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APOSTILA DE HISTOLOGIA – CITOLOGIA – EMBRIOLOGIA BÁSICA Profª: Roseli Leite de Freitas Histologia, Citologia e Embriologia Prof.: Roseli - 1 - INTRODUÇÃO À HISTOLOGIA Histologia É definida como sendo a ciência, parte da biologia, que estuda os tecidos. O termo histologia foi usado pela primeira vez em 1819 por Mayer, que aproveitou o termo “tecido” que Bichat (anatomista francês) instituiu, muito tempo antes (por volta de 1800), para descrever macroscopicamente as diferentes texturas encon- tradas por ele no corpo animal. Mayer fez a conjunção do termo histos = tecido e logos = estudo. E o que é tecido? Tecido Há vários conceitos para tecido. É possível encontrar alguns autores que definem tecido como sendo um conjunto de células que apresentam mesma forma, mesma função e mesma origem embrionária. Mas, este conceito não possui muita sustentação histológica. Se analisarmos, por exemplo, o sangue, veremos que a forma de uma hemácia (disco bicôncavo, anucleado na maioria dos animais domés- ticos) é totalmente diferente de um neutrófilo (ovóide, quando no sangue, com nú- cleo lobulado). Quanto à função destas células: a hemácia transporta oxigênio e gás carbono, enquanto o neutrófilo é uma célula fagocitadora. Portanto, vemos que apesar de pertencerem ao mesmo tecido elas não têm a mesma forma e tão pouco a mesma função. Ainda outro exemplo nos remete a raciocinar: no tecido ósseo os osteócitos são células arredondadas cuja função é contribuir na manutenção da matriz óssea, enquanto os osteoclastos são células cuja forma varia muito, pois se movem através da emissão de “pseudópodes” e são responsáveis pela reabsorção óssea. Portanto, nem possuem a mesma forma e muito menos a mesma função. Poderíamos discorrer muito mais, mostrando inúmeros exemplos em que se consta- ta que a grande maioria dos tecidos é constituída por células que têm funções e forma diferentes. Já quanto à afirmação de que as células de um tecido apresentam mesma origem embrionária, de fato esta afirmação é aplicável. As células que compõem um tecido normalmente apresentam mesma origem embrionária. Assim, como conceituar tecido? Tecido é um conjunto de células que apresentam a mesma função geral e a mesma origem embrionária. Diríamos a mesma função geral, pois um tecido apresenta uma ou mais funções gerais. Por exemplo: os epitélios de for- ma geral apresentam como função principal revestir as superfícies corpóreas, assim sua função geral é revestir uma superfície. No epitélio, como, por exemplo, o da traquéia, tem-se a células ciliadas e as células caliciformes. Ambas apresentam formas e funções diferentes, mas as duas realizam a função geral de revestir. Origem Embrionária dos Tecidos Neste ponto devemos começar do início: quando o espermatozóide (gameta masculino) e o óvulo (gameta feminino), ambas as células apresentando a metade do número de cromossomos (portanto haplóides) de uma célula somática da espé- cie, encontram-se em ambiente propício – que pode ser o útero ou em meio de cultura – ocorre a fecundação. As duas células após a fecundação formam uma cé- lula, o zigoto, que é uma célula diplóide (como o mesmo número de cromossomos de qualquer célula somática da espécie). Formado o zigoto ele passa a sofrer su- cessivas mitoses, processo denominado de clivagem. Uma célula forma duas, as duas formam quatro, as quatro formam oito e assim sucessivamente. Por volta do sétimo dia (na maioria dos animais domésticos) pós-fecundação o que se vê é um amontoado de células envoltas por uma membrana translúcida. Cada célula é cha- mada de blastômero, sendo células totipotentes (ainda não diferenciadas e com a potencialidade de originar qualquer uma das células do corpo animal), e a mem- brana envoltória é chamada de zona pelúcida. Este estágio do embrião por se as- semelhar muito a uma amora é chamado de mórula. Os blastômeros sintetizam um líquido, rico em ácido hialurônico, que vai se acumulando dentro do embrião e Histologia, Citologia e Embriologia Prof.: Roseli - 2 - por volta do oitavo/nono dia forma-se uma pequena cavidade no interior do embri- ão, a blastocele. Neste momento o embrião passa a se chamar de blástula ou blastocisto. Posteriormente, a cavidade aumenta e pela expansão interna do em- brião a mórula é rompida (blastocisto eclodido). Esta massa celular começa a se dobrar para dentro de si mesma e aí se forma uma cavidade central chamada de gastrocele, neste momento forma-se a gástrula. Nesta fase é possível identificar os dois primeiros tecidos embrionários – ectoderma e endoderma. O ectoderma é folheto embrionário externo e o endoderma o folheto embrionário interno. Um pou- co depois, a partir do endoderma forma-se o folheto médio, o mesoderma. A par- tir daí começa haver diferenciação celular e formação dos tecidos animais. Por e- xemplo: do ectoderma forma-se o tecido nervoso e alguns epitélios de revestimen- to; já do mesoderma origina-se a maioria dos tecidos conjuntivos e musculares; do endoderma alguns epitélios de revestimento. Os tecidos embrionários são três (ectoderma, mesoderma e endoderma) e deles se formam todos os tecidos do corpo animal, mas a propósito quantos e quais são os tecidos encontrados no corpo animal? Tecidos Fundamentais Macroscopicamente Bichat, por volta de 1800, conseguiu identificar 21 dife- rentes tipos de tecidos. Mas com o advento do microscópio foi possível identificar muitos outros tecidos (aproximadamente 41). Mas todos estes tipos podem ser a- grupados em quatro diferentes tecidos, chamados de tecidos fundamentais: os te- cidos epiteliais, os tecidos conjuntivos, os tecidos musculares e o tecido nervoso. Histologia, Citologia e Embriologia Prof.: Roseli - 6 - Classificação Geral dos Tecidos 1. Tecido Epitelial 1.1. Tecido Epitelial de Revestimento Quanto ao número de camadas de células Quanto à forma das células superficiais 1.1.1.1. Pavimentoso 1.1.1. Simples 1.1.1.2. Cúbico 1.1.1.3. Cilíndrico ou prismático 1.1.2. Pseudo-estratificado 1.1.2.1. Cilíndrico ciliado 1.1.3. Estratificado 1.1.3.1. Pavimentoso 1.1.3.1.1. Queratinizado 1.1.3.1.2. Não-queratinizado 1.1.3.2. Cúbico 1.1.3.3. Cilíndrico 1.1.3.4. De transição 1.2. Tecido Epitelial Glandular Quanto à complexidade dos ductos Quanto à forma da parte secretora 1.2.1.1.1. Reta 1.2.1. Simples 1.2.1.1. Tubular 1.2.1.1.2. Enovelada 1.2.1.1.3. Ramificada 1.2.1.2. Acinar ou Alveolar 1.2.1.3. Túbulo-acinar 1.2.2. Composta 1.2.2.1. Tubular 1.2.2.2. Acinar ou Alveolar 1.2.2.3. Túbulo-acinar Histologia, Citologia e Embriologia Prof.: Roseli - 7 - 2. Tecidos Conjuntivos 2.1. Propriamente dito de propriedades gerais 2.1.1. Tecido Conjuntivo Frouxo 2.1.2. Tecido Conjuntivo Denso 2.1.2.1. Modelado2.1.2.2. Não-modelado 2.2. Propriamente dito de propriedades especiais 2.2.1. Elástico 2.2.2. Mucoso 2.2.3. Reticular 2.2.3.1. Linfóide 2.2.3.2. Mielóide 2.2.4. Adiposo 2.2.4.1. Branco ou Unilocular 2.2.4.2. Pardo ou Multilocular 2.3. De sustentação 2.3.1.1. Hialino 2.3.1. Cartilaginoso 2.3.1.2. Elástico 2.3.1.3. Fibroso 2.3.2. Ósseo 2.3.2.1. Compacto 2.3.2.2. Esponjoso 2.3.3. Cimento e Dentina 2.4. De Transporte 2.4.1 Sangue 2.4.2. Linfa 2.4. Tecido Muscular 2.4.1. Tecido muscular estriado esquelético 2.4.2. Tecido muscular estriado cardíaco 2.4.3. Tecido liso 2.5. Tecido Nervoso 2.5.1. Tecido Nervoso propriamente dito 2.5.2. Neuróglia Histologia, Citologia e Embriologia Prof.: Roseli - 5 - MÉTODOS DE ESTUDOS HISTOLÓGICOS Vários são os métodos de estudos dos tecidos, variando do estudo dos tecidos in vivo até aqueles que utilizam os tecidos mortos. O método mais utilizado em Histologia é o prepa- rado histológico permanente (lâmina histológica) estudado em microscópio óptico. A seguir descrevemos as etapas de produção de uma lâmina histológica: 1ª Etapa: Coleta da Amostra A primeira etapa de todo o processo de preparação de uma lâmina histológica consiste em coletar a amostra, ou seja, obtê-la e isto pode ser feito de cinco diferentes maneiras: a) Biópsia cirúrgica – obtenção da amostra de tecido ou órgão através de uma inci- são cirúrgica; b) Biópsia endoscópica – usada para órgãos ocos (estômago, intestino, etc) através de endoscopia; c) Biópsia por agulha – a amostra (cilindro) é obtida pela punção do órgão (fígado, pul- mão), sem precisar abrir a cavidade natural; d) Cirurgias amplas (radicais) – a amostra corresponde a peças grandes (ex. tumores) ou órgãos (ex. mama, útero); e) Necrópsia – procedimento utilizado para estudo anatômico de todos os órgãos ou teci- dos, no animal morto. As peças cirúrgicas grandes ou de autópsia devem ser clivadas previamente para reduzir sua espessura permitindo a penetração fácil do fixador. O princípio fundamental de clivagem é que o fragmento possua em torno de 4 mm de espessura. 2ª Etapa: Fixação A base de uma boa preparação histológica é a fixação que deve ser completa e adequa- da. Para tanto é preciso tomar algumas precauções que são obrigatórias: a) O material coletado deve ser imerso rapidamente no fixador; b) O volume de fixador deve ser no mínimo dez vezes (10 X) maior que o volume da peça coletada. Os principais objetivos da fixação são: a) Inibir ou parar a autólise tecidual; b) Coagular ou endurecer o tecido e tornar difusíveis as substâncias insolúveis; c) Proteger, através do endurecimento, os tecidos moles no manuseio e procedimentos técnicos posteriores; d) Preservar os vários componentes celulares e tissulares; e) Melhorar a diferenciação óptica dos tecidos; f) Facilitar a subseqüente coloração. A fixação pode ser física (utilizando-se o calor ou o frio) ou química. A fixação em His- tologia é quase exclusivamente química, onde substâncias (fixadores) são utilizadas com a principal função de insolubilizar as proteínas dos tecidos. Os fixadores podem agir precipitando as proteínas ou as coagulando, assim temos como principais fixadores: a) Que precipitam as proteínas: cloreto de mercúrio e ácido pícrico; b) Que coagulam as proteínas: aldeído fórmico (o mais utilizado, conhecido como fixador universal), tetróxido de ósmio e o aldeído glutárico. Com o intuito de se conseguir o fixador ideal, os histologistas elaboraram diversas mis- turas fixadoras como, por exemplo, o líquido de BOUIN e o líquido de HELLY. Histologia, Citologia e Embriologia Prof.: Roseli - 6 - O formol a 10% para microscopia óptica e o aldeído glutárico em solução de 2 a 6% para microscopia eletrônica são os fixadores simples mais comumente utilizados. O tempo de fixação varia de acordo com o tamanho da peça, constituição do tecido, po- der de fixação do fixador, objetivos a pesquisar e temperatura ambiente. No entanto, de forma geral, tendo o fragmento, a ser fixado, uma espessura de 4 mm o tempo mínimo de fixação é de doze (12) horas. Observação: Para que se possa examinar o tecido ósseo ou tecido com áreas de calcificação, deve-se antes de processá-lo, incluí-lo e cortá-lo, proceder à descalcificação que consiste na remoção dos sais de cálcio que se encontram depositados nos tecidos orgânicos sem alteração da sua estrutura celular. Os ossos ou outros materiais calcificados devem ser cortados em pequenos pedaços (cerca de 4 mm) com serra adequada, antes da fixação. Depois de completada a fixação, colo- ca-se o material na solução descalcificadora. Geralmente são empregados como agentes des- calcificadores os seguintes ácidos: nítrico, fórmico, tricloacético, clorídrico, pícrico, EDTA, sul- fossalicílico. Não existe uma solução descalcificadora ideal. A única diferença entre as várias soluções é que umas agem mais rapidamente do que as outras. O ácido usado deve ser com- pletamente removido do tecido depois de terminada a descalcificação. Isto é feito pela lava- gem abundante e cuidadosa em água corrente ou álcool, conforme o descalcificador emprega- do. Esta lavagem deve ser no mínimo por quatro horas. 3ª etapa: Processamento Após a preservação do tecido, a etapa seguinte consiste em prepará-lo para o exame microscópico. Com a finalidade de permitir que a luz o atravesse, cortes muito delgados de tecido têm que ser feitos. Infelizmente, embora o processo de fixação endureça o tecido, o material não se torna suficientemente firme ou coeso para permitir cortes delgados perfeitos. Para que esse grau de firmeza seja atingido, o tecido deve ser completamente impregnado com algum meio de sustentação que manterá juntas as células e as estruturas intercelulares. Os materiais de sustentação usados são denominados materiais de inclusão. Certos materiais de inclusão, tais como “Carbowax” e a gelatina são solúveis em água e os tecidos não precisam ser desidratados antes do uso. Os materiais mais comumente usados são substâncias semelhantes à parafina que não são miscíveis com água. Quando estas subs- tâncias forem utilizadas os tecidos terão que ser desidratados antes da inclusão. 4ª Etapa: Desidratação Antes que um material de inclusão, tal como a parafina, possa penetrar no tecido seu conteúdo em água deve ser removido. A desidratação é levada a efeito imergindo o bloco de tecido em concentrações crescentes de álcool etílico. O álcool é o agente mais comumente uti- lizado neste processo, sendo empregado numa série crescente (70% - 80% - 90% - 100%) para se evitar a retração pronunciada do tecido ocasionando lesões estruturais da célula de caráter irreversível. O álcool tem a vantagem de endurecer mais o tecido. O volume de álcool deverá ser 10 a 20 vezes maior que o volume da peça. Várias são as substâncias utilizadas como agentes de desidratação: álcoois etílico, butí- lico, metílico e isopropílico, a acetona, o éter, o clorofórmio e o óxido propileno. O álcool etílico é o mais utilizado em técnicade rotina. 5ª Etapa: Diafanização (Clarificação) A impregnação do tecido com meio de inclusão é impossível nesse estágio porque as substâncias semelhantes à parafina usadas para a inclusão não se misturam com o álcool. O tecido deve, portanto, ser imerso em um produto químico e que o álcool e a parafina sejam solúveis. Assim a diafanização consiste na infiltração do tecido por um solvente da parafina que seja ao mesmo tempo desalcolizante. A parafina não se mistura com água e nem com ál- cool. Ambos devem ser completamente removidos para que a parafina possa penetrar eficien- temente no tecido. O xilol é comumente utilizado. Tal produto químico é muitas vezes chama- do de agente clarificador porque torna o tecido semi-translúcido, quase transparente. Entre Histologia, Citologia e Embriologia Prof.: Roseli - 7 - os reagentes mais utilizados na fase de diafanização podemos citar ainda: toluol, clorofórmio, óleo de cedro, benzol e salicilato de metila. A quantidade de xilol (substância mais empregada) utilizada deve ser 10 a 20 vezes o volume da peça. A duração da clarificação varia com as dimensões, a constituição do material e a temperatura. 6ª etapa: Inclusão (Impregnação) A finalidade da impregnação é eliminar completamente o xilol contido no material e a total penetração da parafina nos vazios deixados pela água e gordura, antes existentes no te- cido. Este processo serve também para preparar o material para os cortes, removendo o clari- ficante e endurecendo-o suficientemente e dando-lhe a consistência adequada para que possa ser cortado. O tecido é passado em duas trocas de parafina para assegurar a substituição de todo o agente clarificador pela parafina. Emprega-se a parafina a uma temperatura de 56 a 60º C (parafina fundida). O bloco de tecido permanecerá imerso na parafina fundida (em estufa) du- rante o tempo necessário para a completa impregnação. Posteriormente serão retirados da estufa e deixados à temperatura ambiente até que a parafina endureça, após isto o bloco de parafina com o tecido será retirado da fôrma e conduzido ao corte. Pode-se citar ainda como agentes de impregnação: celoidina, goma arábica, parafina plástica, polietileno glicol e parafi- na esterificada. 7ª etapa: Microtomia Para se obter cortes de material incluído em parafina ou por congelação é necessário um instrumento especial: o micrótomo. Os micrótomos variam de acordo com os fabricantes e tem como fundamento duas peças principais: o suporte ou mandril (onde é fixada a peça a cortar) e a navalha. O suporte é sempre encaixado a um parafuso micrométrico ou a uma es- piral metálica que o faz adiantar segundo seu eixo, em medida conhecida e que pode ser regu- lada à vontade. Esta medida tem como unidade o micrômetro que corresponde à milésima par- te do milímetro. Normalmente um micrótomo faz cortes cuja espessura varia de 1 a 50 micrô- metros, mas a espessura mais utilizada em microscopia óptica é de 4 a 6 micrômetros. Há vários tipos de micrótomos: rotativo, tipo Minot, de congelação e o destinado a trabalhos de microscopia eletrônica. 8ª etapa: Colagem do Corte à Lâmina As fitas de cortes de parafina são estiradas cuidadosamente e os cortes individuais são separados por um bisturi. Na superfície de uma lâmina de vidro é feito um ponto de aderência (normalmente com albumina de ovo) e o corte de parafina é colocado em banho-maria (água morna) de forma que as dobras provocadas pelo corte no tecido desapareçam. Após o que o corte é “pescado” com a lâmina, preparada com albumina, na qual se adere. 9ª etapa: Coloração É a técnica tintorial empregada para facilitar o estudo dos tecidos sob microscopia. A coloração é de importância fundamental em histologia, pois os tecidos não tratados têm pouca diferenciação óptica. As colorações de um modo geral se efetuam por processos físico-químicos ou puramente físicos e podem ser consideradas, segundo a modalidade, a ação, o caráter, o grau de ação, o tempo, o número de corantes e a cromatização. Quanto à cromatização, ou seja, de acordo com o número de cores conferidas às estrutu- ras pelas colorações simples ou combinadas, estas tomam a denominação de colorações mo- nocrômicas (uma cor), bicrômicas (duas cores), tricrômicas (três cores) e policrômicas (mais de três cores). Para se corar convenientemente a célula, deve-se recorrer a um método de coloração sucessiva do núcleo e do citoplasma. A combinação mais comum de corantes usada em Histologia e Histopatologia é a Hema- toxilina e Eosina (HE). A hematoxilina é um corante natural obtido da casca de pau cam- peche. Ela não é realmente um corante e deve ser oxidada em hemateína a fim de tornar-se um corante. Ademais, o corante que resulta (hematoxilina-hemateína) não tem afinidade para os tecidos. Deve ser usado um mordente, como o alumínio ou o ferro, juntamente com a mis- Histologia, Citologia e Embriologia Prof.: Roseli - 8 - tura de hematoxilina antes que ela possa corar os tecidos. A mistura cora em azul-púrpura. A eosina é um corante sintético e produz uma coloração vermelha. Nas células coradas com HE os ácidos nucléicos presentes no núcleo são corados pela hematoxilina, dando ao núcleo um tom azul-púrpura. A eosina é atraída pelos elementos bási- cos da proteína do citoplasma da célula, corando-o de róseo a vermelho. Os componentes dos tecidos que se coram prontamente com os corantes básicos são chamados basófilos; os que têm afinidade pelos corantes ácidos são chamados acidófilos. A hematoxilina comporta-se como um corante básico e, portanto, cora o núcleo de modo basófilo. A eosina é um corante ácido e cora os elementos básicos da proteína do citoplasma de maneira acidófila. Certos corantes reagem com os componentes do tecido e os coram com uma cor dife- rente da cor da solução corante. A mudança de cor do corante chama-se metacromasia. O azul-de-metileno, o azul-de-toluidina e a tionina são exemplos de corantes simples que exibem metacromasia. Com os corantes azuis a cor muda para vermelho. A coloração dos mastócitos com o azul-de-metileno constitui um bom exemplo. Os grânulos do citoplasma coram-se em vermelho-púrpura, enquanto que o resto do tecido fica azul. A causa da metacromasia não é totalmente compreendida, porém tem sido sugerido que é devido à polimerização das molécu- las do corante. Julga-se que a presença de macromoléculas com radicais eletronegativos no tecido facilita a polimerização e provoca a mudança de cor. Antes que o corte seja corado, a parafina em que ele foi incluído deve ser removida. O corte, que já foi aderido à lâmina de vidro (pescagem em banho-maria), é banhado no xilol para dissolver a parafina. Devido ao fato de muitos corantes serem solúveis em água, torna-se necessário remover o xilol do tecido e substituí-lo por água (hidratação). O corte é imerso em uma série de concentrações decrescentes de álcool etílico até que esteja hidratado. Depois que o corte estiver hidratado procede-se à coloração propriamente dita. No caso da HE, o tecido é imerso primeiramente em hematoxilina, lavado com água para retirada de excedente, depois imerso em eosina e, após isto também se faz lavagem do tecido. 10ª etapa: Montagem Depois que o corte tiver sido corado com a solução apropriada, ele é passado através de concentrações crescentes de álcool para remover, de novo, a água (desidratação). Objeti- va-se com esta desidratação aumentar a sobrevida do preparado histológico. Finalmente,o corte é banhado em xilol antes de ser montado em um meio solúvel em xilol, que é o meio de montagem (para os cortes de parafina é usado o Bálsamo de Canadá). Uma gota do meio de montagem é colocada sobre o corte e a lamínula é posicionada sobre o corte de forma delicada, de uma forma tal que o meio de montagem cubra completamente o corte. Depois a lamínula é comprimida com firmeza sobre o corte e o meio de montagem se espalha formando uma delgada película entre a lâmina e a lamínula que posteriormente vão estar firmemente aderidas uma à outra pela estabilização do meio de montagem. INTRODUÇÃO À MICROSCOPIA O estudo da Histologia depende da utilização da microscopia. Na realidade para se co- nhecer a “anatomia microscópica” dos tecidos e órgãos é necessário fazer uso do microscópio. Portanto, o aluno de Histologia deve necessariamente conhecer os fundamentos básicos da microscopia. Assim sendo, passaremos à descrição mais detalhada de um microscópio óptico, depois citaremos alguns conceitos ligados à microscopia óptica e finalizando descreveremos outros tipos de microscópicos, além do microscópio óptico. Histologia, Citologia e Embriologia Prof.: Roseli - 9 - 1. Microscópio Óptico Um microscópio óptico pode ser simples ou composto: o microscópio simples possui uma única lente e só fornece uma imagem moderadamente aumentada do objeto que se está estudando; o microscópio composto consiste de uma série de lentes e fornece um aumento muito maior. Partes de um microscópio óptico composto Um microscópio composto consiste de partes mecânicas e ópticas. A parte mecânica tem uma base que estabiliza o microscópio, uma coluna ou canhão que se estende da base para cima, e uma platina na qual é colocado o objeto a ser examinado. As partes ópticas estão presas à coluna acima e abaixo da platina e são elas: oculares, objetivas, condensador e espe- lho. Em muitos microscópios o espelho e a lâmpada estão alojados, com segurança, na base do instrumento. A ocular consiste de uma combinação de lentes que estão embutidas na extremidade superior do tubo do microscópio. O valor gravado tal como 12,5 x indica o aumento da ocular. As objetivas (pode haver três, quatro ou cinco) são uma combinação de lentes presas à ex- tremidade inferior do tubo do microscópio. O valor gravado tal como 10x, indica o aumento da objetiva. Uma objetiva 10x usada em combinação com uma ocular 12,5x dá um aumento total de 125x. As diferentes objetivas atarraxam-se ao revólver, que por sua vez está preso à ex- tremidade inferior do tubo do microscópio. Troca-se uma objetiva por uma outra pela rotação do revólver, de modo que quando uma objetiva é substituída outra entra em seu lugar. O condensador é uma combinação de lentes situada abaixo da platina. Ele projeta um cone de luz sobre o objeto que está sendo observado. O condensador pode ser levantado ou abaixado por um mecanismo de cremalheira, de sorte que a luz pode ser focalizada no objeto. A passagem de raios marginais no condensador é impedida pelo diafragma – íris. O espelho que está situado abaixo do condensador reflete os raios luminosos emanados da fonte de luz. Situado entre o espelho e o condensador existe um porta-filtro móvel. Como Funciona o Microscópio Óptico? O objeto a ser estudado é montado em uma lâmina de vidro, que é colocada na platina do microscópio. O objeto é posto em posição sob a objetiva seja manualmente ou usando a platina mecânica. Faz-se o foco correto do objeto levantando ou abaixando a platina e levan- tando ou abaixando o tubo do microscópio, ao qual estão atarraxados a ocular e as objetivas. Os raios luminosos aqui são defletidos e convergem para o objeto. Então passam através das lentes da ocular e são novamente defletidos. Emergindo da ocular, os raios luminosos são diri- gidos para a pupila do olho, após o que eles incidem sobre a retina. Se o olho está em repou- so, como na visão a longa distância, deve-se obter uma clara imagem do objeto quando a ob- jetiva estiver no foco exato. A posição das lentes do microscópio em relação ao objeto pode ser mudada ajustando os focos fino e grosso. A focalização grossa produz movimentos amplos, enquanto que a fina é um mecanismo delicado que se faz com pequenos movimentos (peque- nos e grandes aumentos). Um microscópio óptico composto é, assim, um sistema de aumento em dois estágios. Primeiro o objeto é aumentado pelas lentes da objetiva e depois novamente pelo segundo con- junto de lentes da ocular. O aumento total é o produto dos aumentos da objetiva pelo da ocu- Histologia, Citologia e Embriologia Prof.: Roseli - 10 - lar. Um microscópio composto produz uma imagem de cabeça para baixo e invertida lateral- mente. A inversão é facilmente demonstrada: se o espécime é movido para um lado, a ima- gem move-se no sentido contrário. Aumento, Definição, Resolução e Profundidade do Foco Grandeza (Aumento) – é o aumento do tamanho da imagem comparada com o obje- to. O aumento total de um microscópio composto, como anteriormente explicado, é o grau de aumento da imagem produzido pelas lentes objetivas multiplicado pelo aumento dado pelas lentes da ocular. Usar sempre uma objetiva de pequeno aumento quando se começar o exame de um preparado; ele lhe permitirá observar um campo mais amplo e é útil para uma visão panorâmica. Definição – é a nitidez da imagem quando o sistema de lente foi corretamente ajusta- do. A imagem borrada geralmente significa que as lentes foram incorretamente ajustadas ou que elas estão sujas. Outra ocorrência comum é colocar inadvertidamente a lâmina de vidro na platina com o lado errado para cima. Limite de Resolução – é a capacidade de um sistema óptico de separar detalhes. Mais precisamente, o limite de resolução é a menor distância que deve existir entre dois pontos pa- ra que apareçam individualizados. Por exemplo: duas partículas separadas por 0,3 micrôme- tros aparecerão individualizadas quando examinadas num sistema de 0,2 micrômetro. Mas, se forem examinadas num sistema com limite resolutivo de 0,5 micrômetro, aparecerão fundidas, como se fossem uma só partícula, de maior tamanho. O limite de resolução das melhores len- tes utilizadas nos microscópios ópticos comuns é de 0,2 micrômetro. Portanto, o que determina a riqueza de detalhes da imagem fornecida por um sistema óptico é seu limite resolutivo e não seu poder de aumentar de tamanho os objetos. A proprie- dade de aumentar só tem valor prático se for acompanhada de um aumento paralelo do poder resolutivo. O limite resolutivo depende essencialmente da objetiva. A ocular apenas aumenta de tamanho a imagem projetada no seu plano de foco pela objetiva. Uma das características mais importantes de uma objetiva é a sua abertura numéri- ca, pois o limite resolutivo depende principalmente desta e do comprimento de luz utilizada. A abertura numérica vem gravada nas objetivas e sua determinação cabe ao fabricante das len- tes. Ela é igual ao menor índice de refração (n) interposto entre o corte e a lente objetiva, multiplicado pelo seno do semi-ângulo de abertura (u). Teremos então: Abertura Numérica (AN) = n x seno de u. Já o Limite de Resolução da objetiva é dado pela fórmula: LR = K x Y , AN onde K é uma constante estimada em 0,61 e Y o comprimento de onda. Geralmente toma-se o comprimento da onda da faixa verde-amarelo (0,55 micrômetro)para o cálculo do limite reso- lutivo, por ser o olho humano mais sensível a essas cores do que as quaisquer outras. Então, substituindo-se as letras pelos seus respectivos valores, temos: LR = 0,61 x 0,55/AN A análise da fórmula mostra que o limite de resolução é diretamente proporcional ao comprimento de onda e inversamente proporcional à abertura numérica da objetiva. O exemplo abaixo nos dará a exata compreensão da importância da abertura numérica e também que a utilização de oculares de grane aumento não traz qualquer vantagem. Admi- tamos as duas seguintes combinações de lentes: A – objetiva de 10x de AN 0,15 com ocular 20x. Aumento de 200x. B – objetiva de 40x de AN 0,65 com ocular 5x. Aumento de 200x. Fazendo-se os cálculos, verifica-se que, no exemplo A, o limite de resolução será de 2,2 micrômetros, enquanto que no exemplo B será muito mais rica em detalhes, pois o seu limite de resolução é de 0,5 micrômetro. Profundidade de foco – é a propriedade da lente de revelar estruturas que estão relacionadas umas às outras, mas que se encontra em diferentes níveis no espécime. A pro- fundidade do foco diminui à medida que o poder de aumento e abertura numérica aumentam. Histologia, Citologia e Embriologia Prof.: Roseli - 11 - Manejo do Microscópio Óptico 1. Segurar o microscópio pelo braço ou coluna; 2. Acender a lâmpada; 3. Girar o revólver de maneira que a objetiva de menor aumento fique no eixo óptico; 4. Colocar o condensador em sua posição mais alta; 5. O diafragma deve estar completamente aberto; 6. Olhar através da ocular e regular a intensidade de luz; 7. Colocar a lâmina a ser examinada na platina, presa ao charriot. A face da lâmina provida de lamínula ou esfregaço deverá ficar voltada para cima. 8. Focalizar o objeto usando inicialmente o parafuso macrométrico para abaixar a objetiva, olhando para ela, até que a mesma toque ou se aproxime bastante da lâmina. Então o- lhando pela ocular guiar o parafuso em sentido contrário, deslocando a objetiva para ci- ma, lentamente, até focalizar; 9. Melhorar o foco usando o parafuso micrométrico; 10. Para trocar as objetivas, guiar o revólver e mudar para uma objetiva de maior aumento com cuidado para que a mesma não atinja a lâmina ou quebre a lamínula. De modo geral, as objetivas secas são parafocais, isto é, se o objeto está focalizado com uma estará mui- to perto de sê-lo com as outras. No entanto para evitar danos, o melhor é elevar um pou- co o tubo (com o parafuso macrométrico) antes de mudar para outra objetiva de maior aumento; 11. Se for necessário abaixar ou levantar o condensador, abrir ou fechar o diafragma para obtenção da melhor imagem possível. Existe um parafuso geralmente abaixo da platina para regular a distância entre o condensador e a platina e um dispositivo para aumentar e diminuir a abertura do diafragma; 12. Para o uso da objetiva de imersão (quando determinado) deve-se observar o seguinte: a) Colocar o detalhe a ser examinado no centro do foco com o auxílio da objetiva de médio aumento; b) Aumentar a distância entre a platina e a objetiva (use o parafuso macrométrico); c) Deposite uma gota de óleo de cedro sobre a preparação, no foco iluminado; d) Tocar a gota com a objetiva de imersão, olhando lateralmente com muita cautela; e) Olhando pela ocular procure lentamente o foco com o parafuso micrométrico; f) Após o uso, limpar a objetiva de imersão com xilol que deve ser prontamente removido para evitar o deslocamento das lentes. E tenha cuidado para evitar que o óleo de imersão toque outras objetivas; g) Quando trabalhando com um só olho (microscópio monocular) manter os dois olhos aber- tos, pois permitirá maior atenção e evitará fadiga. O Que Nunca Deve Ser Feito 1. Nunca mergulhe as objetivas em líquido para limpá-las, isto pode danificá-las permanen- temente; 2. Nunca troque para uma objetiva de maior aumento sem antes baixar a mesa; 3. Nunca tente fazer consertos no seu microscópio. Isto exige pessoa qualificada; 4. Nunca tente desmontar as oculares e objetivas; 5. Nunca se retire do laboratório sem “guardar” seu microscópio; 6. Nunca troque peças do seu microscópio por outras de outro microscópio. Histologia, Citologia e Embriologia Prof.: Roseli - 12 - 2. Outros Tipos de Microscópios Microscópio de Contraste de Fase Microscopia de Luz Contraste de Fase Quando um fragmento de tecido não corado é examinado com um microscópio óptico comum, a estrutura minuciosa não pode ser visualizada. A razão disto reside no fato de que os índices de refração dos componentes celulares são muito semelhantes, resultando em falta de contraste. O microscópio de fase é um instrumento que converte diferenças do índice de refra- ção que não podem ser vistas, em diferenças de intensidade que se tornem visíveis. As ondas de luz que atravessam os componentes celulares de densidades ópticas dife- rentes assim o farão em diferentes velocidades. Desse modo, as ondas luminosas que atraves- sam núcleos, mitocôndrias e inclusões celulares emergirão em tempos diferentes e em fases diversas, de um elemento em relação ao outro. Existem aberturas especiais em placas que absorvem e mudam as fases situadas dentro do condensador e das lentes objetivas do microscópio de contraste de fase que convertem di- ferenças de fases em intensidade diferentes. O microscópio de fase é particularmente útil no estudo dos tecidos não-corados e de células vivas. Microscópio de Interferência O microscópio de interferência usa dois feixes de luz, que passam através do espécime. Um feixe passa através do objeto que está sendo estudado, o segundo passa através de um outro, uma área neutra. Os feixes separados são então combinados em uma imagem plana. Devido ao fato de o objeto estudado ter uma densidade óptica maior do que a área neutra, o feixe que o atravessa terá que ser retardado ou interferido em menor extensão do que o feixe que atravessou a área neutra. O grau de interferência pode ser usado para medir o índice de refração, a refração e a massa seca por unidade de área do projeto. Microscópio de Polarização Polarização é um fenômeno que ocorre quando a luz passa através de certas substân- cias, tais como os cristais, e é dividida, de modo que emergem dois raios luminosos derivados Histologia, Citologia e Embriologia Prof.: Roseli - 13 - de um só. Essas substâncias têm dois índices de refração que são chamados de birrefrigentes. No microscópio de polarização a luz é polarizada embaixo da platina do microscópio por um prisma de quartzo Nicol chamado polarizador. A luz polarizada passa então através do espéci- me. Um segundo prisma, chamado analisador, está localizado perto da ocular dentro do tubo do microscópio. Quando a posição do analisador e polarizador é ajustada, de modo que os fei- xes luminosos tenham um trajeto paralelo, uma imagem normal pode ser vista através da ocu- lar. Se o analisador é então rodado de modo que o seu eixo fique em ângulo reto com o polari- zador, nenhuma luz alcança a ocular e nada pode ser visto. Colocando-se um objeto amorfo (não refrigente) na platina do microscópio, com os prismas na mesma posição em ângulo reto, nada será visto, porque os raios de luz não foram divididos pelo objeto. Porém, se for colocado um objeto cristalino ou birrefringente na platina, uma imagem luminosaaparecerá em fundo escuro. Assim a fim de que materiais biológicos alterem a direção da luz polarizada e seja vi- sualizada com luz polarizada, sua estrutura submicroscópica deve ser de moléculas assimétri- cas orientadas. Fibras musculares, fibras de tecido conjuntivo e gotículas de gordura exibem birrefrigência e têm sido estudadas intensivamente com microscópio de luz polarizada. Microscópio de Fluorescência Neste tipo de microscópio a luz ultravioleta é usada para iluminar o espécime. Certas substâncias biológicas permitem luz visível quando absorvem luz ultravioleta e diz-se que exis- te fluorescência. A imagem observada aparenta ser auto-luminosa. A fluorescência pode ter lugar com compostos que ocorrem naturalmente, tais como a vitamina A ou corantes fluores- centes introduzidos no espécime. Microscópio Eletrônico de Transmissão O Microscópio Eletrônico de Transmissão (MET) difere do microscópio óptico pelo fato de usar feixe de elétrons em vez de um feixe visível de luz. Uma das grandes desvantagens do microscópio óptico é o longo comprimento da onda da luz que limita o poder de resolução má- Histologia, Citologia e Embriologia Prof.: Roseli - 14 - ximo a cerca de 0,2 micrômetro. Uma corrente de elétrons tem um comprimento de onda mui- to curto e resolução de 0,2 nanômetro pode ser obtida com microscópios modernos. No microscópio eletrônico, os elétrons são emitidos por um filamento aquecido de tungstênio chamado catódio. Em virtude de os elétrons serem partículas carregadas que pode- riam colidir com moléculas de ar e assim ser absorvidas e defletidas, todo sistema óptico do microscópio eletrônico deve operar no vácuo. O anódio é uma peça metálica com um pequeno furo no centro. Uma diferença de potencial entre e 40 e 100 KV entre o catódio e o anódio acelera os elétrons à medida que eles passam do catódio para o anódio. Atingindo o anódio, muitos elétrons passam através do furo do seu centro para formar um feixe. O feixe de elé- trons passa através de uma série de lentes eletromagnéticas iguais às lentes de vidro do mi- croscópio óptico. As lentes eletromagnéticas servem para focalizar o feixe de elétrons e a força do campo magnético produzido pelas lentes pode ser mudada alterando a quantidade de cor- rente que passa através dos espirais de fio das lentes. Dessa maneira, o condensador focaliza o feixe sobre o objeto. À medida que os elétrons abandonam o preparado, eles são focalizados na lente objetiva e se obtém uma imagem aumentada. A imagem é mais aumentada por uma ou duas lentes projetoras. Em virtude de os feixes de elétrons serem invisíveis ao olho, a ima- gem é revelada fazendo com que os elétrons sejam projetados sobre uma tela fluorescente ou uma película fotográfica. Infelizmente, os feixes de elétrons possuem um poder de penetração muito fraco, de modo que tem que ser feitos cortes muito delgados do espécime (0,02 – 0,1 micrômetro). Por serem muito finos os cortes, estes têm um contraste muito pequeno; assim eles precisam ser corados com metais pesados que absorvem elétrons (tais como o urânio e o chumbo) para aumentar o contraste. O poder de penetração dos elétrons é aumentado elevando a voltagem de aceleração. É possível agora, com voltagens de aceleração de um milhão de volts, usar cortes mais espessos (1 – 5 micrômetros) e, ao mesmo tempo, obter maior resolução. Microscópio Eletrônico de Varredura Histologia, Citologia e Embriologia Prof.: Roseli - 15 - O Microscópio Eletrônico de Varredura (MEV) examina a superfície do tecido; o feixe de elétrons não atravessa o espécime. Um feixe eletrônico estreito é dirigido sobre a superfície do espécime, varrendo-a de um lado para outro regularmente. Quando o feixe atinge a superfície do espécime esta emite elétrons secundários. Os elétrons secundários são captados por deten- tores, os quais criam um sinal elétrico, que é projetado em uma tela de televisão. O feixe de varredura, atingindo a superfície, desloca-se em sincronia com o feixe que produz a imagem no écran de televisão. Desse modo, uma imagem tridimensional da superfície do espécime pode ser construída no vídeo. Podem obter-se micrografias fotografando a imagem. O tecido é preparado para o MEV primeiro fixando-o e depois por desidratação cuidado- sa. A superfície do espécime é então revertida com uma delgada camada de metal, como o ouro, ouro-pálido, ou carbono, para ajudar a dispersão de elétrons. ESTUDO CELULAR - CITOLOGIA O organismo é composto por três diferentes elementos: células, substância intercelular e líquidos corporais. Estes incluem o sangue, a linfa e o líquido tissular intercelular. A substân- cia intercelular é o material que se situa entre as células, sustentando-as, e inclui tanto fibras constituídas de colágeno e de elastina quanto material amorfo ou substância fundamental. A característica mais comum no maioria dos cortes de tecidos é o presença de células, apesar de nem sempre ser fácil visualizar-se todo o seu contorno. As células consistem de protoplasma, incluindo o núcleo e citoplasma, envolto por uma delicada membrana plasmática, ou membra- na celular. As células variam muito em tamanho, forma e função. Algumas são altamente es- pecializadas, ou diferenciadas - por exemplo, a célula muscular é especializada para contração e a célula nervosa para condução -, mas geralmente têm múltiplas funções. Na maioria das preparações, o citoplasma mostra-se homogêneo, mas na verdade con- tém dois tipos de corpúsculos: organelas e inclusões. As organelas, componentes estruturais da célula, são permanentes, vivos, cada qual com função e estrutura específicas (geralmente vista apenas ao microscópio eletrônico). As inclusões compreendem produtos metabólicos e substâncias ingeridas, muitas presentes apenas temporariamente no citoplasma, e apesar de Histologia, Citologia e Embriologia Prof.: Roseli - 16 - freqüentemente vistas como estruturas inertes, na maior parte são provavelmente essenciais para o metabolismo celular normal. CITOPLASMA E ORGANELAS CITOPLASMÁTICAS Em muitas células, o citoplasma é especializado regionalmente, isto é, as organelas se localizam em diferentes regiões. Por exemplo, os centríolos e o aparelho de Golgi são freqüen- temente vistos próximos ao núcleo; em células que secretam proteínas, o retículo endoplas- mático granular (a basofilia citoplasmática) situa-se voltado para a base da célula (isto é, sub- nuclear), enquanto que as gotículas e os grânulos de secreção estão no citoplasma apical. Ca- da célula é envolta por uma membrana plasmática ou plasmalema, considerada também como uma organela. MEMBRANA PLASMÁTICA (CELULAR) A membrana celular é muito delgada, com aproximadamente 7,5 nm de espessura, e não pode ser vista ao microscópio óptico. A associação de material em sua superfície externa pode aumentar sua espessura aparente e torná-la visível por microscopia óptica. O plasmale- ma difere de todas as outras membranas da célula por ter um manto celular ou glicocálix, que varia em espessura e é composto de glicoproteína contendo ácido siálico. As glicoproteínas estão firmemente ancoradas na membrana plasmática. O glicocálix é formado no aparelho de Golgi e pode ser corado, por exemplo, pela técnica do ácido periódico + Schiff. A microscopia eletrônica,o plasmalema tem um aspecto trilaminar, com dois folhetos externos densamente contrastados, separados por um intervalo eletronlúcido; quimicamente acredita-se que sejam duas camadas de lipídios cobertas tanto na superfície interna quanto na externa por camadas de proteína. No entanto, algumas proteínas da membrana localizam-se entre as camadas lipídicas e provavelmente daí façam protrusão. Pequenas moléculas passam facilmente através da membrana plasmática. Moléculas maiores são carreadas por entre a membrana e para dentro da célula por um processo de pi- nocitose, quando pequenas vesículas se desprendem da membrana para o citoplasma e for- mam vesículas citoplasmáticas. Um processo similar relacionado a material particulado é cha- mado de fagocitose. O inverso - a extrusão de material - é denominado exocitose. Algumas modificações do plasmalema são visíveis por microscopia óptica. Por exemplo, em células especializadas para absorção, na borda luminal encontra-se uma série de processos em dedo de luva, regulares e intimamente dispostos chamados microvilosidades. As microvilo- sidades formam uma borda estriada ou em escova. Algumas células, como, por exemplo, a- quelas do duto do epidídimo, apresentam longas microvilosidades ramificadas chamadas este- reocílios. Na base de algumas células, como, por exemplo, as dos túbulos renais, profundas inva- ginações do plasmalema dividem o citoplasma em compartimentos nos quais estão presentes mitocôndrias alongadas. O plasmalema mostra também especializações para o contato celular. BASOFILIA CELULAR Presentes no citoplasma das células, particularmente naquelas que sintetizam ativa- mente proteínas, existem regiões que se coram com corantes básicos,como, por exemplo, em azul com hematoxilina. A microscopia eletrônica, estas áreas correspondem ao retículo endo- plasmático rugoso, ou granular, que consiste numa rede tridimensional de canais em forma de cisternas ou sáculos achatados, túbulos e vesículas, todos limitados por membranas salpicadas com ribosomas em sua superfície externa (citoplasmática). Tais membranas têm de 6 a 7 nm de espessura. Ribosomas ocorrem também livres no citoplasma. Eles têm de 15 a 25 nm de diâmetro, são formados por duas subunidades e compostos por ácido ribonucléico (ARN) e pro- teína. O papel do retículo granular e dos ribosomas na secreção de proteínas é discutido nos livros-texto de Histologia. RETÍCULO ENDOPLASMÁTICO O retículo endoplasmático liso, ou agranular, não é demonstrável por microscopia ópti- ca, mas à microscopia eletrônica, difere do retículo granular pelo fato de suas membranas formarem elementos tubulares e vesiculares de superfície lisa, não associados com ribosomas. Histologia, Citologia e Embriologia Prof.: Roseli - 17 - Estas membranas têm de 6 a 7 nm de espessura e delimitam uma luz tubular de aproximada- mente 50 nm. O retículo agranular é particularmente proeminente em muitas células secreto- ras de esteróides, tais como as do córtex adrenal, intersticiais do testículo e do corpo lúteo. Nas células hepáticas está associado com a formação e o armazenamento de glicogênio e com a síntese de colesterol; nas células do epitélio intestinal provavelmente relaciona-se com a síntese de gordura neutra. COMPLEXO DE GOLGI O complexo, ou região, de Golgi pode ser visível à microscopia óptica tanto como ima- gem “positiva” quanto “negativa”. Algumas técnicas especiais, como impregnação pela prata ou tratamento prolongado com ácido ósmico, demonstram-no como uma malha reticular de canais e vacúolos ou como uma massa irregular próxima do núcleo. Esta é a imagem positiva. Algumas vezes pode ser múltiplo. É proeminente em células secretoras de proteína, onde se revela como uma imagem “negativa” ou uma área não corada na região basófila do citoplas- ma, como, por exemplo, em osteoblastos e plasmócitos. A microscopia eletrônica, consiste numa pilha de cisternas e sáculos limitados por membrana associados a vesículas e vacúolos. As cisternas apresentam-se encurvadas com faces convexa (imatura) e côncava (madura ou secretora). O aparelho de Golgi muda constantemente, com vesículas passando para a face imatura e com vacúolos condensados deixando a face madura. Portanto, existe um “movimen- to” de membranas através de cada pilha de cisternas do Golgi. O aparelho de Golgi recebe proteína secretada no retículo granular e a condensa, por vezes adicionando carboidratos, e o material deixa o Golgi como grânulos de secreção. Forma também o glicocálix e os lisossomos. Portanto, desempenha um papel fundamental no transporte e na liberação de material secre- tado pela célula. MITOCÔNDRIAS Apesar de não serem visíveis em preparações H-E, as mitocôndrias podem ser demons- tradas por hematoxilina férrica e após coloração supravital com verde Janus B. São filiformes; ovóides ou esféricas, com aproximadamente 0,5 µm de largura e de 2 a 5 µm de comprimen- to. Elas variam em número de acordo com a atividade celular - isto é, quanto maior for a ativi- dade metabólica da célula, maior o número de mitocôndrias. A microscopia eletrônica, todas são limitadas por uma dupla membrana, com a membrana interna projetada para o centro da organela como uma série de projeções lamelares, chamadas de cristas mitocondriais. Algumas cristas têm forma tubular e vesicular. As mitocôndrias sintetizam trifosfato de adenosina (ATP) a partir de difosfato de adenosina (ADP), sendo o ATP utilizado como fonte de energia para toda a célula. Elas contêm enzimas do ciclo do ácido tricarboxilico - o sistema de transporte de elétrons e enzimas fosforilativas - e mostram uma distribuição funcional dentro da célula, isto é, são encontradas em regiões de atividade metabólica, como, por exemplo, em relação aos elementos contráteis nas células musculares e próximo às invaginações basais das células tu- bulares renais para transporte ativo. LISOSSOMOS Lisossomos são corpos pequenos, envoltos por membrana, de tamanho variável e ple- omórficos, que contêm enzimas líticas para digestão intracelular. Podem ser demonstrados, por exemplo, pela técnica de Gomori para fosfatase ácida. Geralmente são de dois tipos - li- sossomos primários, que contém enzimas recém-formadas e ainda inativas na célula, e lisos- somos secundários, que são corpos formados pela fusão de um lisossomo primário com algum outro corpúsculo vindo de dentro ou de fora da célula e no qual a digestão enzimática vem se processando ou já ocorreu. Os grânulos primários dos leucócitos neutrófilos, por exemplo, são lisossomos. Apesar dos lisossomos primários serem relativamente pequenos, geralmente cor- pos esféricos de 25 a 50 nm de diâmetro, eles podem ter até 0,8 µm. Os resíduos de uma di- gestão enzimática num lisossomo podem deixar na célula um “corpo residual”, que contém sílica e colesterol. Por exemplo, os grânulos de lipofucsina, encontrados particularmente em células envelhecidas, são corpos residuais. Os lisossomos têm um papel essencial nos meca- nismos de defesa celular. Histologia, Citologia e Embriologia Prof.: Roseli - 18 - CENTRÍOLOS OU CENTRO CELULAR Os centríolos são vistos como pequenos bastões ou grânulos, próximos do núcleo, co- mumente em par, em células na interfase, e geralmente dentro da região do Golgi ou a ela adjacente. À microscopia eletrônica, apresentam uma estrutura característica, cada um repre- sentado por um cilindro oco com 150 nm de diâmetro e 300 a 500 nm de comprimento e uma parede composta de 9 conjuntos de agregados tríplices demicrotúbulos. Os centríolos se auto- duplicam e são proeminentes durante a mitose. CÍLIOS E FLAGELOS Cílios são processos móveis que se projetam da superfície celular; geralmente são múl- tipIos, mas podem ocorrer também como elementos isolados. Os flagelos são semelhantes, porém maiores, como, por exemplo, a cauda móvel de um espermatozóide, que é um flagelo e pode ter 70 µm de comprimento. Os cílios geralmente têm de 5 a 15 µm de comprimento e 0,2 µm de diâmetro. No seu eixo, à microscopia eletrônica, existem nove agregados duplos de microtúbulos periféricos (pares de microtúbulos) com dois únicos microtúbulos centrais (isola- dos). O arranjo regular de microtúbulos perde-se próximo ao ápice. Na base de um cílio, den- tro do citoplasma apical das células, existe um corpúsculo basal estruturalmente muito seme- lhante a um centríolo, com nove agregados triplos periféricos. Feixes de material fibroso pas- sam da porção basal de cada agregado triplo para o citoplasma apical como “radículas estria- das”. Os cílios apresentam movimento ondular para propelir material líquido, como, por exem- plo, o muco, na superfície da célula. FIBRILAS - MICROCORPOS (PEROXISSOMOS) Muitas células contêm um material fibrilar, comumente invisível por microscopia óptica. Em muitas células, este material fibrilar, ou filamentoso, é composto por proteínas contráteis. Em células musculares, os feixes de filamentos ou miofibrilas são de tal tamanho que podem ser facilmente vistos ao microscópio óptico. Outras organelas que estão presentes no citoplasma são invisíveis ao microscópio ópti- co. Elas incluem microcorpos ou peroxissomos semelhantes aos lisossomos, e são encontradas nas células dos túbulos renais, nos bronquíolos, nos hepatócitos e nos odontoblastos, e contêm catalase e uratooxidase. Microtúbulos são estruturas delgadas, tubulares, com apenas 25 nm de diâmetro, com um centro eletronlúcido de 15 nm e uma parede com 5 nm de espessura composta, por sua vez, de 13 subunidades longitudinais. Ocorrem em muitas células e são encontrados em cílios e centríolos. Os microtúbulos servem como um tipo de citoesqueleto, estando envolvidos nas mu- danças da forma celular, enquanto que na mitose formam o fuso mitótico. Lamelas anulares, são estruturas geralmente encontradas próximas do núcleo, consistem de duplas membranas paralelas com numerosos poros ou ânulos. Estas organelas são encontradas particularmente em células que se dividem rapidamente (embrionárias e enoplásicas) e em células germinati- vas masculinas e femininas; funcionalmente, podem carrear informação do núcleo para o cito- plasma. INCLUSÕES CITOPLASMÁTICAS Apesar de antigamente serem consideradas acúmulos inertes de metabólicos resultan- tes da síntese de materiais conduzidos do exterior para a célula, muitas inclusões participam de fato no funcionamento celular normal. Incluem-se materiais tais como alimentos acumula- dos, pigmentos e alguns cristais. Corpos como gotículas ou grânulos de secreção, que outrora eram considerados inclusões, atualmente são vistos como material enzimático envolto por membrana. Os lipídios, além de serem estocados no tecido adiposo, estão presente em muitos tipos de células e são vistos como vacúolos claros e gotículas contendo gorduras neutras, ácidos graxos e colesterol. Geralmente os lipídios, são removidos na preparação dos tecidos, deixan- do espaços claros e esféricos, mas podem ser preservados e corados, por exemplo, por tetró- xido de ósmio. Carboidratos são estocados nas células como glicogênio. O glicogênio é hidros- Histologia, Citologia e Embriologia Prof.: Roseli - 19 - solúvel e também é removido por métodos rotineiros de preservação, deixando no citoplasma espaços irregulares, na forma de grânulos pouco condensado. O glicogênio pode ser retido e corado especialmente. Os pigmentos, materiais de cor natural, são classificados como exóge- nos (formados fora do organismo e depois a ele incorporados) ou endógenos (formados dentro do próprio organismo). Os pigmentos exógenos incluem os carotenos (lipocromos), poeira e minerais. Os endógenos são principalmente de dois tipos: (1) melanina e (2) hemoglobina e seus produtos de degradação. Cristais e cristalóides ocorrem em poucos tipos de células e co- mumente são de natureza protéica. NÚCLEO - NUCLÉOLO - CARIOTECA - CROMOSSOMOS Apenas aos eritrócitos e as plaquetas no sangue não têm núcleo (ou núcleos). Os nú- cleos variam muito em forma, mas geralmente são esféricos ou ovóides e têm de 3 a 14 µm de diâmetro, exceto em poucas células, onde são muito maiores. Caracteristicamente, o núcleo é basófilo, isto é, cora-se em azul com H-E. O núcleo é circundado por um envoltório, ou membrana nuclear, e cheio com o suco nuclear palidamente corado (o carioplasma). Ele pode apresentar pequenas massas irregulares, densamente coradas de cromatina e um nucléolo. O envoltório nuclear é basicamente formado por duas membranas com 7 a 8 nm de espessura separadas por um espaço perinuclear de 25 nm, sendo a membrana externa salpicada com ribosomas. E visível à microscopia óptica devido à associação de um material cromático que margeia sua superfície interna. O carioplasma cora-se fracamente, mas contém cromatina dis- persa, alguns grânulos e proteína. A cromatina nuclear aparece como grumos irregulares e densos de material grosseiramente granular tanto no suco nuclear como associado com a membrana nuclear interna. Representa regiões de cromossomos condensados ou fortemente espiralizados no núcleo interfásico. Os núcleos são basicamente de dois tipos: (1) núcleos “condensados”, pequenos, fortemente corados, ou hipercromáticos, e (2) núcleos “vesicula- res”, grandes e pálidos. O nucléolo (ou nucléolos), pode estar obscurecido no núcleo conden- sado. O nucléolo geralmente tem 4 µm de diâmetro, é discreto, esférico ou ovóide e fica livre no carioplasma ou ligado à superfície interna do envoltório nuclear. Geralmente os nucléolos são basófilos, maiores e mais regulares que as massas de cromatina, mas a coloração varia porque, além de ARN e ADN, eles contêm tanto proteínas ácidas como básicas. A microscopia eletrônica, o nucléolo contém componentes granulares e fibrilares. O ARN ribosomal é sinteti- zado no nucléolo, que em células secretoras de proteínas é proeminente e freqüentemente múltiplo. A cromatina nuclear, que representa cromossomos no núcleo interfásico, compõe-se em grande parte de ADN. Os cromossomos, sem dúvida, podem ser vistos em células sofrendo mitose. A cromatina sexual (corpúsculo de Barr) pode ser vista em alguns tipos celulares. Célu- las somáticas humanas contêm 46 cromossomos: ou 23 pares: 22 pares são chamados autos- somos e há mais 2 cromossomos x nas mulheres e um cromossomo x e outro Y nos homens. Ocasionalmente, esse número apresenta variações; tais variações poderão ser em números múltiplos ou em números não múltiplos maiores ou menores que o normal. Nos núcleos de células femininas, um cromossomo x na interfase permanece e extremamente heterocromático e forma uma massa visível chamada corpúsculo de Barr. Ele tem aproximadamente 1 µm de diâmetro e é visto geralmente próximo à superfície interna do envoltório nuclear numa forma planoconvexa (em núcleos de células epiteliais), como uma “baqueta”, uma fina protrusão do núcleo, ou como um corpúsculo associado com o nucléolo. Histologia, Citologia e Embriologia Prof.: Roseli - 20 - Figura – No centro desta figura encontramos umesquema de uma célula, ilustrando a forma de suas organelas e inclusões tal como aparecem à microscopia óptica. Na periferia encontramos representações de es- trutura fina desses mesmos componentes tal como são vistos nas micrografias eletrônicas. O ergastoplasma da microscopia óptica consiste em agregados de elementos submicroscópicos limitados por membrana com grânu- los de ribonucleoproteína que aderem à sua superfície externa. Este componente é chamado agora retículo en- doplasmático granular. A ilustração da membrana plasmática posta em destaque no interior de um círculo deli- mitado por linha interrompida não é uma estrutura que tem sido observada diretamente, mas representa uma possível interpretação do arranjo de moléculas lipídicas e protéicas que podem estar relacionadas com a aparên- cia trilaminar das membranas celulares nas micrografias eletrônicas. EMBRIOLOGIA A embriologia é a parte da Biologia que estuda o desenvolvimento dos embriões animais. Há grandes variações, visto que os animais invertebrados e vertebrados apresentam muitos diferentes aspectos e níveis evolutivos. Em Biologia o desenvolvimento envolve diversos aspectos: a) multiplicação de células, através de mitoses sucessivas. b) crescimento, devido ao aumento do número de células e das modificações volumé- tricas em cada uma delas. c) diferenciação ou especialização celular, com modificações no tamanho e forma das células que compõem os tecidos. Essas alterações é que tornam as células capazes de cumprir sua funções biológicas. Através da fecundação ocorre o encontro do gameta masculino (espermatozóide) com o feminino (óvulo), o que resulta na formação do zigoto ou célula-ovo (2n). Após essa fecundação o desenvolvimento embrionário apresenta as etapas de segmen- tação que vão do zigoto até o estágio de blástula. Muitas vezes há um estágio intermediá- rio, a mórula. A gastrulação é o período de desenvolvimento de blástula até a formação da gás- trula, onde começa o processo de diferenciação celular, ou seja, as células vão adquirin- do posições e funções biológicas específicas. No período de organogênese, há formação dos órgãos do animal, estágio em que as células que compõem os respectivos tecidos se apresentarão especializadas. Os óvulos são gametas femininos que serão classificados em função das diferentes quantidades de vitelo (reservas nutritivas) e das suas variadas formas de distribuição no interior do citoplasma. Essas duas características determinam aspectos diferentes no de- senvolvimento embrionário. É o estudo do desenvolvimento do ovo, desde a fecundação até a forma adulta. Tipos de ovos: Oligolécitos -alécitos - pouco vitelo (equinodermos, protocordados e mamíferos) Telolécitos incompletos - heterolécitos - polaridade (anfíbios) Telolécitos completos - megalécitos - disco germinativo (peixe, répteis, aves) Centrolécitos - vitelo no centro (artrópodes) Tipos de clivagem: Holoblástica (total) Igual - oligolécitos Desigual - telolécitos incompletos Fases do Desenvolvimento Histologia, Citologia e Embriologia Prof.: Roseli - 21 - - Segmentação: aumento do número de células (blastômeros); Meroblástica (parcial) Discoidal - telolécitos completos Superficial - centrolécitos Mórula: grupo de células agregadas. Lembra uma amora; Blástula: esfera oca onde a camada de células denominada blastoderma envolve a blastocela (cavidade); Gástrula: forma o arquêntero, a mesentoderme e a ectoderme; Nêurula: forma o tubo neural, ocorrendo no final da anterior; Organogênese: formação dos órgãos. Destino dos Folhetos Embrionários Ectoderme epiderme e seus anexos encéfalo e medula espinhal Mesoderme notocorda (posteriormente é substibuída por vértebras) Epímero dermátono - derme miótomo - musculatura estriada esclerótomo - esqueleto axial (coluna) Mesômero - aparelho uroge- nital Hipômero sistema circulatório musculatura lisa peritônio e mesentérios Histologia, Citologia e Embriologia Prof.: Roseli - 22 - esqueleto apendicular (membros) Endoderme aparelho respiratório tubo digestivo e glândulas anexas Anexos Embrionários: Saco vitelínico: todos os vertebrados. Formado pela esplancnopleura. Função de ar- mazenamento de vitelo (nutrição) e formação das primeiras células sangüíneas nos mamífe- ros. Âmnio: em répteis, aves e mamíferos. Formado pela esplancnopleura. Função de ex- creção e respiração. Em mamíferos, orienta a formação dos vasos umbilicais. Alantóide: em répteis, aves e mamíferos. Formado pela esplancnopleura. Função de excreção e respiração. Em mamíferos, orienta a formação dos vasos umbilicais. Placenta: em mamíferos eutérios. Formado pelas vilosidades coriônicas.Realiza as trocas com o embrião através do cordão umbilical, dotado de uma veia e duas artérias. REPRODUÇÃO: FORMAÇÃO DE GAMETAS E FECUNDAÇÃO A reprodução sexuada envolve a união do espermatozóide com o óvulo, ambos haplói- des, o que torna possível a mistura dos caracteres genéticos das populações de uma espécie, porém alguns animais também são capazes de reproduzir-se de forma assexuada produzindo indivíduos a partir de fragmentos ou divisões do corpo do progenitor. Durante a formação dos gametas, o número de cromossomos é reduzido à metade por duas divisões meióticas. Essas divisões originam quatro espermátides oriundas de uma única espermatogônia e cada espermátide e, então, transformada em uma célula pequena, compac- ta, adaptada para o transporte material genético para o óvulo. Já na Ovogênese, o citoplasma divide-se de maneira desigual entre as quatro células filhas de modo que uma, o óvulo. obtém todo o material vitelínico. A quantidade e a distribuição do material vitelínico varia muito nas diferentes espécies animais. A fecundação compreende todos os eventos desde a penetração da membrana do óvulo pelo acrosoma do espermatozóide até a união dos cromossomos do espermatozóide e do óvulo em um só núcleo, restaurando o número diplóide de cromossomos. A Partenogênese, o desenvolvimento do óvulo sem haver fecundação, ocorre natural- mente em muitos grupos diferentes de animais. A adaptação mais importante que aumenta a possibilidade de fecundação é a sincronia na produção e liberação dos gametas. Muitos animais aquáticos apresentam fecundação exter- na, que é possível onde indivíduos de uma espécie reúnem-se durante o período de reprodu- Histologia, Citologia e Embriologia Prof.: Roseli - 23 - ção ou vivem próximos e os espermatozóides podem ser transportados até os óvulos pelas correntes aquáticas. A fecundação interna no interior do corpo da fêmea é característica de muitos animais aquáticos e das espécies terrestres. Ela requer a cópula e diversas modificações das vias re- produtoras de ambos os sexos, tais como um órgão copulador (geralmente um pênis), glându- las produtoras de sêmen, vesícula seminal, vagina e receptáculo seminal. Os animais primitivos são gonocorísticos, isto é, os sexos são separados, porém muitas espécies são ou hermafroditas protândricas ou hermafroditas simultâneas. Contudo, a regra é, geralmente, o cruzamento. ao invés da autofecundação. No hermafroditismo simultâneo, a fecundação cruzada é recíproca. O hermafroditismo é claramente adaptativo para muitos ani- mais parasitais e sésseis,porém sua origem e significado em outros grupos ainda estão sendo estudados. Os óvulos de muitos animais marinhos fazem parte do plâncton, porém a maioria das espécies marinhas e todas as espécies dulcícolas depositam seus ovos no interior de envoltó- rios ou invólucros que se fixam ao substrato ou a seus progenitores. As vias reprodutoras fe- mininas modificaram-se para secretar invólucros para os óvulos e o número de óvulos produzi- dos é menor do que quando fazem parte do plâncton. As vias reprodutoras dos vertebrados variam muito, o que reflete diferentes adaptações para a fecundação e ovoposição. Nos mamíferos, o pênis masculino deposita os espermatozói- des na vagina e a fecundação ocorre na extremidade superior da Trompa de Falópio. 0 grande número de espermatozóides liberados aumenta a possibilidade de que alguns possam atraves- sar o útero e a Trompa de Falópio e, coletivamente contribuir para a dispersão enzimática das células foliculares retidas em torno do óvulo liberado. A reprodução nos vertebrados, em especial, apresenta um mecanismo complexo que dispõe de um mecanismo hormonal que acontece da seguinte forma: As células intersticiais dos testículos produzem androgênios como a testosterona, por exemplo; estes estimulam o desenvolvimento e a manutenção dos caracteres sexuais masculinos secundários e as glându- las anexas masculinas, a próstata e a vesícula seminal, por exemplo. Os chifres do veado e a crista do galo, as barbelas e a plumagem dos pássaros são controlados pelos androgênios. Eles também são responsáveis, pelo menos em parte, pelo aumento da libido em ambos os sexos e pelo desenvolvimento do comportamento no acasalamento. A remoção da hipófise causa a regressão não só das células intersticiais como dos túbulos seminíferos. Os ovários produzem os hormônios sexuais femininos, progesterona e estradiol. O es- tradiol controla as alterações do corpo feminino na época da puberdade ou maturidade sexual alargando a pelve, desenvolvendo os seios, promovendo o crescimento do útero, da vagina e genitália externa. A progestrona é necessária para completar cada ciclo menstrual, para a im- plantação do ovo e para a manutenção da gravidez. Os ciclos menstruais dos primatas e os ciclos estrais de outros mamíferos são regulados por interações complexas entre o FSH, LH, prolactina, estradiol e progesterona. Em alguns animais, como no coelho e na doninha, a ovulação é induzida, de modo reflexo, pelo estimulo da vagina durante a cópula. Na mulher e em muitos outros mamíferos, a ovulação é estimula- da não pela cópula, mas por uma intrincada seqüência de controles de retroalimentação (feed, back), que incluem o hormônio liberador de gonadotrofina, o LH, o estradiol e, talvez, também o FSH e a progesterona. Os anticoncepcionais orais contêm análogos sintéticos de estradiol e progesterona e funcionam impedindo a secreção do hormônio liberador da gonadotrofina. A placenta produz os hormônios protéicos gonadotrofina coriônica e lactogênio placen- tário e os hormônios esteroides progesterona e estradiol. A lactação está sob um controle hormonal muito complexo, que inclui o estradiol e a progesterona, além da prolactina e, em algumas espécies, o hormônio do crescimento, a insu- lina, bem como o ACTH. A secreção de leite pelas glândulas alveolares é regulada pela prolac- tina, porém o transporte do leite do alvéolo para o mamilo é controlado pela ocitocina, que estimula a contração das células mioepiteliais que espremem os alvéolos. DESENVOLVIMENTO EMBRIONÁRIO A ativação do óvulo pela fecundação inicia divisões mitóticas, denominadas clivagem. Os três tipos mais comuns de clivagem são a clivagem radial (equinodermas e vertebrados), Histologia, Citologia e Embriologia Prof.: Roseli - 24 - na qual os planos de clivagem são paralelos ou em ângulos retos; clivagem espiral (anelídeos e moluscos), na qual os planos de clivagem são oblíquos ao eixo polar, e a clivagem superficial (artrópodos), na qual ocorrem divisões nucleares mas não citoplasmáticas. A quantidade e a distribuição do vitelo, que impede a clivagem, afetam bastante o tipo de clivagem. A clivagem freqüentemente conduz a um estágio multicelular conhecido como blástula, contendo uma ca- vidade interior, a blastocele. A massa total da blástula é menor do que a do ovo. A gastrulação converte a blástula em um embrião bilateral (gástrula). que possui o pla- no básico do adulto. A conversão ocorre através de movimentos morfogenéticos das células embrionárias. Como na clivagem, o modelo da gastrulação é muito afetado pela quantidade e distribuição do vitelo. Os folhetos germinativos _ ectoderma. mesoderma e endoderma _ tor- naram-se evidentes durante a gastrulação. Seguindo-se á gastrulação, os rudimentos de órgãos derivados de um ou mais folhetos germinativos são logo estabelecidos. Em todos os animais, o sistema nervoso, a camada epi- dérmica da pele e as regiões bucal e anal são derivadas do ectoderma; o revestimento do in- testino e as diversas regiões associadas ao intestino, tais como o fígado e o pâncreas, são de- rivados do endoderma as camadas musculares, os vasos sanguíneos e o tecido conjuntivo são derivados do mesoderma. A posição é o primeiro fator na determinação do destino das células embrionárias e na regulação do curso do desenvolvimento. A posição determina a natureza do meio citoplasmáti- co e do meio celular circundante, os quais, interagindo com o núcleo, regulam a ativação se- qüencial dos genes e, desse modo, o destino final da célula. Primeiramente, como em muitos animais marinhos, o desenvolvimento inclui um es- tado de larva móvel que alimenta (desenvolvimento indireto) e é responsável pela dispersão e pela fonte precoce de nutrição fora do ovo. Contudo, as larvas estão sujeitas a uma alta mortalidade ou são incompatíveis com certas condições, e têm sido, portanto suprimidas em muitas espécies marinhas e na maioria das espécies dulcícolas (desenvolvimento direto). Os ovos cleidóicos, que são sistemas mais ou menos auto-suficientes contidos em uma casca protetora, evoluíram em alguns grupos de animais, especialmente os terrestres. As membranas extra-embrionárias_ saco vitelino, âmnio, córion e alantóide fornecem proteção e manutenção para o desenvolvimento do embrião dentro de ovos cleidóicos de répteis e aves. O cuidado paterno, ou incubação dos ovos, seja dentro ou fora do corpo da fêmea, é uma adaptação disseminada que facilita a sobrevivência do embrião. A incubação permite a redução do número de ovos produzidos. O embrião humano é incubado no interior do útero, onde ele chega sob a forma de blástula (blastocisto), seguindo-se à fecundação na parte superior da tuba de Falópio. O córion e a alantóide de seus ancestrais reptilianos adaptaram-se para a troca de gases, alimentos e dejetos entre as correntes sangüíneas embrionária e uterina. As partes do córion-alantóide e da parede uterina relacionadas com as trocas constituem a placenta. A gemelação, ou nascimentos múltiplos, nos mamíferos, resulta da liberação de mais de um óvulo dos ovários da separação dos blastômeros na clivagem do ovo, ou da formação de mais de um centro embrionário dentro do blastocisto. RESUMO DA PRIMEIRA SEMANA DO DESENVOLVIMENTO O desenvolvimento humano tem início com a fertilização, mas uma série de eventos deve ocorrer antes que esse processo possa se iniciar (e. g., a gametogênese). Os ovócitos são produzidos pelo ovário (ovogênese), e são dali expelidos durante a ovu- lação. O ovócito é varrido para a trompa uterina, onde pode ser fertilizado. Os espermatozóides são produzidos nos túbulos seminíferos
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