Reações primarias

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Imunologia Oral – Aulas Práticas 
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 Métodos serológicos com base em reações secundárias: Ensaios Indiretos 
 
I. Imunoensaios com substâncias marcadas: 
 Algumas reações Ag/Ac não são detetáveis por precipitação ou aglutinação sendo 
necessária a medição indireta recorrendo-se a um reagente marcado. 
 Estas reações vão então ser referidas por ensaios recetor-ligando: 
o Recetor: liga-se à molécula alvo específica. 
o Ligando: é a substancia que vai ser medida sendo definido como a molécula a que 
se liga a outra molécula de uma configuração complementar, sendo esta 
geralmente a substancia que o teste esta a tentar detetar. 
 
 Neste tipo de reações, a formação do imunocomplexo é envidenciada pela marcação de 
um dos elementos (Ac ou Ag) 
 De acordo com o tipo de marcadores vamos ter vários tipos de reação: 
o Imunofluorescência: emissão de fluorescência. 
o Quimioluminescência: emissão de fotões de luz. 
o Imunoenzimática: o sinal resulta da ação das enzimas que constituem o marcador. 
o Imunoradioativa: radioisótopo. 
 
 Métodos serológicos com base em reações primárias: Ensaios Diretos 
 Métodos que através da marcação de ACs ou de AGs, permitem a sua visualização e/ou 
quantificação, permitindo a avaliação direta do AG ao AC 
 Os vários métodos deste tipo diferem no modo de deteção da ligação específica ao AG e 
ao AC. 
Imunoensaios Marcados 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
Heterogéneos Homogéneos 
Ag marcado 
em excesso 
 
Ag marcado 
em excesso 
Competitivo Não 
competitivo 
RIA, FIA, EIA, LIA 
IRMA, IFMA, 
IEMA, ILMA 
EMIT, CEDIA, 
FPIA, TR-FIA, 
DELFIA 
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 Imunoensaios Homogéneos: 
o Métodos rápidos em que a interação do AG com o AC modula a atividade do 
marcador. 
o Nenhum elemento está fixo a uma fase sólida e não existe etapa de separação. 
o Geralmente utilizado para a medição de pequenos analitos ( substância ou 
componente químico numa amostra, que é alvo de análise num ensaio), tais como 
drogas de abuso e fármacos. 
 Imunoensaios Heterogeneos: 
o Métodos em que um dos elementos do ensaio está fixo a uma fase sólida. 
o São mais vantajosos em relação aos homogéneos uma vez que são mais sensíveis e 
específicos. 
o A reação AG-AC não interfere com a atividade do elemento marcado. 
o É necessária uma etapa de separação das frações livres em relação às conjugadas. 
 Absorção, precipitação, ligação à fase sólida, eletroforese, filtração em meios 
gelosado, troca iónica. 
o Competitivos: 
 O analito não marcado (geralmente o AG) na amostra a testar é medido pela 
sua capacidade de competir com o AG marcado no imunoensaio. 
 Quanto maior a concentração de AG na amostra menor é a quantidade de 
marcador e, consequentemente, menor é o seu sinal (o sinal é inversamente 
proporcional à quantidade de AG na amostra) 
 Procedimento: Coloca-se soro com AG purificados marcados conhecidos na 
amostra, os AG da amostra iguais aos adicionados vão competir pela ligação 
aos AC. 
 Existem 2 versões da técnica de competição: 
 De uma etapa: 
 
 De duas etapas: 
 
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 Excesso de AG 
 Radioimunoensaio (RIA) é o protótipo mas existem outros: FIA, EIA e LIA 
o Não Competitivos: 
 A medição do analito marcado (geralmente o AC) é diretamente 
proporcional à quantidade de AG presente na amostra. 
 Podem ser utilizados métodos de uma ou duas etapas. 
 No formato de ensaio com duas etapas, existem passos de lavagem em que 
o complexo de ligação em sanduíche é isolado e são efetuadas lavagens 
para remover o excesso de reagente marcado não ligado. 
 Técnica de sandwich: mais sensível e específica 
 Normalmente utilizada para determinar analitos como os marcadores 
da hepatite e cardíacos. 
 
 
 Excesso de AC 
 ELISA é o protótipo 
 
 Imunoensaios marcados heterogéneos competitivos: 
o Método de união direta ao anticorpo. 
o É necessário um suporte: 
 Independentemente do tipo de deteção (radioatividade, enzimática ou 
fluorescência) os ensaios diretos podem ser feitos em: 
 Plástico (ex: microplaca de poliestireno) 
o Ex: RIA e ELISA 
 
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 Papel de nitrocelulose ou nylon após transferência do gel de 
eletroforese 
o Ex: Western-blot 
 Culturas celulares ou tecidos: 
o Ex: Imunohistoquímica ou Imunocitoquímica 
o Radioimunoensaio (RIA): 
 Desenvolvido por Yallow e Berson na década de 50 para detetar e quantificar 
a insulina no soro dos pacientes, utilizando proteínas marcadas 
radioactivamente. 
 É um método sensível para a análise quantitativa das reações AC-AG, 
permitindo medidas rápidas e precisas, mesmo em preparações não 
purificadas. 
 A deteção da interação AG-AC é feita através de radioisótopos como 125I, 51C 
ou 3H. 
 A interação AG-AC vai ser diretamente proporcional à quantidade de 
radioatividade emitida que é medida num contador de radiação γ. 
 Procedimento: 
 Uma mistura de AG marcado radioactivamente e ACs específicos 
para esses AG é preparada com um ligeiro excesso de AGs. 
 Quantidades conhecidas de AGs não marcados são adicionadas à 
mistura. 
 Os AGs não marcados competem pelos locais de ligação nos ACs, 
sendo que a quantidade comm que o AG se liga depende da 
concentração de AG marcado e da afinida do AC para o AG. 
 Ao aumentar as concentrações de AG não maracdo verifica-se, pela 
concentração de AG marcado, que este último é substituído nas 
moléculas de ACs. 
 Existem 3 sistemas básicos: 
 RIA indireto 
 RIA por competição: 
 RIA por captura 
 
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 Exames normalmente realizados com este método: 
 Hormonas Tiroideas (T3, T4, TSH, T4 Livre) 
 Tiroglobulina, anticorpos tiroideus 
 Prolactina 
 FSH, LH, Estradiol e Progesterona 
 Hormona do Crescimento 
 Antigénio Prostático especifico 
 Microalbuminuria 
 Aplicações Práticas: 
 Prevenção do cancro da próstata (dosagem PSA) 
 Diagnóstico precoce de patologias renais em diabéticos e hipertensos 
(dosagem de microalbuminuria) 
 Diagnostico e acompanhamento da menopausa (FSH, LH, Estradiol e 
Progesterona) 
 Prevenção e deteção de diabetes (dosagem de insulina) 
 Investigação de défica de crescimento em crianças (dosagem de 
somatotrofina?) 
 Desvantagens dos ensaios radioimunologicos: 
 Requerem laboratórios apropriados 
 Baixa seletividade 
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 Poucos ACs comercialmente disponíveis 
 Duração limitada da atividade dos radioisótopos 
 Problemas na eliminação dos resíduos 
 Certos graus de radioatividade cruzada com interferentes existentes na 
amostra, que podem originar falsos positivos 
 Custo do espectometro de cintiliação líquida. 
o Ensaios imunoenzimáticos (EIA): 
 Descritos independentemente pela primeira vez em 1971 
 Utilizados para detetar/quantificar AC e AG em fluidos biológicos, utilizando 
enzimas em vez de isótopos uma vez que são mais estáveis. 
 Marcadores enzimáticos: 
 Fosfatase alcalina (AP) 
o Catalisa a hidrolise não especifica de ésteres do ácido 
monofosfórico em fosfato inorgânico (reação em pH alcalino) 
o De uma solução incolor ou ligeiramente amarelada (p 
nitrofenilfosfato) passa a uma solução amarela (p-nitrofenol + 
fosfato) após a ação da enzima peroxidase na presença de 
MG2+. 
 Peroxidase (Horseradish peroxidase – HRP) 
o Catalisa a oxidaçãode substancias pelo peroxido de 
hidrogénio. 
o De uma solução amarela (tetrametil-benzidine) passa a uma 
solução azul, apos a ação da enzima peroxidase e do peroxido 
de hidrogénio (H2O2). 
o Substratos da HRP: 
 OPD 
 5AS 
 TMB 
 ABTS 
 DAB 
 Glucose-6-fosfato desidrogenase 
 Β- Galactosidase 
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 Sistemas de deteção: 
 Fotométricos 
 De fluorescência 
 De quimiluminescência 
 Vantagens: 
 Maior estabilidade dos reagentes 
 Maior especificidade 
 Produção de ensaios homogéneos 
 Ausência de perigo radioativo 
 A enzima funciona como marcador 
 Permitem a visualização em M.O comum (+barato) 
 Permitem a obtenção de uma preparação permanente 
 Fácil quantificação através do espectrofotómetro 
 Existem vários sistemas de EIA: 
(1) ELISA 
(2) ELISPOT 
(3) Immuno-blot 
(4) Western-blot 
(5) Imunoperoxidase 
 
(1) ELISA 
o Tecnica bioquímica que permite quantificar o AC ou AG na ordem das 
nanogramas (10-9g) 
 
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o Tipos de ELISA: 
 Quanto ao método de revelação do sinal: 
1. ELISA direto: 
a. Procedimento: 
i. Amostra com concentração desconhecida de AG 
é imobilizada num suporte sólido (microplaca 
revestida com a amostra) 
1. Amostra 1 com AG-A 
2. Amostra 2 com AG-B 
O Ag liga-se à superfície da microplaca que irá adsorver 
uma certa quantidade de qualquer proteína. 
*adsorção: adesão de moléculas de um fluido 
(o adsorvido) a uma superfície sólida (o adsorvente) 
ii. Adicona-se um AC especifico já ligado 
quimicamente a uma enzima. 
iii. Dá-se a ligação AC-AG (formação do 
imunocomplexo) 
iv. Lavagem com solução tampão para bloquear 
qualquer adsorção não especifica (ACs que não se 
conseguem ligar ou quaisquer outras proteínas são 
removidas) 
v. Adição de um substrato da enzima. 
vi. A ligação do AC especifico ao AG-A é detetada 
através da reação, catalisada pela enzima, de 
conversão do substrato num produto de outra cor, 
cuja absorvância será lida num aparelho (leitor de 
ELISA) 
b. Vantagens: 
i. Mais rápido (utilização de apenas 1 AC) 
ii. Eliminação de ratividade cruzada com AC 
secundário 
c. Desvantagens: 
i. A imunoreatividade do AC primário pode ser 
reduzida como resltado da marcação. 
ii. A marcação dos AC primários é demorada e cara 
iii. Menor amplificação do sinal. 
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2. ELISA indireto: 
a. Procediemento: 
i. AG adsorvido à fase sólida (placa revestida pela 
amostra) 
ii. Lavagem com tampão para remoção do AG não 
adsorvido 
iii. Adição da amostra (contendo ACs a serem 
medidos – Acs primários) e incubação. 
iv. Lavagem com tampão para remoção do AC que 
não se ligou 
v. Adição do AC secundário conjugado com uma 
enzima que vai reconhecer a porção constante do 
AC primário e incubação 
vi. Lavagem com tampão para remoção do AC 
secundario que não se ligou 
vii. Adição do substrato da enzima 
viii. Reação enzimática e alteração da cor da solução, 
a mudança de cor será proporcional à quantidade 
de AG. 
ix. Medição da densidade ótica 
 
 
 
 
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b. Vantagens: 
i. Existe uma vasta gama de AC secundários 
disponíveis comercialmente. 
ii. Versátil uma vez que pode usar-se o mesmo AC 
secundario marcado para deteção da ligação de 
vários AC primários. 
iii. Imunoreatividade do AC primário não é afetada 
pela marcação 
iv. A sensibilidade é aumentada porque cada tipo de 
AC primário contem vários apitopos que podem ser 
reconhecidos pelo AC secundario marcado, 
permitindo a amplificação do sinal 
c. Desvantagens: 
i. Reatividade cruzada pode ocorrer com o AC 
secundario, resultando num sinal não especifico 
ii. É necessário um passo extra de incubação 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
RESUMINDO: 
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 Quanto ao modo de atuação: 
1. ELISA Competitivo: 
- Quantidade desconhecida de AG é introduzida na amostra 
juntamente com AG de referência e ambos competem por um limitado 
número de locais de ligação ao nível dos ACs. 
- Neste tipo de ensaio, os efeitos observados são inversos dos 
esperados nos ensaios não competitivos. 
 - Procedimento: 
a. Adsorção de um AG à superfície sólida 
b. Adição do AG marcado com enzima + amostra do doente 
c. O AG marcado com a enzima compete com o AG contido 
na amostra do doente para a ligação ao AC imobilizado na 
placa. 
d. Se a amostra do doente tiver o AG especifico inibirá a 
ligação do AG marcado ao AC imobilizado. A cor do 
substrato modificar-se-à pouco ou nada. 
e. Se a amostra do doente não tiver o AG, o AG marcado com 
a enzima ligar-se-á aos ACs imobilizados na placa e, ao 
adicionar-se o substrato, verificar-se-á uma significativa 
alteração de cor. 
 
 
 
 
 
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2. ELISA Não Competitivo: 
- Os locais ligação para o Ac para o Ag estão em excesso, sendo por 
isso mais sensível que o ensaio competitivo. 
- Pode ser realizado com o Ac, Ag, ou epitopo fixado a uma fase solida. 
- É quantificado através de uma curva padrão, construída utilizando 
padrões de Ag (ou Ac) de concentração conhecida, o que permite determinar 
a concentração de Ag (ou Ac) nas amostras desconhecidas. 
EX: 
 
- Procedimento: 
a) Ag adsorvido à fase sólida. 
b) Adição da amostra do doente contendo ACs 
c) Incubação 
d) Adição do 2º Ac: Ac marcado com uma enzima que se 
vai ligar ao Ag do paciente. 
e) Caso a amostra do doente tenha o Ac especifico, este 
ligar-se-á ao Ac primário marcado que já se encontra 
ligado ao Ag. 
Dá-se a alteração significativa da cor da amostra, após 
a adição de substrato. 
f) Caso a amostra não possua o Ac específico não haverá 
ligação ao Ac primário e não será observada uma 
mudança de cor na amostra. 
 
 
 
 
 
 
 
o Como amplificar o sinal? 
RESUMINDO: Elisa Competitivo vs. Elisa não competitivo 
Competitivo Não Competitivo 
Quanto maior a 
concentração de 
moléculas a avaliar, menor 
a densidade ótica obtida. 
Quanto maior a 
concentração de 
moléculas a avaliar, maior a 
densidade ótica obtida. 
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 Utilização de biotina que se vai ligar à parte constante do AC e de avidina. 
 Quatro complexos avidina+enzima vão se ligar a uma biotina. 
 Assim haverá um maior número de enzimas ligadas ao anticorpo e 
consequentemente maior emissão de cor. 
 
o Método de captura ou sandwish: 
 Existe um pré-revestimento da microplaca com AC o que aumenta a 
retenção/adsorção de AG na placa. 
 
 
o Aplicações Práticas de ELISA: 
 Evidenciar contaminação por: 
1. HIV-1 e HIV-2; Hepatite C, HTLV-1 e HTLV-2. 
 Medição do nível de hormonas: 
1. HCG, LH, TSH, T3 e T4. 
2. Hormonas que podem ser utilizadas ilicitamente por atletas 
 Deteção de infeções por: 
1. Agentes sexualmente transmissíveis 
2. Toxoplasma gondii 
3. Rubéola 
 Deteção de substâncias alergénicas na comida e lixo das casas 
 Medição da fatores reumatoides e outros Ac em doenças autoimunes 
(feito em aula pratica) 
 Quantificação de toxinas em comida contaminada 
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 Deteção de drogas ilícitas: 
1. Cocaina2. Opiáceos 
3. Delta-9-tetrahidrocanabinol 
 Diagnóstico de coágulos sanguíneos, alergias, entre outras. 
 
o Leitura da densidade ótica (leitura de resultados obtidos): 
 Leitura da densidade da amostra na microplaca no leitor de microplaca 
 
 
(2) ELISPOT: 
o Variação do método ELISA que permite a deteção e quantificação do número 
de células de uma população produtoras de ACs específicos para um 
determinado AG ou um AG para o qual se tem um AC específico. 
o Procedimento: 
 Estimulação de células T com um Ag especifico (ex: produção de 
citoquinas) 
 Poços de ELISA, contendo ACs anti-X (X= Ag em teste) 
 Incubação 24h 
 Se as citoquinas X forem produzidas, são capturadas pelos AC anti-x 
 Adição de um AC conjugado anti-X, sendo revelado o local onde existe a 
citoquina X 
 Quantificação de pontos, que correspondem às células produtoras de 
citoquinas 
o Mais resumido: 
 Temos uma placa com ACs. 
 Adicionamos uma cultura de células pré-estimuladas 
 Caso haja produção de AG pela célula (ex: isoleucina) estes vão-se ligar 
aos AC. 
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 Verificar-se-á então a formação de pontinhos brancos no fundo da placa 
após a adição do AC conjugado que se liga ao AC inicial revelando o 
resultado. 
 
 
(3) Immunoblot: 
o Desenvolvido em 1982 por Hawkes 
o É uma variação do método ELISA em que as amostras são gotas e o resultado final 
será um produto corado solúvel. 
o Neste tipo de teste são utilizadas membranas de nitrocelulose em vez de 
microplacas. 
o É mais simples e rápido 
o É utilizado: 
 Na identificação de AG 
 Na confirmação de resultados positivos ou indeterminados obtidos nos 
testes serológicos imunoenzimaticos (EIA) e de Imunofluorescência (FIA). 
 Permite a caraterização de ACs monoclonais (MoAc) 
o Procedimento: 
 Adsorção de Ag à membrana 
 Adição de Ac da amostra 
 Lavagem do excesso de Ac 
 Adição da enzima 
 Lavagem do excesso de enzima 
 Adição do substrato 
 Certas zonas da membrana mudam de cor devido à ligação Ac-Ag 
 
 
Por ser um ensaio qualitativo são 
adicionadas pequenas quantidades 
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o Resultados obtidos: 
 
o Aplicações práticas: 
 Deteção de Herpes simples e genital: deteta-se a presença de ACs contra 
o HSV (vírus do herpes simplex) 
 
 
(4) Immunoblotting – Western Blot: 
o Blotting: transferência de DNA, RNA ou proteínas a partir de um gel de eletroforese 
para uma membrana 
o Método que envolve a imobilização de proteínas em membranas (Ex: 
nitrocelulose ou PVD – Fluoreto de polivinildeno) antes da sua deteção com ACs 
o Antes da imobilização das proteínas na membrana, as amostras são separadas 
por eletroforese em gel de poliacrilamida SDS (SDS-PAGE) 
o Aplicações práticas: 
 Detetar proteínas específicas numa amostra 
 Obter informações sobre o peso molecular da proteína e a existência das 
suas isoformas 
 Determinar as quantidades relativas da proteína presente em diferentes 
amostras 
 Determinar se um determinado soro contém ACs para um AG especifico. 
 
 
 
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o Etapas: 
 Separação eletroforética de AGs (proteínas)após solubilização das 
mesmas no detergente SDS 
 
 Transferência de proteínas para a membrana 
 
 Incubação da membrana com soro com o AC especifico da proteína em 
teste. 
1. Método direto: quando o AC já esta marcado 
2. Método indireto: adição de um AC secundário marcado 
A membrana é mergulhada numa solução de AC específico para a 
proteína desejada. 
Apenas a banda que contêm a proteína se liga ao AC, formando uma 
camada de moléculas de AC 
Após algum tempo procede-se à lavagem para remoção do excesso 
de AC que não foi ligado 
A membrana é incubada num 2ºAC que está ligado covalentemente 
a uma enzima, fluorocromo que se liga ao AC primário 
! Caso o AC primário já esteja ligado a um radioisótopo não é 
necessário AC 2º ! 
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 Incubação com substrato (apenas no método enzimático) 
 
 Revelação de resultados: 
1. Deteção enzimática: análise da densitometria ou 
espectrofotometria (oriundos da mudança de cor do substrato) 
para dosear os níveis de proteína. 
2. Deteção radioativa: colocam-se chapas de raio-x diretamente 
contra a membrana que, exposta à sonda (AC) cria regiões 
escuras as quais correspondem as bandas da proteína de interesse. 
3. Deteção Fluorescente: A sonda marcada fluorescentemente é 
excitada por luz e a emissão é então detetada por um fotossensor 
como uma câmara equipada com filtros 
 Aparece apenas a banda da proteína que queremos testar 
 
o Ensaios de imunofluorescência (FIA): 
 Técnica que permite a visualização de AGs nos tecidos ou em suspensões 
celulares do paciente usando corantes fluorescentes (fluorocromos) que 
absorvem a luz num determinado comprimento de onda e emitem-na noutro. 
 Quando o corante está ligado ou conjugado com um AC, os locais de reação 
entre o AG e o AC podem ser facilmente visualizados 
 Os fluorocromos depois de excitados por um comprimento de onda especifico 
(espetro de absorção) emitem fluorescência (fotões de luz) a um 
comprimento de onda superior (espectro de emissão) 
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 É muito importante a ampliação de sinal com biotina-avidina 
 A fluorescência depende do tipo de fluorocromo ligado ao AC. 
 Visualização: o uso combinado de filtros que impedem a luz para 
comprimentos de onda previamente determinados permitem visualizar as 
moléculas marcadas com os fluorocromos. 
 
 Tipos de imunofluorescência: 
 
 
 
 
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o Métodos Imunocitoquímicos (ICC): 
 Técnica que utiliza ACs marcados cujos alvos AGs são recetores nas 
membranas das células, em cultura de células e suspensões celulares. 
 Marcadores possíveis: 
 Enzima (método enzimático) -> visualização ao M.O 
o Ao contrário do ELISA, os produtos coloridos são insolúveis e 
precipitam no local onde são formados. 
 Corante fluorescente (método fluorescente) -> visualização ao m. de 
fluorescência 
 Elemento radioativo (radio-imunoensaio) -> visualização por auto-
radiografia. 
 A marcação pode ser direta ou indireta 
 Existe a possibilidade de múltiplas marcações, podendo visualizar-se 
simultaneamente diferentes estruturas da célula 
 
Dupla Marcação: 
 
 Procedimento: 
 Preservação do tecido: por fixação ou congelamento em azoto 
líquido. 
o Fixação: o fixador ideal deve preservar a morfologia, a 
imunorreactividade, prevenir a extração, difusão e 
deslocamento do AG durante as etapas que se seguem à 
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fixação e não interferir com as reações subsequentes na 
localização do AG. 
 Fixadores + utilizados: 
 Soluções aldeídicas 
 Soluções alcoólicas 
o Parafinização: inclusão do tecido em parafina 
 Recuperação Antigénica: por quebra de ligações múltiplas entre 
proteínas promovidas pela fixação. Se não forem eliminadas, estas 
ligações bloqueiam o acesso dos ACs 
o Métodos Enzimáticos 
o Aplicação de calor 
 Marcação: 
o Método imunoenzimático – peroxidase/fosfatase alcalina 
o Método imunofluorescente – FITC, rodamina, Texas red 
o Outro 
 Método Direto: um AC marcado reage diretamente 
com um AG nas secções de tecido. Procedimento 
rápido mas insensível devido à baixa amplificação de 
sinal. 
 Método Indireto: Envolve um Ac primário não marcadoque reage diretamente com o Ag no tecido e um AC 
secundario marcado reage como o Ac primário. 
Método mais sensível devido à amplificação de sinal 
gerada pela sligações entre o AC secundário e os 
diferentes tipos de epitopos do Ac primário. 
 Visualização ao microscópio: 
 
 Aplicações práticas: 
 Análises celulares e subcelulares 
 Estudo de localização e interação entre proteínas, etc. 
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