AULA 8 Diagnóstico Molecular

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DIAGNÓSTICO MOLECULARDIAGNÓSTICO MOLECULAR
AULA 8AULA 8
PROFESSORA MARIA CRISTINA PAMPLONA DA SILVA
Ao final desta aula, você será capaz de:
�Definir diagnóstico molecular;
�Descrever as etapas da técnica de
PCR;PCR;
�Relacionar técnicas moleculares
com sua utilização para o
diagnóstico.
O DIAGNÓSTICO MOLECULAR 
�É uma poderosa ferramenta capaz de
proporcionar informações fundamentais sobre
a condição do paciente e seu prognóstico,
podendo também em muitos casos auxiliar o
médico na escolha do melhor tratamento paramédico na escolha do melhor tratamento para
o paciente.
�Além disso, em muitos casos, o diagnóstico
molecular pode indicar quais indivíduos são
portadores de um determinado alelo mutante,
mesmo que o indivíduo em questão não
apresente qualquer sintoma.
Análise molecular em doenças 
genéticas tem como objetivo
�Ocorrência e frequência de mutações
em determinadas populações
�Localização da mutação;�Localização da mutação;
�Características específicas do gene
em questão;
�Tipo de mutação (mutação pontual,
grandes deleções, inserções, etc.),
entre outras.
Alelos diferentes podem resultar em fenótipos diferentesAlelos diferentes podem resultar em fenótipos diferentes
Nos bovinos, o loco P é um dos genes relacionados com a cor da pelagem. Neste caso, o
alelo P determina a produção de um pigmento de cor preta na pelagem (devido a produção
da eumelanina) e o alelo p, um pigmento de cor vermelha (devido a produção da feomelanina).
MUTAÇÃO PONTUAL MUTAÇÃO PONTUAL -- ANEMIA FALCIFORMEANEMIA FALCIFORME
EXPANSÃO DA REPETIÇÃO CGG
SÍNDROME DO XSÍNDROME DO X--FRÁGILFRÁGIL
Dependendo do número de repetições CGG, os indivíduos podem ser
classificados em 4 categorias:
�normais (apresentam de 6 a 40 repetições CGG),
�zona gray (41 a 60),
�pré-mutados (61 a 200)
�e afetados (mais de 200)
Em doenças não genéticas tem como objetivo
� Diagnosticar doenças infecciosas;
� Identificar o agente infeccioso (vírus,
bactérias, protozoários, fungos) através dabactérias, protozoários, fungos) através da
detecção do seu material genético;
� Estudar o agente infeccioso em questão;
� Avaliar a resposta ao tratamento.
TÉCNICAS MOLECULARES TÉCNICAS MOLECULARES 
� Amplificação enzimática do DNA (PCR).
� Digestão da fita de DNA genômico ou
produto de PCR com enzimas de restrição.
� Separação eletroforética do DNA ou do
produto de PCR.
� Hibridação do DNA ou fragmentos de PCR
com sondas oligonucleotídicas.
Amplificação enzimática do DNA (PCR)Amplificação enzimática do DNA (PCR)
Reação em Cadeia da Reação em Cadeia da PolimerasePolimerase (PCR)(PCR)
� Consiste na replicação do DNA in vitro.
� É uma técnica que revolucionou a genética
molecular, permitindo muitos avanços na área,
como a clonagem, a produção de alimentos
transgênicos, e etc.transgênicos, e etc.
� É considerada uma técnica altamente sensível,
por ser capaz de detectar e amplificar DNA a partir
de uma pequena quantidade na amostra.
� Além disso, é altamente específica, pois é
capaz de detectar sequências específicas de DNA,
que sejam o alvo do estudo.
EXTRAÇÃO DE DNA
Preparo da reação de PCR
� DNA polimerase (Taq – Thermus
aquaticus)
� Primers ou iniciadores
� Nucleotídeos (A, T, G e C)
� Tampão de pH
� DNA (ou RNA)
� Mg++
MÁQUINA DE PCR MÁQUINA DE PCR (reação em cadeia da polimerase)
O princípio básico da PCR está
na capacidade de, a partir de
quantidades mínimas de DNA,
multiplicar uma determinada
sequência, de modo que estasequência, de modo que esta
se torne majoritária na
amostra. Numa reação de PCR,
o fragmento de DNA que
desejamos multiplicar (ou
amplificar) é chamado de
fragmento alvo ou DNA molde
e constituí um pedaço do gene
que se pretende estudar .
CLONAGEM CLONAGEM 
DO DO 
DNADNA
A técnica de PCR se baseia em três etapas.A técnica de PCR se baseia em três etapas.
DESNATURAÇÃO: 94ºC a 96ºC
O molde de DNA passa a ser dupla fita sobre desnaturação, ou seja, as pontes
de hidrogênio se quebram e as fitas se separam, formando duas fitas simples.
ANELAMENTO: 37ºC a 65ºCANELAMENTO: 37ºC a 65ºC
Quando a temperatura abaixa, os iniciadores (primers) se unem nos sítios de
ligação específicos nas fitas simples de DNA para iniciarem a cópia.
EXTENSÃO: 72ºC
Agora a DNA polimerase termoestável (Taq DNA polimerase) utiliza os dNTPs
disponíveis na reação para adicioná-los nas fitas em crescimento, de acordo
com a regra de pareamento entre as bases (A-T; G-C); polimerização.
TÉCNICA DE PCR
TÉCNICA DE ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE TÉCNICA DE ELETROFORESE EM GEL DE AGAROSE 
A técnica consiste na passagem
de fragmentos de DNA em um gel
de agarose ou poliacrilamida. O
gel possui poros que filtram os
fragmentos dependendo do seufragmentos dependendo do seu
tamanho ou peso molecular, ao
serem submetidos a um campo
elétrico. Como o DNA possui
carga negativa, decorrente do
fosfato de sua estrutura, ele
tende a migrar para o polo
positivo do campo elétrico.
Aplicações da PCR
� Diagnóstico de doenças infecciosas e
genéticas;
� Amplificação de genes para posterior
clonagem e estudos de sua expressão;clonagem e estudos de sua expressão;
� Determinação de variabilidade genética e
identificação;
� Detecção de OGMs
� Sexagem e diagnóstico de doenças em
embriões.
OUTRAS TÉCNICAS
� Southern blotting: Esta técnica pode ser utilizada
em análises de DNA em algumas doenças como
Prader Willi e Angelman.
� Northern blotting: detecção de sequências de
RNA, permite observar o padrão de expressão deRNA, permite observar o padrão de expressão de
um determinado gene em diversos tecidos ou a
expressão de genes em células tumorais.
� Western Blotting: transferência de proteínas, usado
nos testes de mal da vaca louca (encefalite
espongiforme bovina), em testes de confirmação de
Hepatite B e outros.
Análise com enzimas de restrição Análise com enzimas de restrição 
ENZIMAS DE RESTRIÇÃOENZIMAS DE RESTRIÇÃO
� Endonucleases, também chamadas
enzimas de restrição, são proteínas
bacterianas que cortam em fragmentos a
longa molécula linear de DNA.longa molécula linear de DNA.
� As enzimas de restrição são as principais
ferramentas da tecnologia do DNA
recombinante, usadas pelos biólogos
moleculares na manipulação do DNA.
A análise com enzimas de restrição é 
indispensável nas seguintes tarefas:
1. Análise da estrutura dos cromossomos
2. Sequenciamento de DNA
3. Isolamento de genes
4. Criação de moléculas novas de DNA que podem
ser clonadas
5. Técnicas como RFLP (Polimorfismo no Comprimento do
Fragmento de Restrição, é uma técnica bastante utilizada para o
estudo do genoma)
Teste de paternidadeTeste de paternidade
SEQUENCIAMENTO
O sequenciamento 
de DNA 
corresponde à 
determinação da 
ordem dos ordem dos 
nucleotídeos 
adenina (A), 
guanina (G), 
citosina (C) e 
timina (T) da 
molécula de DNA. 
SEQUENCIAMENTO