Relatório - Identificação de Enterobactérias

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
FACULDADE DE FARMÁCIA, ODONTOLOGIA E ENFERMAGEM
DEPARTAMENTO DE ANÁLISES CLÍNICAS E TOXICOLÓGICAS
MICROBIOLOGIA CLÍNICA
IDENTIFICAÇÃO DE ENTEROBACTERIACEAE
FORTALEZA
2019
1 INTRODUÇÃO
A família das Enterobactérias é considerada a maior e mais heterogênea
família de bactérias Gram negativas de importância médica. Se apresentam em
forma de bacilos, não esporulados, com motilidade variável, catalase positivos e
oxidase negativos, e que crescem em meios ricos em nutrientes (como o ágar
sangue) e meios seletivos (como o MacConkey). São anaeróbios facultativos,
fermentadores de glicose, podendo ou não produzir gás, e redutores de nitrato a
nitrito. São organismos ubiquitários e sua maioria é encontrada no trato
gastrointestinal de humanos, no reino animal, na água, solo e vegetais. Alguns
também são considerados enteropatógenos por causarem preferencialmente
infecções gastrointestinais como a Salmonella typhi, outras salmonellas, Shigella
spp., Yersinia enterocolitica e vários sorotipos de Escherichia coli, embora possam
também causar infecção em outros locais. Também são responsáveis por de cerca
de 70% das infecções urinárias e 50% das septicemias.
2 OBJETIVO
Diferenciar enterobactérias patogênicas a nível de gênero e espécie.
3 METODOLOGIA
3.1 Coloração de Gram
Com auxílio da alça bacteriológica esterilizada, foi realizada a inoculação do
microrganismo em uma lâmina contendo uma gota de água que, em seguida, foi
aquecida na chama do bico de Bunsen para fixação do esfregaço. Logo após, foram
adicionadas algumas gotas de Cristal Violeta e após um minuto a lâmina foi lavada
com água destilada. Assim, adicionou-se o lugol e novamente esperou-se o tempo
de um minuto para realizar a lavagem da lâmina com água destilada. Então,
utilizou-se álcool-cetona, para uma nova lavagem e, após 30 segundos, a lâmina foi
finalmente corada com fucsina. Por fim, após 30 segundos, lavou-se novamente
com água destilada e, com auxílio de um secador, a lâmina foi secada para, então,
ser observada na lente de maior aumento de um microscópio.
3.2 Ágar Sangue
É um meio não-seletivo, porém diferencial, e seu princípio se baseia na
capacidade da bactéria de realizar hemólise do meio, sendo a mesma caracterizada
de acordo com o tipo de padrão hemolítico a mesma apresenta, sendo eles: Beta
hemólise - presença de halo transparente ao redor das colônias semeadas (lise total
dos eritrócitos). Alfa hemólise - presença de halo esverdeado ao redor das colônias
semeadas (lise parcial dos eritrócitos). Gama hemólise (sem hemólise) - ausência
de halo ao redor das colônias (eritrócitos permanecem íntegros).
Dessa forma, com o auxílio de uma alça bacteriológica esterilizada no bico de
Bunsen, retirou-se uma pequena quantidade do microrganismo da colônia e o
inoculou na placa de petri contendo Ágar Sangue por meio de estriamento. Em
seguida, esta placa foi incubado a 35ºC por aproximadamente 24h.
3.3 Ágar MacConkey
O meio Ágar MacConkey é seletivo para bactérias Gram Negativas e
diferencial para fermentação de lactose, funcionando assim como uma contraprova
para bactérias Gram (+). Possui o vermelho de metila como indicador de pH, que
muda de rosa para vermelho em caso de positividade, pois a bactéria que fermenta
lactose produz subprodutos ácidos que reduzem o pH do meio, promovendo essa
mudança de cor nas colônias. No entanto, no caso de negatividade, há a mudança
de rosa para amarelo, pois a peptona presente no meio é consumida liberando
produtos que irão alcalinizar o meio.
Assim como no meio Ágar Sangue, foi retirado uma quantidade de
microrganismo da colônia e semeado no meio MacConkey, utilizando uma alça
bacteriológica, pela técnica de esgotamento. A placa de Petri foi incubada em uma
estufa a 35ºC.
3.4 Caldo VP
O caldo VP (Vogues - Proskauer) determina a capacidade dos
microrganismos produzirem produtos finais ácidos ou neutros, como o
acetilmetilcarbinol (acetoína) a partir dos ácidos orgânicos que resultam da
fermentação da glicose. Mas para observar tal atividade são utilizados as soluções
de α-naftol e KOH. A cor original do meio é amarelo, que permanece inalterada nos
casos em que o resultado é negativo, entretanto, se positivo, a coloração se torna
vermelha após a adição do reagente.
Dessa forma, com o auxílio de uma alça bacteriológica esterilizada no bico de
Bunsen, retirou-se uma pequena quantidade do microrganismo da colônia e o
inoculou no meio contendo Caldo VP. Em seguida, este meio foi incubado a 35ºC
por aproximadamente 24h.
3.5 Ágar Fenilalanina
O princípio deste meio é o de verificar a capacidade da bactéria de produzir
fenilpirúvico a partir da fenilalanina por ação enzimática da fenilalanina desaminase,
mas para observar tal atividade, é utilizada a solução de cloreto férrico a 10%. A cor
original do meio é amarelo palha, que permanece inalterada nos casos em que o
resultado é negativo, entretanto, se positivo, a coloração se torna esverdeada após
a adição do reagente.
Dessa forma, com o auxílio de uma alça bacteriológica esterilizada no bico de
Bunsen, retirou-se uma pequena quantidade do microrganismo da colônia e o
inoculou no meio contendo Ágar Fenilalanina. Em seguida, este meio foi incubado a
35ºC por aproximadamente 24 horas.
3.6 Ágar Uréia
O crescimento neste meio fundamenta-se na capacidade de alguns
microrganismos utilizarem a uréia como fonte de energia, uma vez que apresentam
a enzima urease, capaz de converter esse substrato em produtos alcalinos, e assim
elevam o pH do meio, causando mudança de cor (de laranja para rosa- violeta), em
caso de positividade.
A inoculação é realizada com o auxílio de uma alça bacteriológica e ao retirar
o microrganismo da colônia, este é semeado ao longo do tubo partindo da base
para a extremidade, de maneira sinuosa. O meio inoculado é então incubado em
estufa a 35ºC por aproximadamente 24 horas.
3.7 Ágar Citrato
O princípio desse meio é verificar a capacidade da bactéria de utilizar o
citrato de sódio como única fonte de carbono, juntamente com sais de amônia,
alcalinizando o meio. A cor original do meio é verde, que permanece inalterada nos
casos em que o resultado é negativo, entretanto, se positivo, a coloração se torna
azul e há crescimento da bactéria.
Dessa forma, com o auxílio de uma agulha esterilizada no bico de Bunsen,
retirou-se uma pequena quantidade do microrganismo da colônia e o inoculou no
fundo até a superfície do meio por espalhamento.
3.8 Ágar TSI
O meio TSI (Triple Sugar Iron – Triplo Açúcar Ferro) contém 0,1% de glicose,
1,0% de lactose e 1,0% de sacarose, bem como o indicador vermelho de fenol
utilizado para detectar a fermentação de carboidratos e o sulfato de ferro para a
detectar a produção de sulfato de hidrogênio (indicado pela cor preta na base do
tubo). Se o microrganismo inoculado fermentar um dos 3 carboidratos citados, o
indicador passa de vermelho para amarelo, devendo também observar a parte
aeróbica (porção inclinada) e a parte anaeróbia (fundo) do tubo.
Diante disso, as interpretações que podem ser feitas com os seguintes
resultados são:
1. Tubo totalmente vermelho: Sem crescimento aparente.
2. Ápice vermelho e base amarela: Fermentação apenas da glicose
(lactose e sacarose negativos);
3. Ápice amarelo e base amarela: Fermentação da glicose + lactose e/ou
sacarose (2 ou 3 açúcares);
4. Presença de gás (CO²): Bolhas ou meio fragmentado;
5. H²S positivo: Presença de precipitado negro na base do meio, sendo a
base sempre considerada ácida (amarela).
Assim, coletou-se, com a agulha esterilizada, uma amostra do microrganismo
em cultura e o inoculou no fundo até a superfície do meio por espalhamento.
Posteriormente, a semeadura para incubar por aproximadamente 24 horas.
3.9 Ágar SIM
O meio SIM é utilizado para identificar microrganismos que produzem o Ácido
Sulfídrico ao utilizarem Cisteína como fonte de energia, tendo como revelador o
Tiossulfato Ferroso, que forma um precipitado negro chamado de Sulfato Ferroso.
Além disso, o meio é diferencial para bactériascapazes de degradar o aminoácido
triptofano, que ao reagir com o reagente de Kovacs, o indol forma um halo de cor
rosa, que indica a positividade do teste. Outro aspecto inerente a esse meio é a
capacidade de identificar microrganismos com motilidade, identificado por uma
marca branca na região onde os microrganismos foram inoculados.
O microrganismo é inoculado com auxílio de uma agulha de inoculação, com
a qual se retira uma porção de microrganismo da colônia e esta é enfiada
rapidamente no meio sólido. Após este procedimento, o meio é incubado na estufa
por aproximadamente 24 horas.
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Coloração de Gram
No microscópio foram observados bacilos isolados ou em pares com a coloração
rósea, indicando negativo para a coloração de Gram, devido a existência de
diferentes graus de permeabilidade na parede dos microrganismos Gram-positivos e
Gram-negativos. Estes últimos, por apresentarem uma parede celular composta
predominantemente por ácidos graxos (lipopolissacarídeos e lipoproteínas), são
descoradas pelo álcool-cetona, após perderem o complexo iodo-pararosanilina,
assumindo a cor da fucsina, corante de fundo.
Imagem 1: Bacilos Gram-negativos.
4.2 Ágar Sangue
Após retirar a placa da incubação observou-se que a mesma apresenta um
padrão de hemólise γ-hemolítico.
a) b)
Imagem 2: a) Meio Ágar Sangue sem o microrganismo; b) Meio Ágar Sangue cultivado com o
microrganismo após aproximadamente 24h de incubação à 35ºC.
4.3 Ágar MacConkey
Ao retirar da estufa, após o tempo de incubação, foi possível observar
mudança de cor nas colônias, devido à diminuição do pH do meio, indicando que o
microrganismo é fermentador de lactose.(O indicador de pH existente no meio,
vermelho neutro, vira vermelho e deixa as colônias rosas.)
Imagem 3: a) Meio Ágar MacConkey sem o microrganismo; b) Meio MacConkey apresentando
crescimento microbiano fermentador de lactose
4.4 Caldo VP
Após retirar o tubo da incubação, adicionou-se as soluções de α-naftol e
KOH, e observou-se a formação de uma coloração vermelha no tubo, ou seja, o
resultado deu positivo para a produção de produtos finais ácidos ou neutros
resultantes da fermentação da glicose.
a) b)
Imagem 4: a) Caldo VP sem o microrganismo; b) Caldo VP cultivado com o microrganismo
após aproximadamente 24h de incubação à 35ºC.
4.5 Ágar Fenilalanina
Após retirar o tubo da incubação, adicionou-se a solução de cloreto férrico a
10% e, após esperar 5 minutos, não se observou a formação de uma coloração
esverdeada na superfície, ou seja, o resultado deu negativo para a formação de
ácido pirúvico a partir da fenilalanina.
a) b)
Imagem 5: a) Meio Àgar Fenilalanina sem o microrganismo; b) Meio Ágar Fenilalanina
cultivado com o microrganismo após aproximadamente 24h de incubação à 35ºC.
4.6 Ágar Uréia
Ao retirar da estufa, após o tempo de incubação, foi observado a presença da
enzima urease, capaz de converter os substratos em produtos alcalinos, que
aumenta o pH do meio e muda sua coloração de amarelo para rosa.
Imagem 6: a) Meio Àgar Uréia antes da inoculação; b) Meio Ágar Uréia após semeadura
apresentando microrganismo que possui a enzima urease.
4.7 Ágar Citrato
Após retirar o tubo da incubação, observou-se a coloração do meio estava
completamente azul, indicando que o microrganismo utilizou o citrato de sódio como
única fonte de carbono, juntamente com sais de amônia, alcalinizando o meio.
a) b)
Imagem 7: a) Meio Ágar Citrato sem o microrganismo; b) Meio Ágar Citrato cultivado com o
microrganismo após aproximadamente 24h de incubação à 35ºC.
4.8 Ágar TSI
Após retirar o tubo da incubação, observou-se a coloração do meio estava
completamente amarela, indicando que o microrganismo inoculado fermentou
glicose, lactose e sacarose; a ausência de precipitado negro na base do tubo, o que
indica resultado negativo para a produção de H²S. Além disso, não houve a
formação de bolha ou a fragmentação do meio, demonstrando que o microrganismo
não produziu CO².
a) b)
Imagem 8: a) Meio TSI sem o microrganismo; b) Meio TSI cultivado com o microrganismo
após aproximadamente 24h de incubação à 35ºC.
4.9 Ágar SIM
Após o período de incubação do microrganismo e posterior adição do
reagente de Kovacs, observou-se que o teste foi negativo para produção de Sulfeto
Ferroso e pra degradação de triptofano, mas deu positivo para motilidade.
Imagem 9: a) Meio SIM antes da inoculação; b) Meio SIM após um dia de inoculação
apresentando motilidade do microrganismo.
5 CONCLUSÃO
Diante dos resultados obtidos, como pode ser visto na tabela abaixo, seria
necessário realizar novamente as provas bioquímicas em Ágar Uréia e em Ágar
SIM, pois o microrganismo utilizado para realização das inoculações havia sido
identificado como pertencente ao gênero Klebsiella e, como nenhuma outra
enterobactéria se encaixa com o resultados obtidos, pode-se suspeitar de algum
erro cometido durante os cultivos em ambos os meios.
Teste realizado Resultado obtido
Coloração de Gram Bacilos Gram negativos
Ágar Sangue Houve crescimento e observou-se padrão
γ-hemolítico
Ágar MacConkey Positivo
Caldo Voges-Proskauer (VP) Positivo
Ágar Uréia Positivo
Ágar Citrato de Simmons Positivo
Ágar Tríplice Açúcar Ferro (TSI) Positivo para fermentação de glicose e
sacarose ou glicose e lactose
Ágar Sulfeto Indol Motilidade (SIM) Positivo apenas para motilidade
Ágar Fenilalanina Negativo
REFERÊNCIAS
BRASIL. Agência Nacional de Vigilância Sanitária.– ANVISA. Manual de
Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção em Serviços de Saúde,
Brasília, 2004.
FABRÍCIO GALVÃO DE BRITO (Minas Gerais). Mbiolog Diagnósticos Ltda.
Instruções de Uso: Agar TSI. 2010.
Rocha da Silva, Cecília. Manual de Prática. Identificação de Enterobacteriaceae,
Fortaleza, 2019
BIOMEDICINA PADRÃO. Técnicas de semeadura. Disponível em:
<https://www.biomedicinapadrao.com.br/2012/09/tecnicas-de-semeadura.html>.
Acesso em: 24 abr. 2019.