Primeiros Estudos sobre o DNA

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BIOLOGIA MOLECULAR
Profa.: Rogeria Gregio
Como Deveria Ser a Molécula Responsável pela Hereditariedade?!
Deve conter informações complexas
Deve se replicar fielmente
Deve codificar o genótipo
1968 - Miescher
Química do “pus” (leucócitos) – substância levemente ácida e rica em fósforo, a NUCLEÍNA, mais tarde batizada de ÁCIDO NUCLEICO, por um de seus alunos.
1800 - Kossel
Determinou que o DNA continha quatro Bases Nitrogenadas: Adenina, Guanina, Citosina e Timina
1905 - Levene
DNA é um grande número de unidades repetidas ligadas, cada uma contendo: um açucar, um fosfatoe uma base nitrogenada (nucleotídeo)
Monômero/ Polímero
1950 - Chargaff
A quantidade total de Adenina é iguala de timina
e a de guanina é igual a de citosina.
DNA Como Fonte da Informação Genética
1928 – Griffith
_ Streptococcus pneumoniae
1940 - Avery
Tripsina e a Quimiotripsina -	Nenhum efeito
sobre o DNA
1952 – Hershey e Chase
T2 um bacteriófago _35S e 32P
1953 - A descobertade Watson e Crick
Grande parte da química básica do DNA já
havia sido determinada.
Ashbury – difração de raio X, porém pouca resolução
Wilkins e Franklin – obtiveram imagens bem melhores , não decifraram por desavenças.
Raio	X	do	DNA
Watson	e Crick
Descobriram a estrutura do DNA apenas estudando dados já existentes, limitando as estruturas possíveis, a chave da questão: apenas A=T e C≡G
Prêmio Nobel de 1962 _ Watson, Crick e Wilkins (Franklin morreu em 1957)
Estrutura Helicoidal
Fitas ANTIPARALELAS
Direção inversa: Uma fita inicia no carbono 5’
da desoxirribose a outra no 3’
Formas da dupla Helice
B mais hidratada, não existe sequência de base incomum, possui giro para a direita,aprox. 10 bases por giro;
A menos hidratada que B, giro para a direita, 11 bases;
Z raro depende de sequencias CG, giro pra esquerda, 12 bases por giro;
Formas
Nucleossomos
Histonas: Formam a partícula unitária da cromatina: o nucleossomo
Cromatina: DNA +
Proteínas
Duplicação ou	Replicação	do	DNA
Sindrome de Bloom: condição autossomica recessiva rara; baixa estatura;exantema facial; cabeça pequena e estreita e predisposição a cânceres.
Mutações excessivas em TODOS os genes;
Numerosas falhas e quebras nos cromossomos;
Velocidade de síntese do DNA retardada...
Defeito em HELICASES!
O	Problema Central da Replicação
Como	transmitir
fielmente
as
instruções
genéticasa	cada
vez	que
as
célulasse
dividem?
unicelular
Um	zigoto 6.000.000.000
humano
de	pb,	1
possui cada
erro	a
cada	duplicação
1.000.000,	6.000	erros	a
celular!
 E. coli 4.700.000 pb 1.000/min 3 dias
 Leva 20 min, 1.000/s
Extremamente precisa – de 1 erro/ bilhão
Estágios da replicação
Iniciação – origem C
Alongamento – síntese da fita Líder e síntese da fita tardia
Terminação – em DNA circular termina quando as extremidades se encontram, eucarioto sequências específicas ao final, os TELÔMEROS.
Duplicação SEMICONSERVATIVA (Meselson e Stahl)
Regulação
Única fase regulada para que a replicação ocorra uma vez por ciclo celular.
Conceitos
Réplicon unidade de replicação;
Ao se abrir cada uma das fitas servirá de
molde;
A nova fita sempre no sentido 5´ para 3´, por isso uma é contínua (leading), a outra descontínua (lagging);
Esta forma fragmentos de Okasaki;
Principais Enzimas envolvidas na duplicação procariótica
Proteína iniciadora;
DNA helicase
SSB
DNA girase
DNA PRIMASE
DNA polimerase III
DNA polimerase I
DNA ligase
Duplicação procariótica
Nos eucariotos a replicação do DNA acontece durante uma parte do ciclo celular
•A replicação do DNA na maioria das células eucarióticas
somente ocorre durante uma fase específica do ciclo de divisão celular, chamada FASE DE SÍNTESE DE DNA OU FASE S.
•Numa	típica	célula	de	mamífero	a	Fase	S	dura
aproximadamente 8 horas, em uma célula eucariótica simples como a de levedura, a FASE S pode durar menos de 40 minutos.
•No final da FASE S, cada cromossomo foi duplicado para produzir duas cópias idênticas, que permanecem unidas pelo seu centrômero até a Fase M ( M de Mitose).
licação
Durante as fases do ciclo celular G1, S e G2 (intérfase), a célula cresce continuamente. Durante a fase M (Mitose), o crescimento celular para, o núcleo divide-se e a célula divide-se em duas. A REPLICAÇÃO DO DNA É CONFINADA A FASE S. G1 é o intervalo entre a fase M e a fase S, G2 é o intervalo entre a fase S e a fase M.
Principais enzimas DNA polimerases envolvidas na duplicação eucariótica
DNA polimerase alfa - síntese e reparo
DNA polimerase beta - reparo
DNA polimerase gama – rep. Mitocondrial
DNA polimerase delta – síntese, reparo lesão
DNA polimerase zeta – síntese translesão
DNA polimerase kapa – síntese translesão
 .....
Sistema de reparo
Verificação de pareamento incorreto
Atividade revisora da DNA Polimerase
Atuação	da DNA	girase
Replicação	dos	Telômeros
Filamento contínuo normal
Filamento descontínuo o iniciador não consegue se ligar no telômero – cromossomo encurtado. Solução sequências repetidas (TTAGG), servindo para a TELOMERASE – Teoria telomérica do envelheciemnto.
Telomerase
Forquilha de replicação eucariota
Replicação
DNA Polimerase III
Sentido 5’ → 3’
Nucleotídeos 3P são adicionados
Liberação de
Pirofosfato
http://207.207.4.198/pub/flash/24/menu.swf
RNA
Ribozimas – material genético original
1a. Etapa na transferência da
informação
É formado a partir de um molde de DNA
Estrutura semelhante porém fita única,
ribose e uracil
Estrutura RNA
TRANSCRIÇÃO
A ENZIMA QUE CATALISA A SINTESE DO RNA É A RNA POLIMERASE
PROCARIOTOS POSSUEM APENAS UMA RNA POLIMERASE
EUCARIOTOS POSSUEM:
RNA POL, RNA POL II e RNA POL III
RNA POL Mitocondria
RNA POL Cloroplasto
Função da RNA polimerase de procarioto
Polimerizar os RNAm , RNAt e RNAr
Sozinha abre o DNAe realiza todas as funções necessárias a transcrição dos e RNA.
Função das RNAs polimerases eucarióticas
RNA polimerase I – grandes RNAr
RNA polimerase II – htRNA, snRNA, snoRNA
RNA polimerase III – RNAt, pequeno RNAr, snRNA
TIPOS DE RNA
RNA mensageiro (mRNA): contém a informação genética para a sequência de aminoácidos de peptídeos e proteínas
RNA transportador (tRNA): identifica e transporta os aminoácidos até o ribossomo
RNA ribossômico (rRNA): constituinte dos ribossomos
RNA nucleolar pequeno (snoRNA): envolvido no processamento dos RNAs
RNA nuclear pequeno (snRNA): associa-se a proteínas e
desempenha importante papel no processamento do RNAm
RNA de interferência pequeno (iRNA): afeta expressão gênica
TRANSCRIÇÃO
DNA fita codificadora
DNA fita molde
RNA transcrito
A RNA POL “ATUA” SOBRE UM DNA DUPLEX
A RNA POL TRANSCREVE A FITA MOLDE DO DNA DUPLEX
Transcrição
Transcrição
Um promotor – não é transcrito
(upstream)
Uma sequência codificante (downstream)
Um finalizador – para após a cópia do finalizador
PROCARIOTOS
SÍNTESE DO RNA PELA RNA POLIMERASE
TÉRMINO DA TRANSCRIÇÃO
Independente de fator protéico
formação do grampo de términação no RNA
TÉRMINO DA TRANSCRIÇÃO
Dependente de fator protéico
ENVOLVE A PROTEINA rho
Promotor
Região Codificadora
Terminador
Promotor
Regiões Codificadoras
Terminador
OPERON
Estrutura de um gen procarioto
PROCARIOTO – MONO OU POLICISTRÔNICO
(monogênico ou poligênico)
EUCARIOTO - MONOCISTRONICO
Região -10
Região -35
Posição +1
PROMOTORES DE GENES BACTERIANOS
UP = upstream element = elemento a montante
Sítio de ligação de uma molécula ativadora ou silenciadora
Região	consenso TATA	BOX
PROMOTORES DE GENES BACTERIANOS
PROCESSAMENTO DO PRECURSOR DO
tRNA
tRNA
-Estrutura secundária com grampos e alças formando um trevo
-Alto número de bases modificadas depois da sua transcrição
-ACC –
ác.adenílico 2 ác. cetidílico
PROCARIOTOS
PROCESSAMENTO DO PRECURSOR DO rRNA
Exemplos de rRNAs:
Estrutura secundária com grampos e alças
Bases metiladas
Ribossomo bacteriano 70S (2,7 x 106)
Ribossomo Eucariótico
80S (4,6 x 106)
rRNAs:
RNA	Funções
RNA
mRNA
ncRNA
Non-coding RNA. RNA transcrito tem papel estrutural, funcional ou catalítico
rRNA
Ribosomal RNA Participa da
síntese de proteínas
tRNA
Transfer RNA Interface entre RNAm e aminoácidos
snRNA
Small nuclear RNA RNA que fazem parte do spliceossomo
snoRNA
Small nucleolar RNA Encontrado no nucléolo e esta envolvido na modificação
do RNAr
miRNA
Micro RNA
Pequenos fragmentos de RNA que estão envolvidos na regulação da expressão gênica
Outros
RNAs maiores compondo a estrutura da cromatina e relacionados
ao “imprinting”
siRNA
Small interfering RNA ativa moléculas na interferência por RNA
stRNA
Small temporal RNA. RNA com função de regulação do desenvolvimento biológico
RNA polimerases de eucariotos
RNA pol I
Nucleólo
rRNA
Várias subunidades
RNA pol II
Nucleoplasma
hnRNA (transcrito primário)
snRNA
Várias subunidades
RNA pol III
Nucleoplasma
rRNA 5S
tRNAs
Várias subunidades
RNA pol
Mitocondrial
Mitocondria
01 subunidade
RNA pol de
Cloroplastos
Cloroplasto
Similar as
bacterianas
Requerem proteínas auxiliares: Fatores de
Transcrição
Promotor
Região Codificadora
Sítio de PoliA
hnRNA
AAAAAAAAAA
mRNA
AAAAAAAAAA
Exon
Intron
DNA
RNA
Splicing
Estrutura de um gen eucarioto
EUCARIOTOS
GENES CONTEM EXONS E INTRONS
EUCARIOTOS
Etapas envolvidas na expressão	gênica
Transcrição
Processamento
Transporte
Tradução
Citoplasma
Núcleo
EUCARIOTOS - REGIÃO PROMOTORA
Upstram element = elemento a montante
Sítio de ligação de uma molécula ativadora ou silenciadora
EUCARIOTOS – FATORES DE INICIO DE
TRANSCRIÇÃO ALONGAMENTO
Modificação da extremidade 5´do precursor do mRNA eucariótico	Adição do 5´CAP
Sequencia sinal para
poliadenilação
POLIADENILAÇÃO:
Adição da cauda poli
(A) na	extremidade 3´do RNA transcrito:
~200 adeninas
EUCARIOTOS
REMOÇÃO DE INTRONS
(SPLICING)
SPLICING
Regulação da expressão
gênica
Como uma única célula fecundada pode originar um organismo complexo?
Diferenciação celular -produz tecidos especializados para determinadas tarefas
Expressão Gênica
Refere-se ao processo onde a informação codificada por um determinado gene é decodificado em proteína.
A biossíntese de proteínas insere-se no dogma central
da biologia
molecular
Sede da
informação
Processo comprovado
Processo não comprovado
Ácido desoxirribo- nuclêico
Ácido
ribonuclêico
Por que a Regulação da
Expressão Gênica?
Em Bactérias:
mudanças	no	ambiente	e	assim	o
Serve	para	que	as	células	se	ajustem	às
seu
crescimento e divisão sejam otimizados.
Em Organismos Multicelulares:
regular	um	programa
genético
Serve	para
para	o
desenvolvimento
embrionário	e	a
diferenciação.
A célula pode controlar as
proteínas
que ela faz das seguintes
formas:
Controlando como e quando um gene é transcrito.
“Dizendo” quando um RNA sofre splicing ou é
processado.
Indicando quais mRNA serão traduzidos.
Seletivamente, ativar ou inativar as proteínas após sua síntese.
DNA – igual para todas as células do mesmo indivíduo
No entanto, temos tipos especializados de células, que são bastante diferentes entre si
Além das diferentes células que temos, também existem diferentes situações
nas quais nossas células são modificadas em resposta a um estímulo
Ex. uso de medicamentos, alterações hormonais e doenças
Diferentes tipos celulares
EXEMPLOS DE DIFERENTES CÉLULAS
Célula epitelial
Célula	Neurônios muscular
Células do tecido conectivo
TRADUÇÃO
Processo	da	decodificação	do	código
genético de ácido nucléico para proteína.
O código genético é lido em trincas!
um	aa,
Um	trinca	um	códon,	um	códon,
porém um aa, vários códons.
O código genético é universal.
O código genético é redundante.
Propriedades do Código genético
Pode ser comparada as regras gramaticais
1 ) Unidade: Cada aminoácido é codificado por uma sequência de 3 bases
Tem ponto inicial: A leitura do mRNA sempre começa em um ponto determinado, o 5'AUG3' que liga a met em eucariontes e a formil-met em procariontes. AUG é complementar à unidade menor do ribossomo. AUG não é a primeira trinca existente na fita. Antes dela há uma sequência de bases (5'AGGAGGU 3') que é complementar ao rRNA da subunidade pequena do ribossomo (sequência de Shine-Dalgarno).
A met ou formil-met são muitas vezes removidas do polipeptídeo após a
tradução.
O código não é sobreposto: A inserção ou deleção de uma base na fita codante pode induzir um leitura diferente da inicial em cadeia
Não tem vírgulas: A leitura se dá a partir do ponto inicial sem interrupções
5) o código é degenerado: Mais de um códon codifica um minoácido.
Há "códigos sinônimos"
A degenerescência traz maior estabilidade contra mutações. Hipótese da oscilação de Crick (1966) para explicar a degenerescência (uma das bases do anticódon oscila quimicamente)), ou uma inosina pode parecer o anti-codon na posição 1 que é complementar à terceira base do codon.
6) O código não é ambíguo: em condições normais um código traduz apenas um e somente um aminoácido
7 ) É universal: Especificam da mesma maneira em todos os seres vivos
8) Tem ponto final: A leitura da fita de mRNA termina quando encontra algum dos códons de terminação (stop) que podem ser: 5' UAA 3'; 5' UAG3‘ ou 5' UGA 3', aos quais não se liga nenhum tRNA
+ aa.
CÓDIGO GENÉTICO
Códons de RNA
Diferenças na transcrição em eucariotos e procariotos
GAA	AAA	UCG	CCC	GGG	UAA
UAC	AAA
AUG	UUU
MET	PHE
RNA-m
anticódon
RNA - t
TRADUÇÃO
ligaçãopeptídica
2)Oribossomo expõedoiscódonsporvez,permitindoa entradade
dois RNA-t comanticódons
complementares
códons
13) OcroibroressaolimgoaçsãeolipgeapatíodiRcaNAenmtre os aminoácidos
AAA	UCG	CCC	GGG	UAA
UAC	AAA	CUU AUG	 UUU		GAA
Ribossomo anda um códon
RNA –t do primeiro códon é liberado sem o aminoácido
Um novo RNA –t, com anticódon complementar, se liga ao códon exposto pelo ribossomo
ligação peptídica
MET	PHE	GLU
TRADUÇÃO
UCG	CCC	GGG	UAA
AAA	CUU	UUU AUG	UUU		GAA		AAA
MET	PHE	GLU	LIS
TRADUÇÃO
CCC	GGG	UAA
CUU	UUU	AGC AUG	UUU	GAA		AAA		UCG
MET	PHE	GLU	LIS	SER
TRADUÇÃO
GGG	UAA
UUU	AGC	GGG AUG	UUU	GAA	AAA		UCG		CCC
MET	PHE	GLU	LIS	SER	PRO
TRADUÇÃO
AGC	GGG	CCC
AUG	UUU	GAA	AAA	UCG	CCC	GGG	UAA
MET	PHE	GLU	LIS	SER	PRO	GLY
TRADUÇÃO
MET	PHE	GLU	LIS
GGG	CCC
AUG	UUU	GAA	AAA	UCG	CCC	GGG	UAA
SER	PRO	GLY
códon de terminação
7) Quando o ribossomo expõe o códon de terminação, uma proteína citoplasmática se liga a ele, cessando a síntese protéica e liberando o polipeptídeo
PROTEÍNA
POLIPEPTÍDEO
TRADUÇÃO