Aula Prática Identificação e Isolamento de Bacilos Gram negativos

Prévia do material em texto

Provas Identificação e Isolamento de Bacilos Gram negativos 
1. Plaqueamento Seletivo - Técnica: Para o isolamento de Escherichia coli 
- Diluição da amostra: leite, ração, fezes e água; 
- Colocar 10g ou 10 ml da amostra em 90 ml de solução salina esterilizada, obtendo diluição 
10-1, em um Erlenmeyer previamente esterilizado e agitar bem; 
-Inocular em placas de agar Eosina azul de metileno (EMB) ou Agar Mac Conkey, por 
"esgotamento". 
- Colocar as placas de Petri já inoculadas na estufa bacteriológica a 37oC durante 24 e 48 
horas; 
 Observar as colônias que cresceram, observar o tipo e cor da colônia e realizar um 
Gram para ver a forma, agrupação e Gram das bactérias presentes. 
 O EMB é um meio seletivo para Enterobactérias permitindo o crescimento de 
bactérias Gram ( -). A Salmonella por não fermentar a lactose produz colônias incolores 
quase transparentes, pequenas como gotas de orvalho já a Escherichia coli produz neste 
meio, colônias de cor azuladas com viso verde metálico de mais ou menos 2-3mm de 
diâmetro e outras bactérias entéricas, produzem colônias cor de rosa cremosa. 
 Etapa de isolamento bacteriano a partir de espécies clínico, utilizando meios 
seletivo-indicadores como o Agar EMB. Neste meio as bactérias Gram positivas são inibidas 
pela presença de eosina e azul de metileno. As bactérias Gram negativas fermentadoras de 
lactose ( LAC + ) apresentam-se como colônias rosa-avermelhadas com ou sem centro negro, 
enquanto as não-fermentadoras ( LAC -) formam colônias transparentes. 
 O meio de Mac Conkey, também seletivo para Enterobactérias, baseia-se na 
fermentação da lactose. As colônias fermentadoras provocam uma queda do pH e absorvem 
o vermelho neutro adquirindo coloração "pink". As não fermentadoras permanecem 
translucidas ou incolores. 
 
LEITURA Mak Conkey: 
Colônias lactose-positiva (Lac. +) : degradação ( fermentação ) da lactose com acidificação do 
meio que produzirá colônias de cor rosa com halo central mais claro. Ex.: E. coli, Klebsiella, 
Enterobacter. 
 Colônias lactose-negativa (Lac. -): não utilização da lactose, formação de colônias incolores 
e transparentes. As colônias assumem a coloração do meio, que se apresentará um pouco 
alterado, devido a utilização dos outros componentes ( só não utilizará a lactose) . 
Ex.:Proteus, Salmonella, Shigella. 
2. Triagem - PROVAS BIOQUÍMICAS UTILIZADAS NA IDENTIFICAÇÃO DE BACTÉRIAS 
METABOLISMO DE CARBOIDRATOS 
1- Fermentação de carboidratos: 
Algumas bactérias são capazes de hidrolizar os carboidratos (dissacarídeos até glicose), e 
metabolizar a glicose até ácidos (com ou sem liberação de gás) e/ou álcoois. 
Carboidrato ( manitol, sacarose, lactose, etc. ) � glicose �ác. Pirúvico � ácidos, álcoois e 
gases. 
Meio utilizado: meio de cultura indicador que contém: caldo simples + carboidrato + 
indicador de pH (indicador de Andrade ) + tubo de Durhan. 
TÉCNICA: 
a) repicar o microrganismo já isolado para o meio contendo o carboidrato e incubar em 
estufa a 37°C por 24 horas. 
b) Leitura: observar se houve produção de ácidos(viragem da cor do meio) com ou sem 
produção de gás (formação de bolha no interior do tubo de Durhan). 
2- Prova do citrato: 
Muitas bactérias são capazes de utilizar ocitrato (ác. orgânico do ciclo de Krebs) como fonte 
de carbono . A enzima que cataliza a clivagem do citrato recebe várias denominações, dentre 
elas, citratoliase e citrilase. Os produtos de clivagem são acetato e oxaloacetato,este último 
sendo subseqüentemente convertido em Piruvato e CO2 ,por uma oxalacetato 
descarboxilase. 
 
 O Piruvato é utilizado pela célula ( para seu metabolismo ) e o CO2 é liberado no 
meio de cultura. O CO2 liberado reage então com o sódio ( proveniente do sal citrato de 
sódio incorporado na composição do meio de cultura ), formando carbonato de sódio ( 
composto alcalino ), que promove a viragem da cor do meio, devido a alcalinização. 
Meio utilizado: Citrato de Sódio + H2O + Indicador de pH ( azul de bromotimol ). O pH final 
do meio após preparo: 6.8 . 
Indicador de pH: azul de bromotimol: verde em meio ligeiramente ácido ( 6.8 ) e azul em pH 
acima de 7,6. 
Técnica: repicar o microrganismo já isolado no meio do citrato e incubar na estufa a 37° C 
por 24 horas. Leitura: 
- teste positivo: meio de cultura azul (a bactéria utilizou o citrato, liberando CO2,) 
- teste negativo: meio inalterado ( verde ): bactéria não utilizou o citrato. 
METABOLISMO DE PROTEÍNAS 
A decomposição de proteínas ( liberação de aminoácidos ) conduz à produção de substâncias 
pútridas (de mal cheiro) como: H2S, Indol e escatol e etc. Neste experimento, observaremos 
a utilização ou não de certos aminoácidos pelas bactérias ( necessários ao seu metabolismo), 
através da detecção da presença de substâncias pútridas. 
Meio de cultura utilizado: Meio SIM. ( S=sulfeto; I=indol; M=motilidade ) 
Composição: peptona (proteína que serve como fonte de tryptofano e cistina), sal de metal 
pesado (sal de ferro ou chumbo), água e ágar. 
TÉCNICA: 
Semear com agulha ( picada até + ou - 1/3 do tubo )a bactéria já isolada para o meio SIM. 
Incubar em estufa a 37ºC por 24 horas. Após incubação, adicionar de 3a 5 gotas do reativo 
de Kovacs e proceder a leitura. 
FUNDAMENTO: 
1- Produção de Indol: degradação do tryptofano 
 
Ác. pirúvico: utilizado pelo metabolismo da bactéria. 
Indol: liberado no meio de cultura. Adicionar após incubação, de 3 a 5 gotas do reativo de 
Kovacs ( solução de paradimetilaminobenzaldeido ). Se houver liberação de indol, formar-se-
á um anel vermelho ( composto denominado rosindol) 
Resultado: 
- Indol positivo: anel vermelho 
- Indol negativo: não utilização do tryptofano. Presença de anel amarelo (cor do reativo de 
Kovacs) 
2- Produção de H2S: 
Cistina: aminoácido que contém enxofre (S). Degradação da cistina com liberação de H2S. 
 
Ác. pirúvico; utilizado no metabolismo da bactéria. H2S: liberado no meio de cultura. O H2S 
liberado combina-se com o sal de ferro ou chumbo, dando como resultado um precipitado 
de cor negra. 
Resultado: 
- H2S positivo: precipitado preto 
- H2S negativo: sem precipitado 
3- OUTRAS PROVAS BIOQUÍMICAS 
 Conjunto de provas bioquímicas realizadas simultaneamente em 1 ou 2 meios, 
permitindo uma diferenciação inicial dos isolamentos e direcionamento da contaminação 
bioquímica. Quando realizada em meio TSI, podemos observar: 
- Fermentação de glicose e produção de gás 
-Fermentação de lactose e/ou sacarose 
-Produção de H2S 
 Bactérias que utilizam apenas glicose provocam acidificação (de coloração amarela) 
apenas na base, permanecendo o ápice alcalino (de cor avermelhada). Bactérias 
fermentadoras de lactose e/ou sacarose acidificam todo o meio. A formação de gás é 
evidenciada pelo rompimento ou descolamento do meio. A produção de H2S se manifesta 
pelo escurecimento do meio. 
 
3. Confirmação Bioquímica 
 Conjunto de provas necessárias para a identificação bioquímica das colônias 
suspeitas. Algumas dessas provas estão descritas abaixo: 
a. Fermentação de Carboidratos: glicose, lactose, manitol, sacarose. 
 A utilização dos carboidratos leva à formação de ácidos, com viragem do indicador 
(vermelho de fenol) para cor amarela. A partir da glicose podemos observar também a 
produção ou não de gás (CO2, H2) no interior do tubo de Durham. A inoculação é realizada a 
partir de cultura bacteriana overnight (+/-18h) em Agar. Incubar por 24 horas a 37ºC. 
Leitura: 
- cor amarelada = + (positivo) 
- sem alteração= -(negativo) 
 
b. VM: Verifica a ocorrência de fermentação ácido-mista ( glicose→ ácidos estáveis). 
Meio: Clark & Lubs. 
Inoculação: idem ao item a. Apósincubação ( 48 h ), adicionar 3 –5 gotas do reativo de VM ( 
vermelho de metila→ alcalino = amarelo pálido / ácido = vermelho). 
Leitura: 
 Cor vermelha = + 
Cor amarela = - 
c. VP( Voges & Proskauer ): verifica a ocorrência de fermentação acetoínica 
(glicose→acetoína). 
Meio: Clark & Lubs (meio glicosado e tamponado).Inoculação: idem ao itema. Após 
inoculação (48 h), adicionar os reativos: 
VP I (Barrit I): alfa-naftol (0,6 mL) 
VP II ( Barrit II): KOH 40% (0,2 mL) 
Leitura (após 10 –15 minutos):*observar o aparecimento de anel vermelhos na superfície do 
tubo (resultado positivo) *sem alteração: resultado negativo 
d. Citrato: verifica a utilização do citrato como única fonte de carbono. 
Meio: Citrato de Simmon. Inoculação: idem ao item a. 
Leitura: meio azulado = + meio sem crescimento = - 
 
e. Indol: verifica a produção de triptofane, que quebra triptofano, liberando indol, este é 
revelado com o reativo de Kovacs, observa-se a formação de um anel escarlate na superfície 
do meio. 
Meio: Caldo semi-sólido (SIM). 
Inoculação: idem ao item a. após a inoculação, adicionar 5 gotas do Reativo de Kovacs. 
Leitura: sem alteração = - cor rosa = + 
 
f. Mobilidade: verifica se a bactéria é móvel ou imóvel. 
meio: Agar semi-sólido (SIM). 
Inoculação: utilizar agulha bacteriológica, fazendo uma picada central até ¾ da profundidade 
do tubo. 
Leitura: crescimento fora do local da picada = + (móvel) 
crescimento somente ao redor da picada = -(imóvel) 
g. Nitrato: verifica a capacidade de redução do nitrato ( NO3) à nitrito (NO2).Inoculação: 
idem ao item a. Após incubação, adicionar 3 a 5 gotas dos reativos: 
 Nitrato A: alfa naftilamina 
Nitrato B: ácido sulfanílico 
Leitura: cor vermelha (violácea, escarlate) = + (liberação de NH3 - Amônia) 
sem alteração = - 
h. Uréia: meio contendo uréia para verificar a produção da enzima uréase. 
Inoculação : idem ao item a. 
Leitura: 
cor vermelha (violácea, escarlate) = + (liberação de NH3 – Amônia) 
sem alteração = -