Técnicas Moleculares Aplicadas ao Diagnóstico

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Técnicas MOLECULARES APLICADAS AO DIAGNÓSTICO 
Antes de fazer o diagnóstico de fato, precisa preparar a 
amostra, tem toda uma etapa para o diagnóstico, porque 
se amostra não é extraída da maneira adequada, 
condicionada de forma adequada, pode reduzir a 
capacidade de análise da amostra e, consequentemente, 
tem alguns problemas. Essas etapas são responsabilidade 
da equipe de coleta. 
Como estamos falando de amostras moléculas não tem 
como ver a olho nu, não tem como saber se ela 
estragou. Se a célula morrer não vai saber, só depois que 
a amostra for processada e o resultado sair. 
 
EXTRAÇÃO: 
DNA é a molécula que tem diversas técnicas disponíveis, 
a maior parte das técnicas de diagnostico molecular usa 
DNA. Quando fala de fazer extração de DNA é conseguir 
tirar o DNA de dentro do núcleo. Para isso primeiro 
precisa romper a membrana plasmática, se jogar um 
detergente consegue lisar essa membrana e acaba 
rompendo outras membranas biológicas também, rompe 
carioteca também. Acaba extraindo o DNA mitocondrial 
também. Extração é fazer o isolamento do material 
genético e consequentemente poder trabalhar com ele. 
Esse é o objetivo da etapa. Dar para fazer com RNA 
também só que o RNA pode estar tanto no núcleo 
quanto no citosol. 
Existe vários protocolos de extração de DNA para 
diferentes amostras e pode ter amostra extraída por 
exemplo de osso, pelo, unha, sangue. Normalmente, usa 
amostra de sangue que é considerada padrão ouro, 
porque são fáceis de coletar, extrair, porque o tecido é 
liquido, fluido, não tem tanta matriz extracelular e o 
sangue é um material que tem uma reposição muito boa. 
E a quantidade células que coleta no sangue é muito 
grande, existe um padrão que a cada 1ml tem 1 milhão de 
célula. Nem sempre o sangue vai ser a melhor amostra, 
isso depende se o paciente é acometido por uma 
doença sanguínea, se tem uma leucemia as células 
podem estar acometidas e não serem mais ideais. É 
importante que saiba que o sangue é uma amostra muito 
interessante, mas nem sempre vai ser utilizada. 
Mucosa oral: é uma alternativa menos invasiva, muito 
utilizada em criança. Tem as instruções para fazer a 
retirada da mucosa adequadamente. Coleta menos 
especializada 
Pelos: são uma alternativa para quando o indivíduo já 
morreu, mas geralmente consegue extrair pouca 
amostra devido ser queratinizado. O ideal é puxar o pelo 
todo a partir do bulbo. Praticamente não se usa a coleta 
de pelos e fios de cabelo para amostras de referência, 
devido à dificuldade de se trabalhar com esse tipo de 
amostra. 
Protocolo de extração usa em laboratório que não muita 
estrutura é a extração orgânica fenol-clorofórmio. Os 
agentes são muito carcinogênicos e o DNA acaba sendo 
muito contaminado. É um tipo de metodologia que já 
está em desuso. Desvantagem: Mais trabalhosa, muitas 
etapas, reagentes perigosos e o produto final não é tão 
limpo 
O processo é bem rustico, não utiliza tanta tecnologia. 
1ª Etapa: Amostra incubada com um tampão de 
lavagem e lise celular 
2ª Etapa: Extração com Fenol-clorofórmio 
3ª Etapa: Precipitação com álcool 
4ª Etapa: Centrifugação e ressuspenção em 
H2O 
Fenol ajuda na remoção das proteínas e clorofórmio ele 
desnatura as proteínas que foram removidas para que 
ela não contamine a amostra. 
A extração diferencial é utilizada em crimes sexuais, para 
extrair células diante de um estupro (células de indivíduos 
diferentes, mas que estão no mesmo ambiente). Extrair 
DNA das células do suspeito, os espermatozoides. No 
caso de espermatozoide não consegue fazer extração 
com os tampões tradicionais, usa primeiro o tampão 
tradicional para extrair as células da mucosa vaginal e 
separa dos espermatozoides que vão ficar no fundo do 
tubo. 
Extração com kit comerciais é mais seguro e eficaz, se 
der algum problema a empresa que coletou resolve. É 
uma extração mais rápida. Tem todos os reagentes 
otimizados conseguem fazer reação para muitas 
amostras, não consegue grandes concentrações de 
DNA, mas é limpo. Já as reações caseiras dar uma 
concentração de DNA maior, mas é sujo. Só que isso 
não é um grande problema se você tem muita amostra 
pode fazer mais vezes. 
A quantificação da amostra é importante para quando vai 
fazer DNA de carga viral, se parte de concentrações 
diferentes de amostras, normalmente vai ter um viés se 
o resultado for diferente do que imagina. Por isso é 
importante quantificar e nivelar todas para mesma 
concentração pare que possa perceber as diferenças. 
O aparelho diz a qualidade da amostra, se ela é limpa, 
viável para sequenciamento, PCR, se não for nem precisa 
partir para próxima etapa, extrai novamente antes de 
seguir para próxima etapa. 
A partir da quantificação pode partir para técnicas que 
dão um possível diagnostico. 
São 3 técnicas que podem ser combinadas ou usadas 
isoladas, PCR, eletroforese e sequenciamento. 
 
REAÇÃO DE PCR: 
É interessante para amplificar moléculas, sequencias 
especificas de DNA. Hoje é a técnica mais utilizada no 
mundo para fazer o diagnóstico da covid. 
Coloca a amostra que tem que ser fita dupla, pode ser 
RNA também mesmo sendo fita simples existe situações 
que pode converter em fita dupla através da transcrição 
reversa. Também utiliza os primers, os dNTPs que são 
os nucleotídeos, DNA polimerase, MgCl2 e água pura e 
livre de DNASE e RNASE e o tampão para manter o pH 
constante. O aparelho que faz a PCR é chamado de 
termociclador. É baseado em variações de temperaturas, 
tem 3 etapas. 
1ª fase - Desnaturação 
Onde vai ter o aquecimento da dupla fita de DNA para 
além de 90 graus, separou as fitas e pode colocar os 
primers para depois fazer a extensão da molécula com 
polimerase. Separa tanto a fita do DNA original quanto os 
produtos de amplificação. 
2ª fase - Anelamento dos Primers 
Os primers vão se ligar na região especifica dele (se 
desenha um primer para zika vírus ele só se liga na 
sequência do zika), porque os primers são sequências 
complementares. Esse anelamento dos primers também 
é chamado de hibridização. Isso ocorre a uma 
temperatura que varia de 40 a 70 graus conforme o par 
de primers. Determina a especificidade da ligação. 
3ª fase - Extensão 
É o trabalho da polimerase, duplicando o DNA, isso 
ocorre em torno de 72 graus. A DNA polimerase é 
extraída de uma bactéria termofílica, por isso ela resiste 
a essa temperatura tão alta. É um processo cíclico 
repete-se entre 25 a 35 vezes, vai duplicando sempre 
o número de fragmentos que você tem ali. Então, se 
consegue amplificar o número de copias a partir de um 
fragmento que não consegue visualizar de maneira 
nenhuma, já consegue identificar pelo o aumento da 
quantidade desse fragmento. Porque não consegue ver 
mesmo depois de amplificado? Porque a nível molecular 
não se consegue visualizar mesmo depois de grandes 
quantidades e por isso tem que utilizar outra técnica 
como a eletroforese. 
Eletroforese é o resultado da química que utilizou com 
os fragmentos de DNA, isso separa esses fragmentos. 
- Tipos de PCR: 
Pcr convencional mencionada acima, outras foram 
desenvolvidas para suprir o que essa não conseguia fazer. 
Nested PCR 
PCR em tempo real (qPCR) não necessita de 
eletroforese, PORQUE JÁ COLOCA A QUIMICA NO 
TUBO E consegue identificar. É uma PCR quantitativa. 
RT-PCR usa RNA 
PCR multiplex faz vários PCR para a mesma amostra no 
mesmo tubo de ensaio. 
 
ELETROFORESE: 
É uma técnica onde vai ter a separação dos fragmentos 
e esses fragmentos vão migrando no gel primeiro pela 
diferença de potencial que tem, o DNA é uma amostra 
negativa por conta do grupamento fosfato que tem nos 
nucleotídeos. Como é uma amostra negativa ela vai 
migrar para o polo oposto que é o polo positivo. Então, 
o que acontece é que nessa migração tem uma 
separação dos fragmentos os maiores ficam em cima e 
os menores embaixo e depois consegue visualizaresses 
fragmentos em um transluminador. Ela pode ser feita em 
gel de algarose e poliacilamida que são dois açúcares. O 
de agarose é para fragmentos maiores e a outra para 
menores. 
A eletroforese em gel trabalha com DNA tanto na forma 
fita simples quanto fita dupla. Para conseguir que o DNA 
fique estável na forma de fita simples são utilizados 
agentes desnaturantes como por exemplo Uréia e 
Formamida. 
Pode trabalhar com fita dupla e fita simples. O resultado 
final consegue identificar as bandas. Agora pode 
acompanhar a eletroforese em tempo real. 
 
SEQUENCIAMENTO: 
O sequenciamento começou com a eletroforese 
diferenciada (capilar) → que ao invés da amostra passar 
no gel, ela passa por um tubinho muito fino. Nesse 
tubinho, só consegue passar um nucleotídeo por vez, 
migrando do polo negativo para o polo positivo. Nessa 
passagem tem um lugar que é possível fazer a detecção 
do nucleotídeo 
Mas hoje temos aparelhos mais modernos com 
diferentes funcionamentos 
Técnicas utilizadas para descobrir a sequência das bases 
de um fragmento de DNA não conhecido 
Utilizamos nucleotídeos marcados por florescência 
(fluorescência, não consegui distinguir) → cada 
nucleotídeo com uma cor diferente 
Descobre uma fita e depois é só “fazer” a fita 
complementar