuração,sendocom-
postaprincipalmentedeaçúcares,aminoáci-
dos,vitaminase minerais(Tabela7.1).No
estágiodematuraçãoinicial,istoé,o fruto
verdecom seismesesde idade,a águade
coco apresentaosmolaridadeemtorno de
500mOsm/L e pH 4,5.
Principais etapas na inseminação
artificial em caprinos
Escolhado reprodutor
Na práticadainseminaçãoartificialcom
sêmencongeladoespera-sequeacentralde
inseminaçãoofereçao materialgenéticode
umanimaldecomprovadacapacidaderepro-
dutivaequeconsigatransmitir,aosseusdes-
cendentes,todososaspectosalmejadoscom
atécnica.Jácomautilizaçãodesêmenfresco
ouresfriado,aavaliaçãodoreprodutoré mui-
to importante.
Osmachoscaprinoseovinossãoanimais
precocesque aos quatro mesesde idade
Tabela7.1. Composiçãoda águade cocoanãamaduro.
1. Aminoácidos
Alonino
Aminobutírico
Arginino
Aspargina
ÁcidoAspártíco
Fenilalonina
Glicino
ÁcidoGlutâmico
Glutamino
Histídino,MelioninaeHidroxipolino
Homoserino
Leucino
Usina
Prolino
Serina
Tirosino
Treonino
Volina
!-lg/ml
177.1
168.8
16.8
10.4
5.4
10.2
13.9
78.8
13.4
Troços
5.2
31.7
22.5
21.6
65.8
3.1
26.3
15.1
2.Açúcares
Frutose
Glicose
Socarose
!-lg/ml
8.9
2.46
2.51
3.Vitaminas
Ácidofólico
Ácidonicotínico
Ácidopontotéico
Biolino
Tiominoe Piridoxino
!-lg/ml
0.003
0.64
0.52
0.02
0.01
4.Minerais
Cálcio
Cloro
Cobre
Enxofre
Ferro
Fósforo
Mognésio
Potássio
Sódio
!-lg/ml
Traços
183.0
0.04
24.0
0.10
37.0
30.0
312.0
105.0
Fonte:Nunes& Combarnous,1995.
podementrarem puberdade,atingindoa
maturidadesexualaosseisesetemesesapós
onascimento.Osanimaisjovensemborase-
xualmentemaduros,têmproduçãodesêmen
inferioradosanimaisadultos,portantoserão
consideradosadultosquandoatingiremope-
so,odesenvolvimentocorporaleaprodução
espermáticaideaisa suaraça.Geralmente,
issoaconteceporvoltadosdoisanosdeida-
de.Um reprodutorpodeatuar,ativamente,
comodoadordesêmendosseisaoitoanos
deidade,quandodeverásersubstituído,por
apresentarumadiminuiçãonoseupotencial
reprodutivo(NunesetaI., 1997).
Na escolhadeumreprodutordevemser
observadasalgumascaracterísticas:
+ostestículosdevemsersimétricos,ovói-
des,firmesepresentesnabolsaescrotal.
Animaiscomproblemasdecriptorqui-
dismo(umouambosostestículospre-
sentesno abdômenenãonabolsaes-
crotal),orquite(inflamaçãonostestícu-
los)ehipoplasiadevemserdescartados
comoreprodutores,pois essasaltera-
çõespodemcomprometerafertilidade;
+o animaldeveserisentodealterações
penianasou prepuciais;
+deveapresentarboalibido(interessese-
xualpelafêmea);
+deveterintegridadeescrotal(ausência
debernes,carrapatos,bicheiras,mico-
sesou outraslesõescorporais);
+deveserisentodedoenças;
+não deveapresentarhérniaumbilical,
tetassupranuméricasou tetasbífidas;
+apresentaraspectomasculino:porte,
pescoço,voz,libidoedesenvolvimento
testiculare peniano;
+nãoseragnataenemprognata;
+terbonscascoseaprumos;
+apresentarespermogramadentrodos